微生物辅因子工程研究进展

微生物细胞中的大部分酶促反应都需要各种辅因子的参与,辅因子平衡对维持细胞内的生化反应稳态非常重要,辅因子供应不足会导致细胞生长和化合物生产的紊乱。近年来,辅因子在生化反应过程中的关键作用备受关注,但由于其价格较昂贵、稳定性差,因此限制了辅因子工程的发展。合成生物学和代谢工程的发展为辅因子的可持续供应提供了可行的解决方案,多种加强辅因子供应的策略有效地推动了目标化合物的生物合成。其中,烟酰胺类辅因子NAD(P)⁺、NAD(P)H是微生物代谢过程中最常见的氧化还原辅因子,它们在所有生物体内作为重要的电子受体或供体推动合成与分解代谢反应,对维持胞内氧化还原动态平衡起着决定性作用。从NAD(P)H的主要来源和NAD(P)⁺/NAD(P)H的平衡对天然产物生物合成中的影响出发,重点从三个不同维度讨论辅因子工程策略,综述代谢途径调节、外源氧化还原酶的引入、蛋白质工程等多种辅因子再生策略的最新研究进展及应用,展望辅因子代谢工程在生物合成中的未来发展方向。     

辅因子在微生物细胞工厂中的代谢调控与应用*

生物体中大部分酶催化反应都需要辅因子参与,辅因子平衡对维持正常的细胞代谢至关重要,而辅因子失衡则会导致细胞生长和生产的紊乱。在微生物细胞工厂的构建中,通过调节辅因子代谢平衡来提高产物合成途径的效率,从而调控细胞生长与产物生产,使代谢流能够最大限度地流向目标产物,已经成为代谢调控的重要手段。目前常见的用于代谢调控的辅因子有NAD(P)H/NAD(P)⁺、辅酶、ATP/ADP等。围绕这几种辅因子的代谢途径及功能分类进行了综述,并总结了微生物中不同产物利用辅因子平衡策略进行合成调控的研究,以期为各类化合物的高效生物合成提供参考。     

非天然氨基酸细胞工厂的构建与应用

非天然氨基酸在医药、农药、材料等领域得到广泛应用,其绿色、高效合成越来越受到关注.近年来,随着合成生物学的快速发展,微生物细胞工厂为非天然氨基酸的制造提供了重要手段.文中从合成途径的重构、关键酶的设计改造及与前体的协同调控、竞争性旁路途径的敲除、辅因子循环系统的构建等方面介绍了 一系列非天然氨基酸细胞工厂构建与应用的研...     

丁醇在大肠杆菌中的生物合成研究进展*

生物丁醇作为一种重要的化学品和石油基燃料的替代品引起了人们的广泛关注。大肠杆菌(Escherichia coli)是生物合成化学品的优良底盘菌株,已在其体内构建了丁醇的生物合成途径。但大肠杆菌合成丁醇存在:(1)代谢通量非最优;(2)辅因子和氧化还原不平衡;(3)丁醇产量和产率低等问题,为此,从高效酶选择、碳代谢流调控、辅因子调控、丁醇生产和工艺等方面已经对丁醇合成途径和丁醇发酵进行了优化。从该角度出发阐述近几年来大肠杆菌生物合成丁醇的研究进展,并展望了利用工程大肠杆菌生产丁醇的研究方向,旨在为应用其进行高效的丁醇生产提供参考。     

丁醇在大肠杆菌中的生物合成研究进展*

生物丁醇作为一种重要的化学品和石油基燃料的替代品引起了人们的广泛关注。大肠杆菌(Escherichia coli)是生物合成化学品的优良底盘菌株,已在其体内构建了丁醇的生物合成途径。但大肠杆菌合成丁醇存在:(1)代谢通量非最优;(2)辅因子和氧化还原不平衡;(3)丁醇产量和产率低等问题,为此,从高效酶选择、碳代谢流调控、辅因子调控、丁醇生产和工艺等方面已经对丁醇合成途径和丁醇发酵进行了优化。从该角度出发阐述近几年来大肠杆菌生物合成丁醇的研究进展,并展望了利用工程大肠杆菌生产丁醇的研究方向,旨在为应用其进行高效的丁醇生产提供参考。     

