SIRT1过表达慢病毒稳转细胞系的构建及其对脂肪合成的影响

目的：通过油红O及BODIPY染色选取脂肪代谢理想的细胞模型,并运用高内涵仪器检测SIRT1高表达细胞系中脂肪的变化。方法：在L-02、HepG2、Huh7细胞中进行油红O和BODIPY染色,观察在不同油酸浓度下脂滴的生成情况;将构建成功的SIRT1过表达慢病毒载体GV166．SIRT1及空载体病毒GV166．Control感染L．02细胞,qPCR及Western．Blot检测感染细胞中SIRT1的表达水平;高内涵系统检测L-02SIRT1和L-02control细胞系产生的脂滴荧光强度,以确定油酸诱导的最佳浓度及最佳刺激时间。结果：通过油红O及BODIPY染色发现L-02细胞更适宜作为脂肪代谢的细胞模型;成功构建SIRT1过表达慢病毒载体GV166-SIRT1及空载体病毒GV166．Control,qPCR及Western．Blot检测显示转染病毒后SIRT1在细胞中的表达水平明显升高;在油酸刺激浓度0．4mM、诱导时间12h时,L-02SIRT1细胞中脂滴的荧光强度明显较L．02control为低。且这种差异达到最大化。结论：成功建立SIRT1过表达稳定转染细胞系,并证明高表达SIRT1能够抑制脂肪合成。     

RNA特异腺苷脱氨酶1(p150亚型)抑制肝细胞脂质合成

目的:在油酸诱导的肝细胞脂肪变模型中,检测RNA特异腺苷脱氨酶1 p150亚型(ADAR1-p150)高表达细胞系中脂肪合成的变化。方法:利用本课题组前期摸索的油酸刺激人胚胎肝细胞L-02细胞系脂肪变的条件,q RT-PCR和Western-Blot检测油酸刺激组和对照组ADAR1-p150表达变化;将构建成功的ADAR1-p150过表达慢病毒载体GV166-ADAR1-p150及空载体病毒GV166-control感染L-02细胞,检测感染细胞中ADAR1-p150的m RNA和蛋白表达水平;通过油红O染色和BODIPY染色观察L-02 ADAR1-p150和L-02 control细胞中脂滴形成,并进一步利用高内涵系统检测其荧光强度,对脂滴合成作定量分析。结果:L-02细胞在油酸刺激后ADAR1-p150的m RNA和蛋白水平降低;成功构建ADAR1-p150过表达慢病毒载体GV166-ADAR1-p150及空载体病毒GV166-control,q RT-PCR及Western-Blot检测显示病毒转染GV166-ADAR1-p150后ADAR1-p150在细胞中的表达水平显著升高;油红O染色和BODIPY染色发现L-02 ADAR1-p150较L-02 control细胞胞质中脂滴数量减少。高内涵筛选系统检测提示L-02 ADAR1-p150组中脂滴的荧光强度明显较L-02 control组低。结论:成功构建ADAR1-p150过表达稳定转染L-02细胞系,并证实高表达ADAR1-p150能够抑制脂肪合成。     

SIRT6 对肝细胞脂质合成的影响及其转录基因分析

目的:在肝脏L-02 SIRT6-KO细胞系中,观察SIRT6在肝脏脂滴形成中的作用,初步研究在肝脏脂质代谢中SIRT6相关的转录差异基因发挥作用的分子机制。方法:利用基因敲除技术TALEN技术,构建肝脏L-02 SIRT6特异性敲除细胞系,并经q PCR和Western blot检测其表达水平;利用油酸刺激L-02 SIRT6-KO细胞及其对照组,体外模拟肝脏脂肪变的条件,并经高内涵和油红染色验证其脂滴形成能力;利用基因芯片检测L-02 SIRT6-KO及其对照细胞系中相关差异基因,并经生物信息学分析筛选脂代谢相关差异基因。结果:建立人肝脏SIRT6特异性敲除细胞系,q PCR显示m RNA下降50%,但Western blot证明SIRT6完全敲除;BODIPY实验及油红O染色发现,L-02 SIRT6-KO细胞比对照组其脂滴形成数量增多,高内涵荧光检测显示L-02 SIRT6-KO细胞中脂滴荧光强度比对照组增强(176.38±2.55 vs 104.26±2.08);通过对差异转录基因分析,发现了一组在脂质代谢中和SIRT6相关的关键基因如STEAP4、HMGA2、PDE1A、INSL4等。结论:成功建立人肝脏L-02 SIRT6-KO细胞系,并经实验证明SIRT6缺失能够促进脂滴形成;筛选到一组和SIRT6相关参与脂质代谢的关键基因。     

