TAT介导多肽药物过表达纯化和穿膜活性检测

目的:获得NR2B羧基端多肽(NR2Pep),探讨TAT-NR2Pep在细胞中的跨膜特性。方法:利用酶切连接方法构建p Waldo-TAT-pep质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,检测不同浓度诱导剂和不同温度对蛋白质表达的影响;利用镍柱亲和层析及分子筛方法纯化TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,利用GFP发荧光的特性采用In-gel检测蛋白质的表达情况;以融合蛋白C端His标签特异性抗体,通过Western印迹确定融合蛋白的表达;荧光显微镜下观察TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白在CHO和C2C12等细胞中的跨膜活性。结果:构建了TAT-NR2Pep-GFP表达载体,重组菌经0.1 mmol/L IPTG于22℃诱导20 h能够表达较多高质量的目标蛋白;In-gel荧光检测证实融合蛋白TATNR2Pep-GFP拥有正确构象,GFP能够发出绿色荧光;Western印迹分析表明融合蛋白相对分子质量符合预期;细胞穿膜实验证实TAT能够介导多肽穿过细胞膜。结论:原核表达并纯化得到TAT-NR2Pep-GFP融合蛋白,该蛋白散发绿色荧光,能够穿过细胞膜。     

TAT蛋白转导肽介导的秀丽线虫体内外源蛋白的跨膜转导研究

TAT蛋白转导肽是HIV-1病毒编码的一段富含碱性氨基酸序列的多肽,能够高效介导多种外源生物大分子通过多种膜性结构,如细胞质膜和血脑屏障等。为探索TAT蛋白转导肽介导的秀丽线虫体内外源蛋白跨膜转导作用,以EGFP为报告基因结合常规分子克隆技术构建了原核表达载体pET28b-EGFP和pET28-TAT-EGFP,继而利用诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达了靶蛋白并结合荧光显微观察、SDS-PAGE和Western blot等鉴定技术获得表达靶蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)细胞,最后将其涂布到含有Kana⁺的LB固体培养基上直接饲喂野生型N2株系线虫,利用荧光显微镜观察绿色荧光信号在线虫体内的分布。结果证明,TAT-EGFP融合蛋白较之于EGFP可高效、可溶性表达,而且通过直接饲喂秀丽线虫表达靶蛋白的大肠杆菌48小时后,TAT-EGFP荧光信号明显分布于线虫肠壁细胞,而EGFP荧光信号则分布在秀丽线虫肠腔,空载体对照组未见任何荧光信号,说明TAT蛋白转导肽能够高效介导外源蛋白在秀丽线虫体内跨膜转导。同时,通过比较空载体对照组与实验组线虫微分干涉图像,未见线虫出现明显的细胞形态变化,说明TAT蛋白转导肽介导的外源蛋白跨膜转导作用是安全的,为在秀丽线虫体内直接研究外源蛋白的功能以及进行蛋白药物的研发提供了重要参考。     

多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送

增强型绿色荧光蛋白与蛋白质转导结构域TAT、SV40大T抗原的核定位信号以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达 ,纯化后转导A431细胞 ,大部分细胞核内都可以观察到绿色荧光 ,说明TAT NLS可以有效介导蛋白质的入核递送。这种蛋白质递送系统可望用于转录治疗等研究领域。     

多聚精氨酸融合增强型绿色荧光蛋白制备方法及穿膜效果

为了方便细胞穿膜肽R9融合蛋白的可溶性表达及功能上的研究,构建了pSUMO (小分子泛素样修饰蛋白) -R9-EGFP (增强型绿色荧光蛋白) 原核表达载体。分别纯化EGFP及R9-EGFP蛋白后,作用于HepG2,细胞经流式细胞仪及激光共聚焦检测R9细胞穿膜肽的作用效果。实验结果显示在SUMO分子伴侣的作用下,R9-EGFP融合蛋白获得可溶性表达。经流式细胞仪检测,R9细胞穿膜肽可以快速有效的携带目的蛋白进入细胞内部且呈时间、剂量依赖性,大约1.5 h以后荧光强度进入平台期。共聚焦显微镜检测结果表明R9细胞穿膜肽可以有效携带EGFP进入HepG2细胞,并显示主要聚集在细胞浆内。同时体外经肝素抑制实验显示,肝素抑制R9-EGFP穿膜的效率达到50％。这些结果表明,可以利用pSUMO-R9/Ni-NTA表达纯化系统,快速、有效地表达出可溶性多聚精氨酸融合蛋白,同时R9细胞穿膜肽可以有效地携带目的蛋白进入细胞内,为进一步研究多聚精氨酸的穿膜机制提供了基础。     

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比。结果腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高。结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素。皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层。结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据。     