酿酒酵母细胞器区室化合成化学品的研究进展

公认食品安全的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是合成生物学中被广泛研究的底盘细胞,常作为生产高值或大宗化学品的微生物细胞工厂。近年来,通过各种代谢工程改造策略,已有大量化学品的合成途径在酿酒酵母中建立并优化,且部分化学品具备了产业化价值。作为真核生物,酿酒酵母具有完整的细胞内膜系统及其组成的复杂细胞器区室,而这些细胞器区室往往含有某些化学品合成所必需的较高浓度前体底物(如线粒体中的乙酰辅酶A),或更加充足的酶、辅因子、能量等,可为目标产物的生物合成提供更适宜的物理、化学环境,但同时不同细胞器的结构特点有时也成为特定化合物合成的障碍。为此,研究人员在深入分析不同细胞器自身特点的基础上,结合目标化学品合成途径与细胞器之间的适配度,对细胞器开展了大量针对性改造工作以提高产物合成效率。本文详细综述了酿酒酵母中线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、内质网、脂滴和液泡等细胞器的途径改造及优化策略,以及利用细胞器区室化合成化学品的研究进展,并对目前存在的困难和挑战以及未来研究方向进行了总结与展望。     

酿酒酵母生物基化学品转化合成平台的研究进展

<正>酿酒酵母作为极具潜力的细胞工厂。近年来被广泛应用于合成各种生物基化学品的研究。文章介绍了酿酒酵母作为细胞工厂的特点和优势,从拓展底物范围、加强前体物供给以及优化产物合成三个方面介绍了以酿酒酵母作为转化合成平台,生产生物燃料、大宗化学品或精细化学品等的研究进展,并举例介绍了优化丁醇和青蒿素前体青蒿酸及紫穗槐二烯的合成的相关进展。     

含能化合物的生物合成反应

近年来随着工业生物技术的发展,以微生物作为细胞工厂,利用可再生原料实现绿色制造工业化学品和材料成为可能。同时,开发与环境相容的生物合成技术为含能化合物的生产提供了可持续的解决方案,为绿色化学合成工艺提供有益补充。本文中,笔者从技术成熟程度递减的前驱体合成、基团和骨架合成、合成技术这三个层次总结了含能化合物的生物合成反应,总结了通过整合已知酶和代谢通路合成含能化合物前驱体的方法;基于含能化合物的基团特异性,综述了含能化合物中常见的硝基、肼基和氧化偶氮基等基团及含氮杂环骨架的生物合成反应;介绍了有助于实现特定功能酶定制开发的蛋白质定向进化和酶计算设计技术,为实现含能化合物的生物全合成奠定基础。     

大肠杆菌苏氨酸合成途径动力学模型的构建与分析

动力学模型分析有利于理解生物系统的调控机制,从而为高效细胞工厂的理性设计提供指导。基于以往发表的相关途径动力学模型和测量的酶动力学数据,开发了大肠杆菌苏氨酸合成途径的动力学模型。模型包含从天冬氨酸至苏氨酸的合成途径及葡萄糖开始的为合成途径提供前体以及能量的代谢途径。与以往模型不同的是新模型中考虑了能量和还原力的平衡,从而使模型模拟的系统自身成为一个不需要从外界提供能量和还原力的自洽系统。模型稳态分析的结果表明PTS、G6PDH和HDH等反应对苏氨酸合成反应的通量控制系数较大,通过过表达这些反应的酶可以有效增加苏氨酸合成反应的通量。     

合成生物学驱动的智能生物制造研究进展

合成生物学的迅猛发展给包括药物和化学品在内的生物制造带来了强劲动力。它助力生物合成关键元件的挖掘,丰富了智能生物制造所必需的基础(催化)元件库;底盘细胞的性能优化为高效生物制造奠定了基石和平台。合成生物学经典的"设计-构建-测试-学习"则是创建高效智能细胞工厂的核心研发内容。天然宿主的系统代谢工程和合成生物学以及无细胞体系的体外合成生物学,是实现高效生物制造和替代底盘细胞体系的可选途径。该文简要综述近年国内外的相关研究进展。     