油红O染色鉴定胰腺星状细胞

目的胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSCs)是一类胞浆内含有Vitamin A脂滴的特殊类型的细胞。油红O能够使脂肪组织及细胞内的脂滴着色。本研究的目的是采用油红O染色的方法对分离培养的PSCs进行鉴定。方法采用Histodenz密度梯度离心分离提取PSCs。异丙醇配制油红O染液,培养的PSCs应用油红O染液染色。结果油红O染色后可清晰显示PSCs内的脂滴。结论油红O染色可以特异性地显示脂滴,是鉴别PSCs的有效方法。     

脂多糖通过mTOR途径抑制肝细胞脂质自噬

本研究旨在探讨脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对肝细胞脂质自噬的影响及其机制。体外培养人肝癌细胞株HepG2,用0.1 mmol/L软脂酸(palmitic acid, PA)负荷,分为对照(0μg/mL LPS)组、LPS (10μg/mL)组、LPS+DMSO组、LPS+雷帕霉素(rapamycin, RAPA, 10μmol/L)组。油红O染色观察HepG2细胞内脂质积聚情况;自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染细胞后激光共聚焦显微镜观察细胞自噬流;通过氟硼二吡咯BODIPY 493/503荧光染料和溶酶体标记物溶酶体关联膜蛋白1 (lysosomal associated membrane protein 1, LAMP1)进行脂滴和溶酶体的共定位,反映细胞内脂质自噬水平;Western blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、p-mTOR、核糖体S6激酶1 (ribosome protein subunit 6 kinase 1,S6K1)、p-S6K1、LC3II/I、P62蛋白表达。结果显示,与对照组相比,LPS组细胞油红O染色红染脂滴增加,自噬体增加,自噬溶酶体明显降低,LAMP1/BODIPY共定位率降低(P 0.05),p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1和LC3II/LC3I比值升高,P62蛋白表达增加(P 0.05)。加入RAPA干预后,与LPS+DMSO组相比,自噬体减少,自噬溶酶体明显增加,LAMP1/BODIPY共定位率升高(P 0.05),肝细胞油红O染色红染脂滴减少(P 0.001)。综上,LPS通过激活mTOR通路抑制HepG2细胞脂质自噬,从而加重细胞内脂质积聚。     

大鼠脂肪基质细胞成脂分化及慢病毒感染的实验研究

目的诱导大鼠脂肪基质细胞成脂分化,观察慢病毒感染效果。方法大鼠脂肪基质细胞培养至第3代后,间接免疫荧光法鉴定细胞表面抗原CD44,并采用MTT法绘制生长曲线;第3代基质细胞成脂诱导分化为脂肪细胞,油红O染色法鉴定,并行慢病毒感染。结果第3代脂肪基质细胞表面抗原CD44表达呈阳性;细胞生长曲线呈"S"形。细胞经成脂诱导分化剂诱导10d后,胞内有大量脂滴形成,脂滴大小不等。油红O染色显示脂滴被染成红色;携带GFP报告基因的慢病毒可感染成熟脂肪细胞,感染率约为80%,且细胞被感染后状态良好。结果 慢病毒可高效感染由大鼠脂肪基质细胞成脂诱导分化成的脂肪细胞,为研究脂肪细胞的基因功能、相关疾病的基因治疗提供了一个有效工具。     

高脂喂养大鼠肾小管上皮细胞SREBP-1、TGF-β1、α-SMA的表达和细胞外基质沉积

目的:探讨高脂喂养对大鼠肾脏小管上皮细胞SREBP-1、TGF-β1、α-SMA表达和细胞外基质(ECM)的影响。方法:高脂饲料喂养大鼠12周后,油红O检测肾脏脂质沉积,Masson染色检测肾小管间质细胞外基质沉积,免疫组化、Western blot和原位杂交检测SREBP-1、TGF-β1、α-SMA和FN的表达。结果:高脂喂养后大鼠体重明显增加,血糖、甘油三酯和胰岛素均升高,油红O检测显示大鼠肾小管上皮细胞内出现明显脂滴。SREBP-1蛋白和mRNA在肾小管上皮细胞内表达,高脂组高于正常对照组,分别是正常组的1.88倍和1.85倍;TGF-β1和α-SMA也定位于肾小管上皮细胞胞浆并出现上调。Masson染色显示高脂喂养大鼠肾间质ECM沉积增多,纤维粘连蛋白FN检测也显示模型组表达强于对照组。结论:高脂饮食喂养可能通过上调肾脏小管上皮细胞SREBP-1表达使细胞内脂滴沉积,并进一步诱导TGF-β1、α-SMA合成而导致细胞外基质堆积。     

