耐辐射动球菌耐辐射及相关特性研究进展

核能的利用对于缓解能源紧张、减少温室气体排放具有重要意义,然而核能利用产生的放射性废料对环境的影响成为核能发展的掣肘。耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)是一种从核污染环境中分离出来的,可在辐射、强碱、高盐、干旱、高金属离子浓度、高渗透压及强化学毒性等严酷环境中存活的革兰氏阳性耐辐射菌,有望应用于环境生物修复、医学等领域。本文就K.radiotolerans的生理生化特性、抗辐射性、抗氧化性、抗毒性有机物等特性的研究现状进行综述。     

耐辐射奇球菌recA基因的克隆、表达及其对recA缺损大肠杆菌辐射抗性的影响

将耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）的recA基因克隆到表达质粒pET15b中,并在Escherichia coli HMS(DE3)中高效表达了可溶性的RecA重组蛋白。同时将recA基因通过穿梭质粒pRADZ3导入recA缺损E. coli TG2细胞中,Western印迹实验显示RecA蛋白能够在不需要诱导剂IPTG的条件下稳定表达。辐射抗性实验表明,D. radiodurans的recA基因在E. coli细胞中的表达能够完全补偿recA缺损E. coli辐射抗性能力。     

耐辐射奇球菌pprM基因增强大肠杆菌氧化抗性的研究

目的:探讨耐辐射奇球菌ppr M基因对大肠杆菌氧化抗性的影响。方法:氯化钙法转化分别构建含pGEX-6p-1-pprM质粒的大肠杆菌DH5α。测定不同浓度过氧化氢对含pGEX-6p-1-pprM、pGEX-6p-1和野生型大肠杆菌DH5α活性的影响以及菌体内SOD/GSH/CAT水平的变化。结果:与空质粒组和野生型组相比,含pprM的大肠杆菌在同浓度过氧化性情况下,其抑菌圈明显缩小,差异有统计学意义。与空质粒组和野生型组相比,含pprM的大肠杆菌体内CAT活力、SOD活性明显提高,但GSH量并没有明显提高。结论:pprM基因能够提高大肠杆菌抗氧化能力,其机制可能与pprM基因增强细菌体内抗氧化酶的活性有关。     

耐辐射奇球菌recA基因的克隆、表达及其对recA缺损大肠杆菌辐射抗性的影响

将耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)recA基因克隆到表达质粒pET15b中,并在Escherichia coli HMS中高效表达了可溶性的RecA重组蛋白。同时将recA基因通过穿梭质粒pRADZ3导入recA缺损E.coli TG2细胞中,Western印迹实验显示RecA蛋白能够在不需要诱导剂IPTG的条件下稳定表达。辐射抗性实验表明,D.radiodurans的recA基因在E.coli细胞中的表达能够完全补偿recA缺损E.coli辐射抗性能力。     

促DNA修复多效蛋白诱导因子pprI逆转录病毒载体系统的构建及其鉴定

目的:为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的稳定遗传与表达,构建重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI。方法:将目的基因pprI亚克隆经过双酶切后定向连接到pLXIN质粒上,构建逆转录病毒重组质粒pLXIN-pprI。将pLXIN-pprI转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,氨苄青霉素筛选后抽提获得重组质粒pLXIN-pprI,双酶切及DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及测序结果显示结果与预期相符,pprI基因成功插入pLXIN逆转录病毒载体中。结论:重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI构建成功,为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的重组与表达奠定了基础。     

耐辐射异常球菌DNA损伤与修复相关基因的比较基因组研究

耐辐射球菌 (Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ,ＤＲ)是Ａｎｄｅｒｓｏｎ等[1] 在 1 95 6年从灭菌处理的肉类中发现的一种非病原性红色球菌 ,该球菌对电离辐射 (存活最高剂量约 1 5ｋＧｙ,即普通真核生物的 1 0 0 0倍 )、紫外线、干燥、强氧化剂和一些化学诱变剂显示惊人的抗性[2～5] 。实验证实 ,由辐射引起的损伤ＤＮＡ在几十小时内能够完全修复[4 ,5] 。这种超强ＤＮＡ修复能力吸引人们去研究其潜在修复机制以及寻找与修复有关的特殊基因或酶 ,以便能应用基因工程的技术对放射性、重金属污染物进行生物修复 ,为癌症治疗尤其…     