Tat蛋白转导区域位于融合蛋白C端时的跨膜递送作用

对Tat蛋白转导区域(PTDTat)的C端融合蛋白的跨膜递送作用进行探讨.采用DNA重组技术将PTDTat融合在绿色荧光蛋白(GFP)的羧基(C)端,构建重组表达质粒pGEXGFPTat,IPTG诱导其表达后,采用谷胱甘肽Sepharose4B(GS4B)亲和层析,获得纯化的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的重组蛋白GSTGFPTat.该蛋白与HeLa细胞共培养,荧光显微镜观察其荧光强度随着蛋白浓度的增高而增强.流式细胞仪分析发现,在4.0μmolL蛋白浓度下,转导效率高达80.0%;而在GFP氨基(N)端含有PTDTat的融合蛋白GSTTatGFP的阳性对照组,转导效率只有32.9%.实验结果表明,C端融合的PTDTat同样具有对外源蛋白的跨膜递送作用.该结果可能为PTDTat在蛋白药物递送方面的有效应用提供理论依据.     

p38L12 TAT融合肽对山梨糖醇引起的 ECV304细胞ATF2磷酸化的抑制作用

构建p38 Loop-12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“T-X-Y”双磷酸化位点的AF突变体p38L12（AF）片段,克隆入His标记的TAT-EGFP融合蛋白原核表达载体pHTE（pET14b-His-TAT-EGFP）,经酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒转化原核表达菌,诱导表达纯化融合蛋白;将融合蛋白加入ECV304细胞后于荧光显微镜下观察并行Western印迹分析,检测融合蛋白的细胞内转导活性;通过检测内源性ATF2磷酸化水平,鉴定高渗刺激下p38L12对内源性p38活性的影响.成功构建了p38L12和p38L12(AF)片段与TAT的融合表达载体,并获得相应的融合蛋白.在ECV304细胞中可见导入的HTE-p38L12和THE-p38L12(AF)融合蛋白具有较高的细胞内转导活性和转导效率,并可竞争性抑制高渗刺激对内源性p38的活化.基于HIV-1 TAT细胞转导系统证实p38L12可竞争性抑制高渗刺激诱导的内源性p38对ATF2的活化,从而发挥对p38激活特异性抑制的功能.     

穿膜肽-LacI HPM载体的构建及其DNA结合活性测定

目的：借助穿膜肽TAT高效跨膜的特性和LacI前头肽突变体（LacI HPM）高亲和力结合DNA的特性,构建新型基因转导载体。方法：PCR扩增LacI、Lacl基因前头肽序列、前头肽序列突变体、TAT序列的编码基因,构建前头肽序列突变体和TAT的原核表达载体,可溶性表达TAT-LacI HPM融合蛋白并纯化,在缇冲液中氧化获得TAT-LacI HPM二聚体并浓缩,PCR检测二聚体融合蛋白与质粒的体外结合能力。结果：获得了pET-28a（-4-）-LacI HPM及pET-28a（＋）-TAT-LacI HPM表达质粒,表达纯化并获得二聚化融合蛋白,体外结合实验确定TAT-Lac／HPM二聚体融合蛋白与检测质粒DNA具有特异的高亲和力结合活性。结论：构建了穿膜呔TAT-LacI HPM,为进一步研究其作为新型DNA转运载体的可行性奠定了基础。     

靶向肽位置影响融合蛋白与细胞结合活性

目的:探讨靶向多肽与标签蛋白(绿色荧光蛋白)的位置关系是否会影响融合蛋白与细胞之间的结合能力。方法:将获得的GE11和LyP1两种靶向多肽分别与增强型绿色荧光蛋白在不同位置融合表达,通过原核系统表达纯化,将纯化的蛋白加入血清饥饿的SMMC-7721肝癌细胞株培养液中,处理3h,通过荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的情况检查融合多肽与细胞的结合情况。结果:绿色荧光蛋白的羧基端和GE11、LyP1多肽分别融合表达,处理细胞后,融合蛋白显示与细胞有很强的结合能力;当GE11、LyP1在绿色荧光蛋白氨基端融合时,融合蛋白几乎不能与细胞结合。在此基础上,检测了多种靶向肽对多种细胞的靶向效应。结论:不合适的融合策略会降低,甚至消除靶向多肽的结合能力;融合大分子量蛋白也会改变靶向肽的靶向效应。因此,当使用靶向多肽携带基因进行研究时,其在融合蛋白中的位置应该非常谨慎。     

TAT-EDAG融合蛋白的原核表达及其转导活性的研究

HIV-TAT蛋白转导域（PTD）是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,它能将与之连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞,转导效率高而对细胞没有损伤.构建了TAT-EDAG、TAT-GFP融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中实现了两种融合蛋白的可溶性原核表达,在非变性条件下进行蛋白纯化,获得了纯度在90%以上的融合蛋白.脱盐处理后,利用TAT-GFP转染体外培养的鼠成纤维细胞证实了TAT转导肽的生物活性;利用TAT-EDAG转染体外培养的HL-60细胞,Western blotting分析表明：TAT-EDAG可以导入HL-60细胞中.这为下一步应用于体外造血干细胞扩增研究奠定了基础.     