Leptin过表达对猪前脂肪细胞脂滴形成的研究

研究Leptin过表达对猪前脂肪细胞脂滴形成的影响,旨为进一步研究Leptin与脂质代谢相关的分子机制奠定理论基础。选取Leptin过表达与野生型猪皮下脂肪组织,在无菌条件下分离前脂肪细胞进行传代培养并诱导分化形成脂滴,通过油红O和Bodipy染色后观察脂滴面积并分析脂质的含量,利用Q-PCR检测脂滴形成相关基因mRNA的表达水平。诱导4 d后可分化形成脂滴,油红O和Bodipy染色的结果显示,Leptin过表达猪前脂肪细胞脂滴数量和甘油三酯含量显著低于野生型(P0.05);且脂质合成相关基因PPARγ、SCAP、SREPB1和PLIN2的表达水平显著低于野生型(P0.01)。结果表明,过表达Leptin可促使猪前脂肪细胞中PPARγ、SREPB1、SCAP、PLIN2基因的表达下调,进而抑制脂滴形成。     

两种脂肪细胞内脂滴染色方法的比较研究

目的比较油红O染色法和尼罗红染色法对脂肪细胞内脂滴染色的优劣,探讨科研工作中更优的脂滴染色方法。方法采用经典的"鸡尾酒"法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化;诱导分化8d后,对细胞内脂滴进行油红O染色和尼罗红染色,观察脂滴形态并测定甘油三酯含量。结果两种染色方法中甘油三酯的测定结果一致。但油红O染色过程较为繁琐、耗时较长,染料不易清洗干净,导致染料残留,从而引入实验误差,影响测定结果;而尼罗红荧光染色操作简单、耗时短以及背景更洁净。结论尼罗红荧光染色法应用于脂肪细胞内脂滴的鉴定和定量测定更加简单、便捷。     

Fsp27基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究

构建脂肪特异性蛋白27(Fat-specific protein of 27,Fsp27)基因沉默载体,研究沉默Fsp27基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响,并对其作用机制进行探究。采用RNAi技术,构建Fsp27基因真核干扰载体,下调Fsp27基因的表达。“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。脂质体转染脂肪细胞,油红O染色脂滴,酶法测定细胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表达。Western blot结果显示:阳性sh-Fsp27干扰载体均能有效下调Fsp27的表达,且伴随细胞内ATGL和PPARγ的表达量升高(P<0.05),其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶学方法检测结果显示:阳性sh-Fsp27干扰组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P<0.05);油红O染色结果发现:空白对照组与阴性对照组均有大脂滴堆积,阳性sh-Fsp27组小脂滴分布广泛,未见明显的大脂滴。sh-Fsp27-2组基因沉默载体的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1细胞的脂解速率,其主要是通过抑制脂滴融合和增强ATGL酶的水解来完成对脂解的调控。     

miR-155对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的作用及机制研究

目的:探讨mi R-155对人椎间盘退变髓核细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:首先构建慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,然后感染椎间盘退变髓核细胞得到稳定过表达细胞系,同时设置空载体和空白细胞组对照。用荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白GFP的表达,分别提取三组细胞总RNA,采用RT-q PCR方法检测mi R-155的表达;通过流式细胞术检测细胞凋亡,Western-Blot检测细胞中凋亡相关蛋白FADD、Caspase-3、Bcl-2及Bax的表达,JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化情况。结果:在荧光显微镜下,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白细胞组未见绿色荧光;RT-qPCR结果显示构建的稳定过表达细胞系(GV369-miR-155-NP)中mi R-155的表达水平较高,且与空载体细胞系及空白细胞对照组均呈显著性差异(P0.05);与空载体组(GV369-NP)及空白细胞对照组相比,过表达组(GV369-miR-155-NP)细胞凋亡率显著降低(P0.05),FADD、Caspase-3、Bax的表达水平均明显下降,而Bcl-2表达水平显著增加(P0.05)。结论:mi R-155可能通过靶向结合Caspase-3和FADD阻止FasL-Fas途径或通过线粒体途径抑制人椎间盘退变髓核细胞凋亡。     