类胡萝卜素在耐辐射奇球菌辐射抗性中的作用

为研究耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)中类胡萝卜素的生化合成基因及其在该细菌抗辐射机制中的生物学作用,通过有机溶剂提取及LC-MS技术分析了D. radiodurans所产类胡萝卜素物质的主要组分,运用PCR及基因同源重组技术,对该菌中类胡萝卜素生化合成途径的八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,crtB)及八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,crtI)基因进行了缺失突变,通过表型观察及HPLC定量分析突变株所产类胡萝卜素的组分变化确证突变株构建成功．野生株及crtB 与crtI基因缺失突变株对电离辐射和H₂O₂的敏感性差异比较分析显示,和野生株相比,两种突变株对不同剂量电离辐射和不同浓度H₂O₂的敏感性更强．crtB及crtI基因功能研究表明,这两个关键性合成基因的缺失,导致突变株不能催化合成类胡萝卜素生化合成途径中的重要中间体——番茄红素及一系列下游产物．通过λ原噬菌体紫外线诱导系统、电子自旋共振 (ESR)及DMPO自旋捕集技术,分别在体内和体外评价了其类胡萝卜素的抗氧化能力．结果表明,两种类胡萝卜素对超氧阴离子(O₂^·)及羟自由基(·OH)均表现出较强的清除作用．上述研究结果为探究D. radiodurans的类胡萝卜素合成基因和生物学功能,及类胡萝卜素在D. radiodurans抗辐射机制中的作用提供了新的直接实验证据．     

辐射过程中耐辐射奇球菌蛋白酶变化的检测与分析

采用明胶和酪蛋白底物酶谱法以及荧光酪蛋白底物对紫外线以及γ射线辐射后恢复期耐辐射奇球菌R1(Deinococcus radiodurans R1,DRR1)的蛋白酶变化进行了检测。结果发现,DRR1存在高活性大分子量组成性表达蛋白酶,与Karlin等［16］提出的DRR1蛋白酶为预测高表达蛋白(PHX)的设想一致。DRR1包含大量分子量大于140kD 的明胶降解酶和分子量大于120kD的酪蛋白降解酶,其中活性最高的174kD明胶酶在经SDS变性处理后仍有较高活性,该蛋白酶在DRR1受紫外线辐射和电离辐射后恢复期的表达模式存在差异,在γ射线电离辐射过程中以及电离辐射后恢复的晚期活性较高。此外,还发现一些蛋白酶特异性由辐射所诱导,表明这些蛋白酶可能参与细胞信号通路中蛋白的顺序降解,也提示DRR1损伤修复过程中细胞内存在一个精确的蛋白酶系统。这些蛋白酶的表达与细胞的营养状态相关。同时对一株由本实验室从北京地区土壤中分离到的杆状耐辐射菌RR533.2的明胶和酪蛋白蛋白酶谱进行了测定,结果发现其蛋白酶谱与DRR1相类似。     

耐辐射奇球菌代谢产物中的化学成分

通过甲醇提取、硅胶柱色谱、重结晶分离纯化,从耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)代谢产物中分离得到五个化合物,根据光谱数据鉴定为:腺嘌呤(1),胸腺嘧啶(2),尿嘧啶(3),腺苷(4)和L-丙氨酸(5)。所有成分均为首次从该细菌的代谢产物中得到。     

耐辐射球菌recQ双突变株的构建及逆境分析

RecQ解螺旋酶是生物有机体在进化中高度保守的SF1超级家族解螺旋酶的一个亚族,它对维持基因组的稳定性有重要的作用。耐辐射球菌野生型菌株R1有两个具有特殊结构的解螺旋酶DR1289和DR2444,运用PCR突变法克隆具有自身groEL启动子、KAT启动子与卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因融合的DNA片段反向重组到基因组中,首次构建并鉴定了卡那霉素抗性完全突变株ΔDR1289,氯霉素抗性完全突变株ΔDR2444,双突变株ΔrecQ。辐射条件下和H2O2氧化压力下突变株生存率结果表明:ΔDR2444与R1存活率趋势线基本一致,而ΔDR1289和ΔrecQ双突变株较为敏感。根据上述结果推测,DR1289是一个对R1保持极端抗性的必须基因,而DR2444则是极端抗性的非必须基因。     

D.radiodurans CatB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过生物信息学方法从耐辐射奇球菌（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）全基因组居库中查鼠并克隆了编码过氧化氢酶（Ｃａｒｔａｌａｓｅ,Ｃａｔ）的１６１１ｂｐ长ＣａｔＢ基因,将ＣａｔＢ基因连人ｐＫＫ２２３－３表达载体,转化Ｃａｔ酶链陷型大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＭ２）。转化菌裂解液ＰＡＧＥ酶活性染色分析实物具有Ｃａｔ酶活性,电泳过移位置与ＣａｔＢ位置相符。Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＣａｔＢ基因的表达可使Ｅ．     

Expression of Deinococcus radiodurans PprI enhances the radioresistance of Escherichia coli

PprI, a newly identified gene switch responsible for extreme radioresistance of Deinococcus radiodurans, plays a central regulatory role in multiple DNA damage repair and protection pathways in response to radiation stress [Biochem. Biophy. Res. Commun. 306 (2003) 354]. To evaluate whether PprI also functions in the radioresistance in other organisms, D. radiodurans PprI protein (Deira-PprI) was expressed in Escherichia coli. The complemented E. coli strain showed an increase of approximately 1.6-fold radioresistance with a high dose of gamma irradiation. Immunoblotting assays showed that the expression of Deira-PprI in E. coli resulted in a significant increase in RecA protein expression following high dose ionizing radiation. The expression of Deira-PprI protein also significantly enhanced the scavenging ability of free radicals by inducing the enzymatic activity of KatG. These results indicate that exogenous expression of Deira-PprI promotes DNA repair and protection pathways and enhances the radioresistance of E. coli.     

