假单胞菌生物合成L-半胱氨酸途径中脱巯基酶的研究

通过PCR方法扩增得到假单胞菌TS1138L-半胱氨酸脱巯基酶基因（cd）,将其克隆至pBlueseript SKII载体,测定了含有L-半胱氨酸脱巯基酶基因的1．2kbDNA片段序列,并与其它菌株的脱巯基酶基因进行了同源性比较;同时,将其克隆至表达载体pET-21a（＋）,IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA柱亲合层析后,得到纯化的重组蛋白。利用脱巯基酶的活性染色方法对重组表达的L-半胱氨酸脱巯基酶进行了鉴定,并探讨了L-半胱氨酸脱巯基酶的酶学性质,以及在生物转化合成L-半胱氨酸途径中的关键作用。     

假单胞菌酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸

采用微生物酶转化法制备L-半胱氨酸具有周期短、成本低、区域和立体选择性强、反应条件容易控制、环境友好等特点,与传统的毛发水解以及化学合成工艺相比显示出明显的优越性。本文从假单胞菌产酶条件和酶学性质、DL-ATC生物转化途径、固定化细胞转化工艺、基因工程菌的研究、以及L-半胱氨酸脱巯基酶的研究等5个方面介绍了国内外关于生物转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)合成L-半胱氨酸的研究进展。     

微生物发酵法生产L-丝氨酸及L-半胱氨酸研究进展

L-丝氨酸及L-半胱氨酸在食品、医药和化妆品等行业有着广泛的应用,在植物和微生物中两者从头合成的前体物均为3-磷酸甘油酸。微生物发酵生产这两种氨基酸以其社会、经济及环境效益展现出良好的前景。针对近年来微生物发酵法生产L-丝氨酸及L-半胱氨酸的研究成果,本文综述了当前国内外学者在该领域研究的热点,即代谢途径及其调节、相关氨基酸的转运及运输、菌种及菌株改造、新菌种的开发等。最后结合当前生物技术的新发展,对今后的研究方向进行了展望。     

硫化氢前体L-半胱氨酸对结肠动力的影响及机制

本文旨在研究硫化氢(hydrogen sulfide, H_2S)前体L-半胱氨酸对大鼠结肠动力的影响,以阐明其对结肠收缩的调节作用及机制。采用免疫组织化学染色和免疫印迹实验检测内源性H_2S合成酶胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)和胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)在大鼠近端结肠的表达情况;采用生理记录仪检测结肠平滑肌收缩活动的变化;利用膜片钳实验检测结肠平滑肌细胞离子通道电流。结果显示,CBS和CSE在大鼠近端结肠黏膜层、平滑肌层及肌间神经丛均有表达;L-半胱氨酸以浓度依赖的方式抑制近端结肠纵行平滑肌收缩,H_2S合成酶抑制剂氨基氧乙酸(aminooxyacetateacid,AOAA)和炔丙基甘氨酸(propargylglycine, PAG)孵育纵行平滑肌后,L-半胱氨酸半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect, EC50)相比对照组显著下降(P 0.05);而L-半胱氨酸对结肠环形肌收缩具有抑制和促进双重调节作用,AOAA和PAG预处理可阻断其对环形肌的兴奋作用;H_2S外源性供体Na HS在低浓度时促进平滑肌细胞L型钙通道开放(P 0.01),而在高浓度时抑制L型钙通道电流(ICa,L)(P 0.05);与Na HS不同,L-半胱氨酸浓度依赖性抑制ICa,L (P 0.01);Na HS抑制大电导钙激活钾电流(IBKCa),而L-半胱氨酸对IBKCa无明显作用。以上结果提示,L-半胱氨酸对大鼠结肠平滑肌收缩具有潜在双重调节作用,其中抑制作用由L型钙通道介导,而促进作用可能是由内源性生成的H_2S介导。     

酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶促反应条件研究

目的:考察酶源保存方式、酶促反应时间、底物pH值、底物浓度、酶浓度、金属离子等因素对酶活力的影响。方法:以假单胞菌(Pseudomonassp.)TS1138为供试菌株,采用酸式茚三酮法测定L-半胱氨酸含量,研究了酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶促反应条件。结果:TS1138菌株中L-半胱氨酸脱巯基酶具有较高的活性,而且Mg2 、Mn2 、Fe2 、Zn2 、Cu2 等5种金属离子对DL-ATC水解酶酶系有不同程度的抑制,其中Cu2 对该酶系的抑制作用很大。结论:确定了TS1138菌株酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的最适酶促反应条件,为酶促反应动力学的研究奠定了基础。     

微生物酶法合成L-半胱氨酸和L-胱氨酸

从土壤中分离到一株假单胞菌Pseudomonas sp.TS1138菌株,其胞内含有DL-2-氨基-Δ²-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-Amino-Δ²-Thiazoling-4-Carboxylic Acid,缩写为DL-ATC)水解酶,以培养16h的细胞为酶源,可转化DL-ATC合成L-半胱氨酸。该菌株生长及产酶的最佳碳、氮源为葡萄糖和尿素,DL-ATC对酶的产生具有诱导作用。酶促反应后的产物经薄层层析、旋光度法和高效液相色谱鉴定为L-半胱氨酸。     

香菇基因组中L-半胱氨酸亚砜裂解酶同源蛋白的生物信息学分析

L-半胱氨酸亚砜裂解酶（L-cysteine sulfoxide lyase,C-S lyase）是香菇中含硫风味物质生物合成途径的关键酶之一。本文基于6个不同香菇菌株的全基因组测序数据,挖掘了24个潜在的香菇L-半胱氨酸亚砜裂解酶（Lentinula edodes C-S lyase,Lecsl）同源基因,对其编码蛋白的生理生化特性、信号肽、跨膜结构域、转录活性、分子进化、保守基序和蛋白三级结构等方面进行了分析。结果发现,这24个香菇Lecsl同源蛋白含有相同的蛋白结构域（IPR015424和IPR000192）,都属于L-半胱氨酸脱巯基酶家族（PTHR43092:SF2）,都不含信号肽和跨膜结构,但它们的蛋白稳定性有所不同。对24个Lecsl同源蛋白进行聚类分析发现,其中的11个组成了新的进化分支,这一分支的Lecsl同源蛋白在香菇的菌丝体或子实体中有转录活性,且含有蒜酶和L-半胱氨酸脱硫酶的保守基序19,推测这一分支的Lecsl同源蛋白在香菇中具有催化产生含硫风味物质和内源性甲醛的活性。进一步分析发现,这一分支又分为两个亚支,其中一支包含已发现的Lecsl/LE01_CSL1,并且在香菇的菌丝体和子实体阶段都有转录活性;另一个亚支上的C-S lyase同源蛋白仅在菌丝体中有转录活性,推测这两个亚支的L-半胱氨酸亚砜裂解酶分别在香菇生长发育的不同阶段发挥催化作用。通过三维结构的解析,阐明了Lecsl中保守基序19亦是使蒜酶产生催化活性的关键结构域,并且利用分子动力学模拟的方法,预测保守基序19中的Asn3、Gln5和Ser6是香菇C-S lyase产生催化活性的关键氨基酸残基。     

代谢工程改造L-半胱氨酸供给模块促地衣芽胞杆菌高效合成杆菌肽

杆菌肽是一种主要由芽胞杆菌产生的广谱性抗生素,目前作为兽药广泛应用于畜禽养殖领域.前体氨基酸供应不足可能是限制微生物发酵高产杆菌肽的重要因素.文中以杆菌肽工业生产菌株——地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis DW2为出发菌株,研究L-半胱氨酸供给模块强化对杆菌肽合成的影响.首先,构建了L-半胱氨酸合...     

