中江丹参药材指纹图谱研究

建立四川中江丹参药材的指纹图谱,以期完成中江丹参GAP重要的一环;HPLC法建立丹参脂溶性提取物的指纹图谱;10批中江丹参材指纹图谱符合国家药品监督管理局2000年颁发的关于中药材指纹图谱技术要求;该图谱可作为中江丹参药材质量控制标准之一。     

山茱萸药材指纹图谱的研究

以乙腈—磷酸梯度洗脱,用高效液相色谱法建立山茱萸药材的指纹图谱。用方法学考察,表明其精密度高,重现性好。实验测定多批样品图谱,共确定10个共有指纹峰,采用相关系数法计算不同样品指纹图谱之间相似度,结果表明指纹图谱相似度大小与药材品质有关。     

不同产地丹参药材HPLC指纹图谱分析及4种菲醌类成分含量的比较

对7个产地丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)药材进行了HPLC分析并确定了其指纹图谱的共有模式谱,在此基础上比较了7个产地丹参药材中4种菲醌类成分(二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA)的相对含量。结果表明:来源于不同产地的丹参药材的HPLC图谱均有21个峰,其中有8个共有峰;各共有峰的相对保留时间基本相同,RSD值均小于0.086%;但相对峰面积差异明显。以4号峰(二氢丹参酮Ⅰ)为参照峰,初步构建了丹参药材的HPLC指纹图谱的共有模式谱,7个产地丹参药材的HPLC指纹图谱与共有模式谱的相似性良好,相似度值为0.916～0.973。不同产地丹参药材中4种菲醌类成分的相对含量有明显差异,其中,河南产药材中4种菲醌类成分含量均最高,而河北产药材中均最低;此外,不同产地丹参药材中4种成分的组成比例也有明显差异。根据实验结果,建议将丹参药材的HPLC指纹图谱的共有模式谱作为丹参药材质量控制和真伪辨别的标准之一。     

青藏高原红景天药材的HPLC指纹图谱

利用高效液相色谱法建立了青藏高原红景天的色谱指纹图谱。固定相采用C28反相色谱柱,流动相为甲醇：0．1%磷酸水(v／v=15：85);检测波长220nm;流速为1．0mL／min。通过比较发现红景天样品的8个主要共有峰．可作为鉴别红景天药材的主要依据。方法简便快速。为中药品种的鉴定提供了较全面的信息。     

不同产地丹参脂溶性成分指纹图谱的比较研究

目的：利用聚类分析对各地野生及家种丹参的指纹图谱数据进行分析。了解不同地理区域野生丹参以及同一地区家种丹参的遗传差异,为丹参药材优良品种的筛选提供依据。方法：采用高效液相色谱法,以甲醇-水系统为流动相进行梯度洗脱,流速1．0mL／min。检测波长254nm,使用SPSS11．0数据处理软件对所得指纹图谱中考察指标进行聚类分析。结果：采用无性繁殖的相同产地的家种丹参指纹图谱具有很好的相似性,相应的品系药材可以归入同一类;而野生丹参则不可按其地理区域归类。结论：采用无性繁殖丹参的遗传稳定性较好。     

木瓜药材HPLC指纹图谱研究

以熊果酸为参照物,利用高效液相色谱（HPLC）梯度洗脱,测定了19批木瓜（Chaenomeles speciosa（Sweet） Nakai）样品。建立了药用木瓜的高效液相指纹图谱,为评价控制药用木瓜的质量提供了依据。色谱柱为YPW—Kromasil TM—C18柱（250mm×4．6mm,5μm）（美国迪马公司）;流动相：甲醇（A）一1％冰醋酸（B）,流动相A为甲醇,流动相B为1％冰醋酸水溶液。检测波长290nm,柱温30℃,流速10mL／mjn,进样量20μL。通过分析19批木瓜样品得到的高效液相指纹图谱有11个共有峰,多数峰都可以达到较好分离且19批次相似度符合。因此药用木瓜的指纹图谱特征性及专属性强,可用于药用木瓜的质量控制。     

不同产地野生与栽培伊贝母药材水溶性成分指纹图谱研究

目的:建立伊贝母药材水溶性成分高效液相色谱指纹图谱,为科学评价和有效控制其质量提供可靠的方法。方法:采用HPLC-DAD方法,以Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),流动相为甲醇和水,梯度洗脱,流速0.5 mL·min-1,柱温25℃,检测波长:260 nm。采用药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版软件,对29批野生与栽培伊贝母药材进行指纹图谱分析。结果:29批伊贝母药材中有14个共有特征峰,建立了HPLC指纹图谱共有模式。各批次伊贝母药材相似度都在0.714以上,29批野生与栽培伊贝母药材可通过系统聚类分成5类,不同产地野生与栽培药材组成质量相似性较好,并定量测定了样品中的β-胸苷和腺苷。结论:所建立的HPLC指纹图谱及定量分析均具有良好的精密度、重复性、稳定性,可用于伊贝母药材的质量综合评价。     