刊首语

<正>生物制造是通过微生物细胞工厂或酶催化,利用可再生生物质资源生产大宗化学品和能源化学品等重要工业品的过程,是解决资源、能源和环境等问题的重要途径,已被各国列为战略发展产业。其中,微生物细胞工厂构建是微生物制造过程的核心。而代谢工程是构建细胞工厂的主要手段,其通过代谢路径设计     

谷氨酸棒杆菌代谢工程高效生产L-缬氨酸北大核心CSCD

L-缬氨酸作为一种支链氨基酸,广泛应用于医药和饲料等领域。本研究借助多种代谢工程策略相结合的方法,构建了生产L-缬氨酸的微生物细胞工厂,实现了L-缬氨酸的高效生产。首先,通过增强糖酵解途径、减弱副产物代谢途径相结合的方式,强化了L-缬氨酸合成前体丙酮酸的供给;其次,针对L-缬氨酸合成路径关键酶—乙酰羟酸合酶进行定点突变,提高了菌株的抗反馈抑制能力,并利用启动子工程策略,优化了路径关键酶的基因表达水平;最后,利用辅因子工程策略,改变了乙酰羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶的辅因子偏好性,由偏好NADPH转变为偏好NADH,从而提高了L-缬氨酸的合成能力。在5L发酵罐中,最优谷氨酸棒杆菌工程菌株Corynebacterium glutamicum K020的L-缬氨酸产量、得率和生产强度分别达到了110g/L、0.51g/g和2.29 g/(L·h)。     

化学品生物合成专刊序言

以酶及微生物细胞催化剂结合工程学方法将廉价、废弃原料进行高效生物转化可实现化学品的可持续生产。近年来,合成生物学、系统生物学及酶工程等技术的快速发展大大推动了化学品的可持续生物制造,既实现了多种新型化学品的生物合成,又显著提高化学品的生物合成效率。为展示化学品生物合成的最新进展并促进绿色生物制造的发展,《生物工程学报》特组织出版化学品生物合成专刊,从酶催化与生物合成机制、微生物细胞合成、一碳生物炼制以及关键核心技术等方面,介绍化学品生物合成的最新前沿、挑战以及潜在解决方案。     

微藻三酰甘油合成途径及其最新研究进展

三酰甘油(triacylglycerols,TAGs)是动物、植物、微生物和微藻细胞主要的储藏性脂类,它可应用于食品、轻工业和生物燃料等方面,是一种新型可再生能源——生物柴油生产的重要原料。与高等油料作物相比,微藻具有光合作用效率高、生长速度快、油脂产量高、不占用农业耕地和适应多种生长环境等优势,是一种潜在的新型生物柴油生产原料。然而,目前人们对有机体,尤其是微藻细胞内TAG合成与积累的分子机制及细胞的代谢调控机制还知之甚少。对TAG合成的一系列重要过程,包括脂肪酸的合成,TAG生物合成的主要途径和旁路途径,以及与TAG合成相关的关键酶和重要基因等进行了综述,特别对微藻细胞中与TAG合成相关的关键基因的最新研究进展进行了总结,旨在更好地了解油脂代谢的调控途径,为最大限度地供应生物柴油的生产原料提供理论基础。     

加快推动生物制造创新研究

<正>生物制造作为生物产业的重要组成部分,是生物基产品实现产业化的基础平台,也是合成生物学等基础科学创新在具体过程中的应用。生物质是自然界唯一含碳的可再生能源,发展绿色生物制造生产燃料乙醇、生物柴油、生物航煤、生物甲烷以及各种化学品和可降解生物材料是其最佳利用途径。生物制造将从原料源头上降低碳排放、通过工业生物技术实现绿色清洁的生产工艺,将从根本上改变我国经济社会发展"高能耗、高排放"的现有模式。重大化工产品(化学品、能     