Cloning, expression and characterization of L-cysteine desulfhydrase gene from Pseudomonas sp. TS1138

L-cysteine desulthydrase (CD) plays an important role in L-cysteine decomposition.To identify the CD gene in Pseudomonas sp.TS 1138 and investigate its effect on the L-cysteine biosynthetic pathway,the CD gene was cloned from Pseudomonas sp.TS 1138 by polymerase chain reaction (PCR) method.The nucleotide sequence of CD gene was determined to be 1,215 bp,and its homology with other sequences encoding CD was analyzed.Then the CD gene was subcloned into pET-21a(+) vector and expressed in Escherichia coli (E.coli) by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducement.The recombinant CD was purified by Ni-NTA His-Bind resin,and its activity was identified by the CD activity staining.The enzymatic properties of the recombinant CD were characterized and its critical role involved in the L-cysteine biosynthetic pathway was also discussed.     

Cloning, expression and characterization of L-cysteine desulfhydrase gene from Pseudomonas sp. TS1138

L-cysteine desulfhydrase (CD) plays an important role in L-cysteine decomposition. To identify the CD gene in Pseudomonas sp. TS1138 and investigate its effect on the L-cysteine biosynthetic pathway, the CD gene was cloned from Pseudomonas sp. TS1138 by polymerase chain reaction (PCR) method. The nucleotide sequence of CD gene was determined to be 1,215 bp, and its homology with other sequences encoding CD was analyzed. Then the CD gene was subcloned into pET-21a(+) vector and expressed in Escherichia coli (E. coli) by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducement. The recombinant CD was purified by Ni-NTA His-Bind resin, and its activity was identified by the CD activity staining. The enzymatic properties of the recombinant CD were characterized and its critical role involved in the L-cysteine biosynthetic pathway was also discussed. __________ Translated from Microbiology, 2006, 33(4): 21–26 [译自: 微生物学通报]     

南海南沙海域沉积物中可培养微生物及其多样性分析

【目的】为了从南沙海域中分离获得微生物菌种资源,【方法】本文通过沉积物采样、可培养菌分离及16S rRNA鉴定,【结果】从22个站点的沉积物样品中获得349株细菌,分属于87个种。发现产芽孢细菌分布最广,并在10个站点的分离株中占多数;它们是Bacillus,Halobacillus,Brevibacillus,Paenibacillus,Pontibacillus和Thalassobacillus。其中芽孢杆菌（Bacillus）无论在数量上还是种类上都最多,分别属于34种,其中有8个可能的新种。此外,g-Proteobacteria是分离率较高的另一亚群;其中,假单胞菌（Pseudomonas）,海杆菌（Marinobacter）,食烷菌（Alcanivorax）属的细菌最多。统计还发现,在深度750~2000 m之间,低GC含量的细菌最丰富,而深度2000 m以下,分离株则全部为g-Proteobacteria。【结论】南沙沉积物可培养微生物中产芽孢细菌及 g-Proteobacteria比较丰富;其中,产芽孢细菌的多样性最高,具有进一步研究开发价值。     

舟山群岛海域沉积物厌氧氨氧化细菌多样性

通过构建16S rRNA基因文库和克隆测序研究了舟山海域沉积物中厌氧氨氧化细菌(AAOB)的多样性。从5个克隆文库中共获得297条16S rRNA基因序列,包含16个操作分类单元(OTUs)。离岸距离较近的3个站具有相似的群落结构,且与离岸较远的2个站具有明显差异。系统发育结果显示,Scalindua属是该海域AAOB的优势类群,95.3%的序列与Scalindua属AAOB具有较近的亲缘关系;1条序列与Kuenenia属具有较近的亲缘关系;此外还有15条序列与已知的AAOB相似性较低。相关性分析表明沉积物有机碳含量与多样性指数具有显著正相关,可能是该海域AAOB多样性变化的重要影响因子。     

Diversity of thiosulfate-oxidizing bacteria from marine sediments and hydrothermal vents