不同产地水飞蓟药材HPLC指纹图谱研究

目的建立水飞蓟药材的HPLC指纹图谱分析方法,并对不同产地水飞蓟药材进行指纹图谱比较研究。方法采用反相高效液相色谱法,Shimadzu C18(150 mm×4.6 mm)为色谱柱,流动相为甲醇-水-冰醋酸(48:52:1),流速:1.0 mL/min,检测波长为287 nm,柱温40℃,进样量10μl。对水飞蓟药材的指标成分水飞蓟宾进行了定性定量,并以相似度鉴别药材质量。结果建立了水飞蓟药材的HPLC指纹图谱,标定了12个共有峰,方法学考察结果符合指纹图谱技术要求,经相似度计算11个不同产地药材之间的相似性均高于0.944。结论本法简便准确、结论可靠,可用于不同产地水飞蓟药材的指纹图谱测定和质量评价,为有效控制水飞蓟药材的内在质量提供了实验依据。     

一氧化氮信号在脱落酸诱导丹参酚酸类成分积累中的作用

为探讨一氧化氮(Nitric oxide,NO)信号在脱落酸(Abscisic acid,ABA)诱导丹参酚酸类成分积累中的作用,采用不同浓度一氧化氮外源供体硝普钠(Sodium nitroprusside,SNP)处理丹参毛状根,6 d后采收,测定酚酸类成分含量;ABA联合一氧化氮清除剂(2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide,c-PTIO)或一氧化氮合酶抑制剂(N~G-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)对丹参毛状根进行处理,测定酚酸类成分含量和关键基因表达量。结果表明,100μmol/L SNP对丹参毛状根中迷迭香酸与丹酚酸B积累的诱导效果最显著,迷迭香酸和丹酚酸B含量分别增加了3倍和4倍。ABA处理能显著促进PAL(Phenylalanine ammonia lyase)、TAT(Tyrosine aminotransferase)和RAS(Rosmarinic acid synthase)基因的表达,促进丹参毛状根中酚酸类成分的积累,而联合c-PTIO或L-NAME共同处理后,3种关键基因表达下调,并显著抑制了酚酸类成分的积累。研究证明NO和ABA均能够促进丹酚酸类成分的积累,NO信号可能介导了ABA对丹酚酸生物合成的诱导作用。     

不同生长季节丹参营养器官中有效成分的动态变化

分析了三年生丹参不同季节营养器官中几种有效成分的变化规律。结果表明：（1）丹参地上部分丹参素、原儿茶醛和咖啡酸的含量在整个生长季节中显著高于根的;丹酚酸B和迷迭香酸的含量除8月份达到最高和最低外,其他月份差异不显著;（2）6-8月地上部分的5种水溶性酚酸类成分的含量均显著变化,而根中除咖啡酸在6月积累较低外,其它酚酸在整个生长季节的积累量变化不明显;（3）在整个生长季节,根系丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量变化不显著,而二氢丹参酮和丹参酮Ⅰ的含量呈现上升趋势。总体来说,三年生丹参秋季采挖为宜,其地上部分水溶性成分含量较大,值得进一步开发。     

丹参SmVS基因的克隆和表达分析

为了解丹参(Salvia miltiorrhiza)的Vinorine合成酶基因(VS)的功能,从丹参中克隆了SmVS基因,并通过Ex PASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析,同时利用RT-qPCR技术分析其表达模式。结果表明,SmVS基因全长726 bp,编码241个氨基酸,编码蛋白分子量为26 861.72,等电点PI为5.66,为膜外蛋白,推测定位于线粒体。系统进化分析表明,丹参SmVS与野生油橄榄(Olea europaea var. sylvestris)的VS亲缘关系较近。SmVS基因在丹参根中的表达比叶的高,叶中的转录水平在21:00最高。因此,推测SmVS基因与光应答有关。     