血管细胞黏附分子-1对卵巢癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨过表达血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)对卵巢癌细胞凋亡的影响。方法:构建过表达VCAM-1的慢病毒载体GV358-VCAM1+,转染人类卵巢癌IGROV1细胞株,利用嘌呤霉素筛选稳定表达VCAM-1的IGROV1细胞,通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,确定细胞转染效率,Western blot及RT-PCR法确定卵巢癌细胞VCAM-1蛋白和m RNA水平;采用流式细胞仪检测过表达VCAM-1的IGROV1的细胞凋亡变化,western blot法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3)以及STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的变化。结果:成功构建的慢病毒载体GV358-VCAM1+在IGROV1细胞中的转染效率达到85%以上,转染细胞的VCAM-1蛋白及m RNA水平均呈稳定表达;VCAM-1过表达卵巢癌细胞的细胞凋亡显著高于空载体对照组(P=0.0149);Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3表达水平均较对照组显著升高(P0.01),Bcl-2、p-STAT3表达水平明显低于对照组(P0.01),但STAT3表达水平无显著改变。结论:VCAM-1可能通过下调STAT3的磷酸化水平诱导卵巢癌细胞凋亡。     

时钟基因Bmal1促进血管平滑肌细胞增殖

摘要 目的：观察时钟基因Bmal1的过表达对血管平滑肌细胞增殖的影响,进一步探讨生物节律对于血管发育的具体影响。方法：采用包装GV341-Bmal1载体的慢病毒转染的方法构建大鼠胸主动脉平滑肌细胞（A7R5）稳定转染Bmal1的细胞系,实时定量PCR和细胞爬片Bmal1的免疫荧光染色的方法判断所构建细胞系是否稳定过表达Bmal1,细胞爬片Ki67的免疫荧光染色的方法观察时钟基因Bmal1的过表达对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果：实时定量PCR结果显示稳定转染Bmal1组细胞Bmal1的表达是对照组的11.2倍（P<0.01）;细胞爬片的免疫荧光染色结果显示稳定转染Bmal1组细胞BMAL1的表达明显升高（P<0.05）,且稳定转染Bmal1组Ki67阳性细胞比例明显升高（P<0.05）。结论：通过慢病毒转染的方法成功构建了血管平滑肌细胞稳定转染Bmal1的细胞系,细胞片Ki67的免疫荧光染色结果显示Bmal1的过表达促进了血管平滑肌细胞的增殖。     

用慢病毒转染RNAi技术沉默胆固醇7α羟化酶的基因表达，降低肝细胞中胆汁酸的分泌

为了降低生物人工肝(bioartificial liver system)中肝细胞胆汁酸的分泌,构建了胆固醇7α羟化酶慢病毒RNA干涉载体,并转染人肝脏细胞(L-02).根据绿色荧光蛋白的表达评估转染效率后进行流式分选,获得高表达慢病毒干涉载体的细胞,并以野生型L-02细胞和仅转染pSicoR空载体的L-02细胞作对照,观察肝细胞胆固醇7α羟化酶的表达以及培养上清中总胆汁酸含量.利用半定量PCR、实时荧光定量PCR及Western-blot等实验方法检测了转染细胞中基因的干涉效果,结果显示:与对照组相比,在mRNA水平,转染慢病毒siRNA载体的L-02细胞,其胆固醇7α羟化酶基因的表达量仅为野生型L-02细胞表达量的31.2%,为转染pSicoR空载体的L-02细胞的34.1%,干涉效率分别为68.8%和65.9%,均具有显著差异(P＜0.05);Western-blot结果显示胆固醇7α羟化酶在蛋白质水平表达也明显受到抑制,表明转染慢病毒siRNA下调了肝细胞中胆固醇7α羟化酶基因的表达,减少了胆汁酸的分泌.以上研究结果表明,利用RNAi技术可以获得低表达胆固醇7α羟化酶基因的肝细胞,并有效降低肝细胞中胆汁酸的分泌,为临床上生物人工肝的构建及应用奠定基础.     

缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探究缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其分子机制。方法:将编码过表达野生型SIRT1以及核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)的慢病毒载体转染人类结肠癌HCT116细胞株,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达野生型SIRT1细胞株(LV-SIRT1细胞)和细胞质定位的NLS突变型SIRT1细胞株(LV-SIRT1NLSmt细胞),通过观察慢病毒载体编码的SIRT1-GFP融合蛋白的荧光定位,明确稳定转染细胞中外源性SIRT1的亚细胞定位。利用real-time PCR、Western blot法对分离提取的核-质蛋白进行检测,证实外源性SIRT1的表达和亚细胞定位情况。利用CCK-8细胞毒性实验、流式细胞术检测和TUNEL染色比较缺氧(1%O2)处理前后LV-SIRT1和LV-SIRT1NLSmt细胞存活或凋亡情况,Western blot法检测凋亡相关蛋白p53、ac-p53(K382)、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved caspase-3表达水平。结果:Western blot、real-time PCR和免疫荧光染色结果显示稳定转染细胞均存在外源性SIRT1的过表达,NLS突变可导致SIRT1NLSmt富集于细胞质中;与亲本细胞HCT116和LV-SIRT1NLSmt细胞相比,LV-SIRT1细胞对缺氧的耐受能力最差、细胞凋亡水平最高,凋亡相关蛋白p53、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3表达水平显著升高,ac-p53(K382)和Bcl-2表达水平显著下降,且LV-SIRT1细胞的胞核ac-p53下降最为显著。结论:在缺氧微环境中,细胞核定位的SIRT1通过影响p53的去乙酰化水平促进结直肠癌细胞凋亡。     

miR-217慢病毒表达载体及稳转胶质瘤细胞系的构建

目的:构建mi R-217慢病毒表达载体并建立稳定表达mi R-217的胶质瘤细胞系,为深入研究mi R-217在胶质瘤细胞生长及功能中的作用及机制提供条件。方法:利用人基因组中mi R-217前体序列,设计并合成引物。采用PCR的方法扩增含mi R-217前体的目的片段,酶切后连接至慢病毒表达载体p LVX-EGFP-Puro。将带有mi R-217前体的慢病毒载体及辅助质粒用脂质体的方法转染293细胞,24小时后收集上清液测定病毒滴度。利用实时定量PCR检测mi R-217的表达水平,确定慢病毒载体的表达能力。将病毒感染胶质瘤细胞系U251,通过荧光观察和嘌呤霉素(Puromycin)筛选,获得稳定转染mi R-217的胶质瘤细胞系。结果:克隆的mi R-217前体目的片段经PCR检测和测序分析,序列完全正确、无突变。实时定量PCR检测发现慢病毒感染293T细胞后,mi R-217的表达水平明显升高(P0.01),表明mi R-217慢病毒表达载体构建成功。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜观察发现细胞均有稳定的绿色荧光表达,并且mi R-217的表达水平显著升高(P0.01),是对照组的12.5倍。结论:成功构建了mi R-127慢病毒表达载体和稳转胶质瘤细胞系,为后续研究奠定了良好基础。     

Effects of homocysteine and its related compounds on oxygen consumption of the rat heart tissue homogenate: the role of different gasotransmitters

Accumulating evidence indicates that microRNAs are implicated in tumor initiation and progression through negatively regulating oncogenes or tumor suppressor genes. In the present study, we report that the expression of miR-200a was significantly lower in renal cell carcinoma (RCC) specimens and RCC cell lines. Restoration of miR-200a suppressed cell growth, arrested cell cycle progression, and promoted cell apoptosis in RCC cell lines. We next used qRT-PCR array technology to identify Sirtuin 1 (SIRT1) as one of the downregulated proteins during miR-200a overexpression in 786-O cells. Following a further assay by luciferase reporter system, SIRT1 was validated as a direct target of miR-200a. Moreover, siRNA-mediated knockdown of SIRT1 could partially phenocopy the effects of miR-200a overexpression. In contrast, overexpression of truncated SIRT1 (without an endogenous 3′-UTR) could rescue the effect of miR-200a overexpression on 786-O cells, which suggested that SIRT1 3′-UTR is targeted by miR-200a specifically. These observations provide further evidence for a critical tumor-suppressive role of the miR-200a in RCC in addition to identifying a novel regulatory mechanism, which may contribute to SIRT1 upregulation in RCC.