Species diversity, phylogenetic affiliations, and environmental occurrence patterns of thiosulfate-oxidizing marine bacteria were investigated by using new isolates from serially diluted continental slope and deep-sea abyssal plain sediments collected off the coast of New England and strains cultured previously from Galapagos hydrothermal vent samples. The most frequently obtained new isolates, mostly from 10(3)- and 10(4)-fold dilutions of the continental slope sediment, oxidized thiosulfate to sulfate and fell into a distinct phylogenetic cluster of marine alpha-Proteobacteria. Phylogenetically and physiologically, these sediment strains resembled the sulfate-producing thiosulfate oxidizers from the Galapagos hydrothermal vents while showing habitat-related differences in growth temperature, rate and extent of thiosulfate utilization, and carbon substrate patterns. The abyssal deep-sea sediments yielded predominantly base-producing thiosulfate-oxidizing isolates related to Antarctic marine Psychroflexus species and other cold-water marine strains of the Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides phylum, in addition to gamma-proteobacterial isolates of the genera Pseudoalteromonas and Halomonas-Deleya. Bacterial thiosulfate oxidation is found in a wide phylogenetic spectrum of Flavobacteria and Proteobacteria.     

烟草可培养内生细菌的分离及多样性分析

采用稀释平板法, 从健康烟草的根、茎、叶组织中分离到267株内生细菌。利用细菌菌落表征性状和16S rRNA序列对这些分离物进行了多样性分析。通过数值分析比较了8个菌落形态表征性状, 以类平均连锁聚类法的方式进行聚类分析, 在2.15的水平上可分成5个聚类群和56个亚群。16S rDNA序列系统发育分析表明267株分离物可分为21个类群。研究表明同一菌落形态类型的菌株在系统发育树中不一定聚为一类, 菌落形态分类与分子生物学方法分类结果不完全一致。经克隆测序分析表明, 这267株分离物分别与GenBank中6类细菌中的21个已知种相似性达到98%?99%。其中芽孢杆菌属(Bacillus)细菌是烟草可培养内生细菌的优势种群。     

黑龙江大豆胞囊线虫胞囊可培养细菌多样性

【目的】了解黑龙江省大豆田大豆胞囊线虫胞囊可培养细菌的多样性。【方法】运用稀释平板法和16SrDNA基因序列的系统发育分析对胞囊可培养细菌多样性进行研究。【结果】用NA培养基从胞囊上分离90株具有不同菌落形态的细菌。16S rDNA序列分析结果表明:90株菌株分属于7个属22个种。46株属于变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria),32株属于厚壁菌门(Firmicutes),10株属于变形菌门β亚群(Betaproteobacteria),2株属于变形菌门ɑ亚群(Alphaproteobacteria)。假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属。【结果】黑龙江省大豆胞囊线虫胞囊中存在丰富的细菌物种多样性,这些细菌对大豆胞囊线虫可能具有一定的生理生态作用。     

第六次北极科学考察海洋沉积物可培养细菌的多样性分析

【目的】研究北极海洋沉积物可培养细菌的菌种资源多样性。【方法】采用海水Zobell2216E培养基和涂布平板法对第六次北极科学考察获得的海洋沉积物开展细菌分离培养,通过16S rRNA基因系统发育分析了解可培养细菌的多样性。【结果】根据菌落形态特征,从40个站位的北极海洋沉积物样品中共分离并获得16S rRNA基因有效序列的细菌达445株;基于16S rRNA基因的相似性分析与系统发育研究结果表明,分离获得的细菌分属于细菌域的4个门、6个纲、13个目、28个科、49个属、91个种,其中γ-Proteobacteria占大多数;有12株与模式菌株的16S rRNA基因序列相似性小于97%,可能代表了6个潜在的细菌新物种;此次获得的细菌种类组成与以往第五次北极科考获得的相比,在属水平上差异较大。【结论】北极海洋沉积物中存在着丰富的微生物菌种资源,具有很多新型微生物仍未被发现,是亟待开发的微生物资源宝库。