三倍体丹参杂交种的花粉形态研究

三倍体丹参是以二倍体丹参为父本、人工染色体加倍的四倍体白花丹参为母本杂交选育的杂交种。为深入了解三倍体丹参花粉的特性,以及为三倍体种质利用提供孢粉学依据,该文以二倍体丹参为对照,研究了三倍体丹参杂交种花粉的形态变异规律。利用光学显微镜和扫描电镜对二倍体和三倍体丹参的花粉萌发沟、外壁纹饰、花粉粒形状等特征进行了显微和超微形态观察,综合进行了花粉形态差异比较,并对花粉大小和形状数据进行了差异显著性分析和正态检验。结果表明:(1)二倍体丹参为6沟花粉,三倍体花粉萌发沟有6沟和8沟两种类型,沟内疣状颗粒分布不匀,出现畸形萌发沟。(2)二倍体和三倍体花粉外壁均为网状雕纹。二倍体花粉网眼内具多个多边形穿孔,穿孔大; 6沟和8沟两种类型的三倍体花粉网眼无穿孔或仅有几个小穿孔,6沟和8沟花粉的外壁雕纹相同。(3)三倍体花粉的极轴长(P)和赤道宽(E)均值显著小于二倍体花粉,花粉大小呈偏正态分布,P*E的差异系数大于二倍体花粉,且有极值存在。三倍体和二倍体丹参的萌发沟和雕纹存在差异,而花粉形状差异不显著。综上结果表明三倍体丹参花粉在倍性效应和杂合性的双重影响下发生了形态变异,且有多种形态变化。     

丹参线粒体和叶绿体微卫星标记开发及多样性分析

该研究通过生物信息学方法,对丹参线粒体、叶绿体基因组序列进行SSR位点搜索,利用Primer3.0软件在线设计SSR引物,通过PCR扩增,筛选出扩增效果好、多态性高的10对cpSSR引物和13对mtSSR引物,用于分析61份丹参品种的遗传多样性和鼠尾草属植物种间的通用性。结果显示：（1）从2条基因组序列中搜索到32个cpSSR位点和24个mtSSR位点,其中叶绿体单核苷酸的重复序列最多为31个,占96.9%,重复类型中以A/T形式的微卫星最为丰富。（2）23对SSR引物共检测出46个等位基因,平均每个SSR位点等位基因数是2个,有效等位基因数为1.566;预期杂合度(H_e)为0.346,高于双子叶植物的平均水平（H_e=0.190）;多态信息含量（PIC）为0.278,大于0.250小于0.500;Shannons信息指数为0.519,表明所采集的丹参呈中等水平的遗传多样性。（3）聚类分析表明,61份丹参材料的遗传相似系数在0.54~0.96之间,并在遗传相似系数为0.64处将 61份丹参分为6个亚群：四川、山东和安徽省的丹参聚集在Ⅰ和Ⅱ亚群中,说明四川中江、山东和安徽地区的丹参亲缘关系较近,而来源于四川中江的丹参分布于所有亚群,表明四川中江的丹参具有丰富的多态性。（4）通用性检测结果显示,11对mtSSR引物在9种鼠尾草属中的平均通用性比率为64.63%,通用性较高;9对cpSSR引物在10种鼠尾草属中的平均通用性比率为44.66%,通用性较低;引物cp5p、cp8p和cp10p在野芝麻亚科植物属间的通用性较好。研究表明,开发的23对SSR引物在鼠尾草属内具有很好的适用性,可以为该属种间的亲缘关系和种内遗传分化研究提供分子依据。     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

丹参SmPI1和SmPI2基因克隆及胁迫表达研究

该研究从药用植物丹参中克隆了SmPI1和SmPI2蛋白酶抑制剂基因,采用生物信息学和实时荧光定量PCR方法对其序列及表达模式进行了分析。序列分析结果表明,丹参SmPI1和SmPI2基因分别含有一个长度为222bp和216bp的开放阅读框,编码73和71个氨基酸;2个编码蛋白都无跨膜结构域和信号肽,预测都定位于细胞质中;SmPI1和SmPI2蛋白与川桑、可可、苜蓿等植物的蛋白酶抑制剂基因相似性较高,分别为58%、52%、53%和54%、56%、51%。实时荧光定量PCR结果表明,SmPI1和SmPI2基因受茉莉酸甲酯(MeJA)和甘蓝黑腐病黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris,XC)显著诱导,说明丹参SmPI1和SmPI2基因可强烈响应这两类胁迫,可能参与丹参中两类胁迫分子途径相关的抗性反应。     

丹参抗性基因SmORA1的克隆及诱导表达分析

该研究采用PCR方法从丹参中克隆出一条乙烯应答因子结合蛋白(ERF)转录因子编码基因,命名为SmORA1,GenBank登录号为KT359598。经分析发现该基因全长648bp,不包含内含子,编码206个氨基酸残基。编码蛋白SmORA1含有典型的AP2结合结构域。表达分析结果表明,SmORA1主要在丹参根中表达,且该基因的表达明显受到茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、机械创伤和病原菌等逆境信号的诱导,但低温和脱水情况下SmORA1表达下调。研究表明,SmORA1参与丹参生物胁迫反应,可整合JA、ABA、ET和病原菌等胁迫信号途径。     