SUMO-TAT-Klf4融合蛋白的原核表达及纯化

Klf4是体细胞诱导成多能干细胞的重要转录因子之一,参与细胞增殖分化。本研究通过将小鼠Klf4基因、穿膜肽TAT以及小分子泛素样修饰蛋白SUMO融合并转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中进行表达,经PCR鉴定和酶切验证后,用IPTG诱导后表达出约78 k D的融合蛋白,利用Ni-NTA亲和层析胶纯化获得了高质量的SUMO-TAT-Klf4蛋白,使用Western blotting检测显示特异性良好。本研究成功构建了pET3c-SUMO-TAT-Klf4原核表达载体,有利于获得大量的Klf4蛋白,并以期提高其穿透细胞膜的能力,为后续利用重编程因子融合蛋白诱导体细胞成为iPS细胞奠定基础。     

TAT-PTD融合蛋白可能存在的跨膜递送作用机制

为探讨TAT-PTD融合蛋白的跨膜递送作用机制,采用DNA重组技术构建pGEX-TAT-GFP-表达质粒.在E.coli- BL21表达GST-TAT-GFP,并用谷胱甘肽(glutathione) Sepharose-4B亲和柱进行纯化.GST-TAT-GFP在不同条件下与细胞的作用结果表明,GST-TAT-GFP能有效进入HeLa、SMMC-7721、L-02和BEL-7402细胞,GST-TAT-GFP在递送时对时间和浓度有依赖关系.同时,温度对GST-TAT-GFP跨膜作用具有明显的影响,GST-TAT-GFP的跨膜作用受代谢抑制剂的影响很小,肝素的存在能明显抑制GST-TAT-GFP跨膜进入细胞的能力,GST-TAT-GFP对细胞活性没有影响.这些结果说明,TAT-PTD可能是通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素等受体相结合介导融合蛋白跨膜递送进入细胞的.     

TAT-mediated delivery of human glutamate dehydrogenase into PC12 cells

Human glutamate dehydrogenase (GDH) gene was fused with a gene fragment encoding the nine amino acid (RKKRRQRRR) protein transduction domain of human immunodeficiency virus TAT protein in bacterial expression vector to produce genetic in-frame TAT-GDH fusion protein. The TAT-GDH protein can enter PC12 cells efficiently when added exogenously in culture media as determined by Western blot analysis and enzyme activities. Once inside the cells, the transduced denatured TAT-GDH protein showed a full activity of GDH indicating that the TAT-GDH fusion protein was correctly refolded after delivery into cells and the activities of GDH in the TAT-GDH fusion protein was not affected by the addition of the TAT sequence. TAT-GDH fusion protein and TAT itself showed no cytotoxicity in PC12 cells. Although the exact mechanism of transduction across a membrane remains unclear, the transduction activity of TAT-GDH into PC12 cells may suggest new possibilities for direct delivery of GDH into the patients with the GDH-deficient disorders.     

HIV-1 TAT-mediated protein transduction and subcellular localization using novel expression vectors

Several novel prokaryotic and eukaryotic expression vectors were constructed for protein transduction and subcellular localization. These vectors employed an N-terminal stretch of 11 basic amino acid residues (47-57) from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) TAT protein transduction domain (PTD) for protein translocation and cellular localization. The vectors also contained a six-histidine (His(6)) tag at the N- or C-terminus for convenient purification and detection, and a multiple cloning site for easy insertion of foreign genes. Some heterologous genes including HSV-TK, Bcl-rambo, Smac/DIABLO and GFP were fused in-frame to TAT PTD and successfully overexpressed in Escherichia coli. The purified TAT-GFP fusion protein was able to transduce into the mammalian cells and was found to locate mainly in the cytosol when exogenously added to the cell culture medium. However, using a transfection system, mammalian-expressed TAT-GFP predominantly displayed a nuclear localization and nucleolar accumulation in mammalian cell lines. This discrepancy implies that the exact subcellular localization of transduced protein may depend on cell type, the nature of imported proteins and delivery approach. Taken together, our results demonstrate that a TAT PTD length of 11 amino acids was sufficient to confer protein internalization and its subsequent cellular localization. These novel properties allow these vectors to be useful for studying protein transduction and nuclear import.     

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:SARA/SBD是纤维化形成过程中的负性调节因子。原核表达、纯化含反式激活蛋白(TAT)蛋白转导域(PTD)的TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:将TAT PTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原核表达载体pET-44a(+)中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白;用人腹膜间皮细胞系(HPMC),通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力,及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况。结果:用基因工程方法表达和纯化了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化后,所获蛋白纯度高于95%(HPLC归一法);功能学实验结果显示该蛋白能穿过胞膜,主要定位于胞核,且与Smad2因子具有核内共定位。结论:表达了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,该蛋白具有生物学活性。