Role of RecA in DNA damage repair in Deinococcus radiodurans

It has been shown previously that the RecA protein of Deinococcus radiodurans plays a unique role in the repair of DNA damage in this highly DNA damage-resistant organism. Despite the high level of amino-acid identity, previous work has shown that Escherichia coli RecA does not complement D. radiodurans RecA mutants, further suggesting the uniqueness of D. radiodurans RecA. The work presented here shows that E. coli RecA does in fact provide partial complementation to a D. radiodurans RecA null mutant, suggesting that the RecA protein from D. radiodurans may not be as unique as believed previously.     

离子注入对耐辐射微球菌存活及生物量的影响

以耐辐射异常微球菌（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）为试材,研究了离子注入对其存活和生物干重的影响。结果表明,不同能量和不同种类的离子注入Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ,其存活均表现为先降后升再降的变化,即存活曲线呈现为相似的“马鞍型”,只是在不同种类的离子注入中,注入能量为２０ｋｅＶ的原子质量较大的Ｎ＋离子比Ｈ＋对其存活和生物干重的影响较大;在不同能量的离子注入中,能量相对较高的３０ｋｅＶ的Ｎ＋离子注入比２０ｋｅＶ的影响大。离子注入生物体产生这种不同于其它电离辐射的存活规律,意味着其对生物体的作用机理显著不同于其它电离辐射。     

耐辐射异常球菌抗辐射机理的研究新进展

报道了自1956年Anderson发现耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)以来,国外在其生理生化和遗传学特性、特殊的细胞膜结构、各种诱变因素所致的DNA损伤与其高效的修复机制和生物化学、分子生物学应用于该菌的研究新进展。对该菌的研究在辐射生物学与医学上具有特殊的意义,因此,我国的辐射生物学、微生物学和医学研究人员应尽快开展这方面的研究。     

耐辐射奇球菌crtI基因缺失突变株的构建及其功能研究

利用PCR方法和体内同源重组技术,对耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)中控制色素合成的关键基因———crtI进行缺失突变,成功获得红色色素缺失突变株M61。对突变株分别进行不同剂量电离辐射(IR)和不同浓度过氧化氢(H2O2)处理,结果表明:与野生型菌株R1相比,突变株M61对电离辐射的抗性降低;对过氧化氢的敏感性明显上升,在高浓度H2O2条件下表现异常敏感。HPLC分析结果显示,crtI基因的完全缺失对色素合成途径产生重要影响,导致番茄红素和其他红色类胡萝卜素的合成被抑制。证明crtI基因是耐辐射奇球菌中控制红色类胡萝卜素合成的一个关键基因。为阐明耐辐射奇球菌中类胡萝卜素参与的抗辐射和抗氧化机制奠定了一定基础,为进一步研究类胡萝卜素在耐辐射奇球菌中的合成途径及功能提供了思路。     

Effects of carotenoids from Deinococcus radiodurans on protein oxidation

Aims:  To evaluate the antioxidant effect of carotenoids from Deinococcus radiodurans on protein.
Methods and Results:  Deinococcus radiodurans strain R1 (ATCC 13939) and its mutant strain R1ΔcrtB were used for this study. The total carotenoids (R1ex) from D. radiodurans were obtained by extraction with acetone/methanol (7 : 2, by vol), and their antioxidant activity was measured using the DPPH˙ (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) system. The protein oxidation level, in vitro and in the cell, was measured using the DNPH (2,4-dinitrophenyl hydrazine) method. The carotenoid extract R1ex scavenged 40·2% DPPH˙ radicals compared to β-carotene (31·7%) at a concentration of 0·5 mg ml⁻¹. The intracellular level of protein oxidation in mutant R1ΔcrtB, which does not contain carotenoid, was 0·0212 mmol mg⁻¹ protein which is significantly greater than that in the wild type (0·0169 mmol mg⁻¹ protein) following the treatment with H₂O₂. The purified major carotenoid product (deinoxanthin) from the wild type showed a greater inhibition of oxidative damage in bovine serum albumin than lycopene or lutein.
Conclusions:  Carotenoids prevent protein oxidation and contribute to the resistance to cell damage in D. radiodurans .
Significance and Impact of the Study:  Our results provide the evidence that carotenoids can protect proteins in D. radiodurans against oxidative stress.