合成生物学中动态代谢途径调控策略的研究进展

随着合成生物学的发展,越来越多的天然高附加值化学品和大宗化学品可以通过在微生物底盘细胞中构建人工合成途径来进行生产。然而外源途径基因的不平衡表达以及有毒中间代谢产物的积累往往会影响宿主细胞的正常生长,这也是合成生物学研究中的一个共性难题。因此设计可控的基因表达系统,在特定时刻启动或者关闭人工合成途径,对于避免细胞生长和产物合成之间的相互干扰至关重要。重点介绍了最新的动态代谢调控策略及其在代谢途径调控中的应用,并对其发展趋势进行了展望。     

一碳代谢关键酶——甲醇脱氢酶的研究进展与展望

甲醇和甲烷等一碳原料来源广泛,价格低廉,是生物制造的理想原料.甲醇脱氢酶(Methanol dehydrogenase,MDH)催化甲醇生成甲醛是一碳代谢的关键反应.目前已从天然甲基营养菌中发现了多种利用不同辅因子,具有不同酶学性质的MDH.其中,烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)依赖型MDH被广泛应用于构建人工甲基营养菌...     

中链化学品微生物制造

中链脂肪酸（C₆-C₁₂）衍生的化学品包括脂肪醇、脂肪烃、中链酯、ω-修饰脂肪酸等,这些化合物是生物燃料、聚合物、日用化学品、特种化学品的重要组分。天然微生物底盘不能合成中链脂肪酸,而通过操纵脂肪酸合成、逆β-氧化等碳链延伸途径,尤其是表达生成游离中链脂肪酸的硫酯酶,可使大肠埃希菌、酿酒酵母等微生物细胞合成超过1 g/L的中链脂肪酸。引入脂肪酸衍生反应,如羧基还原、脱羧、ω-氧化等,可合成许多中链化学品。本文综述了中链化学品合成的酶学基础以及代谢工程策略,为中链化学品高效生物制造提供参考和思路。     

平台化学品短链支链脂肪酸和短链支链醇的微生物代谢工程

短链支链脂肪酸和短链支链醇均为重要的平台化学品,是合成多种高附加值产品的前体物质,市场需求巨大。目前两者的生产主要是利用基于石化原料的化学合成法。化学合成法存在着严重依赖化石燃料、反应效率低以及极易造成环境污染等缺点。微生物代谢工程的快速发展为这些平台化学品的生产提供了一条极具潜力的生物合成路线。利用微生物代谢工程技术构建生产这些平台化学品的微生物细胞工厂具有绿色清洁、可持续发展和经济效益好等独特优势。本文系统综述了近年来微生物代谢工程技术在短链支链脂肪酸和短链支链醇合成方面的研究进展,包括所涉及的宿主菌株、关键酶、代谢途径及其改造等,并探讨了未来的发展前景。     

大肠杆菌NAD+合成关键酶的克隆表达及发酵优化

【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞生命周期中具有重要的作用,其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略,获得高产NAD~+菌株,对于NAD~+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。【方法】首先通过内源性调节,对代谢途径中的关键酶基因进行强化,过量表达和共表达NAD~+合成途径中的关键酶基因pncB、nadD和nadE;其次,通过外源调节增加NAD~+前体物,优化诱导条件提高发酵过程中关键酶的表达量,增加NAD~+的合成量;最后在单因素优化试验的基础上,以NAD~+含量为响应值,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究3个显著性影响因素相互作用对NAD~+积累量的影响,确定最佳的优化条件。【结果】根据关键酶基因强化策略,构建了7株重组菌,其中重组菌E.coli BL21/p ET-21a-nad E-pncB胞内NAD~+含量相比初始菌株E.coli BL21/pET-21a提高了405.2%。通过对该菌株诱导条件和NAD~+合成前体的优化,使用Design Expert 8.0分析实验数据,得出该重组菌株的最佳发酵条件为:诱导温度控制在15–20 oC,OD_(600)为0.6–0.8时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、诱导时长控制在24 h。NAD~+含量在最优条件下实验验证值可达43.16μmol/g DCW,与优化前相比提高了123.6%,与初始菌株相比提高了1029.8%。【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB和nadE,胞内NAD~+合成量明显增加,前体物以及诱导条件的外源调节使NAD~+积累量达到最佳优化值。实现了提高NAD~+含量的目标,胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。