丹参病程相关蛋白基因PR10的克隆与表达分析

病程相关蛋白(PR)的产生与积累是植物体应对生物或非生物胁迫的主要特征之一。该研究以人工培养的丹参幼苗为材料,通过分析丹参转录组数据,根据丹参病程相关蛋白基因PR10的序列设计特异性引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从丹参中获得PR10基因的开放阅读框(ORF),命名为SmPR10-1(GenBank注册号KF877034),并进行原核表达和纯化。结果表明:(1)SmPR10-1基因ORF为477bp,编码158个氨基酸,其蛋白质分子质量为17.38kD。(2)通过蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等生物信息学分析,发现SmPR10-1基因具有保守序列(G-X-G-G-X-G)和(K-A-X-E-X-Y),其编码蛋白与葡萄等双子叶植物中的PR10蛋白同源性较高。(3)经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,含有表达载体pET32a-SmPR10-1的大肠杆菌(Escherichia coli BL21)可诱导表达融合蛋白;对影响蛋白表达的4个因素优化结果表明,SmPR10-1蛋白的最佳表达条件为:IPTG终浓度0.4mmol/L、起始宿主菌密度A600为0.8、诱导温度30℃、诱导时间8h,并得到纯化的SmPR10-1蛋白。该结果为进一步研究SmPR10-1基因在丹参抗病方面的生物学功能和培育丹参抗病品种奠定了基础。     

丹参多酚氧化酶基因的克隆及表达分析

前期研究发现多酚氧化酶(PPO)能正向调控丹酚酸B合成,该研究运用RACE技术,从丹参毛状根中克隆到多酚氧化酶基因(SmPPO,GenBank登录号为KF712274)全长序列,其cDNA全长1 930bp,开放阅读框为1 770bp,编码589个氨基酸。将SmPPO与管状花目其它4个物种进行氨基酸序列比对,在N端类囊体转移结构域中发现都存在2个N-豆蔻酰化位点。在丹参毛状根培养液中加入不同诱导因子,利用实时荧光定量PCR检测,发现该基因在酵母提取物处理中表达量显著上调,但在银离子、抗坏血酸和L-半胱氨酸处理中表达受到明显抑制。运用HPLC技术同步检测毛状根中丹酚酸B含量,显示出与基因表达相同的变化趋势。研究表明,丹参中多酚氧化酶基因(SmPPO)对丹酚酸B的合成具有正向调控作用。     

ESI-Q-TOF-MS直接进样法比较陕西五个不同地区丹参的化学成分差异

该研究采用ESI-Q-TOF-MS直接进样分析法对陕西商州、洛南、大荔、丹凤和铜川等五个地区丹参的化学成分进行了比较分析,通过丹参水溶性和脂溶性成分的质谱丰度差异评价了不同地区丹参化学成分含量的变化,对不同产地丹参的化学成分进行了鉴定,综合分析选出了最优的丹参种植产地。结果表明:五地丹参均含有丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮、丹参酚酮、次丹参醌、丹参醌Ⅱ等9种脂溶性化学成分和丹参素、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、原紫草酸、紫草酸、原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B等9种水溶性化学成分,其中丹参素钠、紫草酸、丹酚酸B和隐丹参酮的含量普遍较高,质谱丰度均大于30%。但是,随着种植环境不同,不同地区丹参的化学成分含量差异很大,如商州产丹参中含有较多具有生物活性的丹参酮类物质,其中丹参酮Ⅰ含量远远高于其他四个产地,质谱丰度达到72.6%,而其他地区丹参酮Ⅰ的质谱丰度为1.8%～11.3%。这表明丹参质量按照地区排序为商州>铜川>大荔>洛南>丹凤。该方法为中药药材质量评价提供了科学、可靠、便捷的途径,为药材规格等级的制定提供了新途径,为陕西丹参种植区域的选择提供了重要信息。     

贵州鼠尾草化学成分研究

为了解贵州鼠尾草(Salvia cavaleriei)的化学成分,运用色谱分离技术,从其95%乙醇提取物中分离得到16个化合物,经波谱数据分析分别鉴定为：β-倍半水芹烯 (1)、6R-(7R,11-二甲基-10-乙烯亚基)-环己烯酮 (2)、β-没药烯 (3)、α-姜黄烯 (4)、3,4-二羟基苯乙酸甲酯 (5)、香草醛 (6)、姜油酮 (7)、6-姜烯酚 (8)、阿魏酸十八烷酯 (9)、维生素E醌 (10)、5-羟甲基-2-糠醛 (11)、硫代乙酸酐 (12)、吲唑 (13)、棕榈酸 (14)、角鲨烯 (15)和二十六烷 (16)。其中,化合物2为新天然产物,除化合物3、4和6外,所有化合物均为首次从贵州鼠尾草中分离得到,此外,化合物2、5、9和12为首次从唇形科(Lamiaceae)植物中分离得到,化合物1和15为首次从鼠尾草属植物中分离得到。