环介导等温扩增技术快速检测施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)

【背景】近年来,珊瑚白化事件频有发生,面临着严重衰退。由气候变化引起的珊瑚病原菌快速增殖是导致珊瑚白化的主要因素之一。施罗氏弧菌是枇杷珊瑚的致病菌,能侵入珊瑚虫体内而使珊瑚白化死亡。【目的】优化并建立一种钙黄绿素显色法快速检测珊瑚致病菌施罗氏弧菌的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplificaiton,LAMP)检测技术。【方法】以枇杷珊瑚致病菌施罗氏弧菌为研究对象,针对施罗氏弧菌的rpoD (RNA polymerase subunit D)基因设计6条特异性扩增引物,建立LAMP检测体系并检测其特异性和灵敏度,同时对LAMP法、常规PCR和荧光定量PCR3种检测方法进行比较分析。【结果】供检测的10个样品菌株中,施罗氏弧菌反应结果为阳性,呈亮绿色,其他9株包括阴性对照(灭菌水为模板)反应结果为阴性,呈浅橙黄色;同时,所建立的钙黄绿素-LAMP方法最低检测限度为3.641×10~3 cps/mL,具有与荧光定量PCR等同的灵敏度和准确性,是常规PCR最低检测限度的0.1%;此外,通过模拟野外海水样品检测发现,钙黄绿素-LAMP方法对海水样品中施罗氏弧菌的检测限度可达1.3×10~2 CFU/mL。【结论】建立的钙黄绿素-LAMP检测技术具有很好的特异性、灵敏度和准确性,其操作方法简单、方便,无需昂贵仪器,适用于野外现场珊瑚致病菌施罗氏弧菌的快速检测。     

食品中克罗诺杆菌属双重PCR检测试剂盒的评价

【背景】在食品安全领域,克罗诺杆菌属于需要重点监测的致病菌,当前随着分子检测相关技术的不断发展,研制有关食品中克罗诺杆菌简便、高效的检测产品至关重要。【目的】研制克罗诺杆菌检测的双重PCR检测试剂盒并评价其用于食品中克罗诺杆菌检测的实效性。【方法】优化双重PCR反应体系,反应试剂采用冻干工艺,确立了试剂盒组成,并评价其特异性、灵敏度、重复性、保质期等性能指标。【结果】克罗诺杆菌标准菌株和分离菌株均在目标位置出现两条明显条带,非克罗诺杆菌标准菌株和分离菌株均检测为阴性,纯基因组DNA检测灵敏度为2.3×10-1 ng/μL,纯培养菌检验限为3.2×104CFU/mL;对65份食品样品进行克罗诺杆菌检测,该试剂盒检测结果与标准方法检测结果一致性较高;批内、批间检测重复率均为100%,可在42°C环境放置120 h且其检测效力不受影响,4°C保质期可长达12个月。【结论】该试剂盒性能好,检测结果稳定、可靠,适用于食品中克罗诺杆菌的快速检测。     

环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测

【目的】探讨、优化基于环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的方法。【方法】在NCBI数据库中搜索获取志贺氏菌的特异性基因高度保守区,设计3对LAMP反应引物,建立、优化该LAMP可视化检测方法,并评价其特异性、灵敏度,同时与PCR检测方法和传统检测方法对比,进行结果统计分析。【结果】5株志贺氏菌标准菌株样品均检测为阳性,11株非志贺氏菌标准菌株样品均检测为阴性,无交叉反应。最低检验限为1.6×101 CFU/反应(或1.6×101 CFU/m L),且经比较,LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级。通过对161份实际样品和人工污染样品进行检测,LAMP检测与传统方法检测结果具有较高的一致性。【结论】LAMP具有检测过程快速简便、检测结果稳定、可靠的特点,适用于对常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的高效、快速检测需求。     

特异性三重PCR快速检测副溶血性弧菌

【目的】建立同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh、trh基因的三重PCR快速检测方法。【方法】将已报道的这3种基因的引物加入一个PCR反应管中,对引物浓度和退火温度进行优化,找到最佳引物比例和扩增条件。通过特异性验证、灵敏度验证以及方法间对比进行方法确认,其PCR产物使用全自动毛细管电泳分析系统进行分析。【结果】仅在91、269、485 bp处分别出现预期DNA扩增条带;纯培养条件下,扩增gyrase、tdh、trh的菌浓度检测限分别为6.6×101、6.6×102和6.6×101 CFU/mL;本底干扰物存在时,扩增gyrase、tdh、trh的菌浓度检测限分别为6.6×103、6.6×104和6.6×103 CFU/mL;模板DNA浓度检测限为1.36μg/L。检测进境海产品时,检测结果和FDA 2004标准结果一致,且更易辨认和判断。【结论】此检测方法的成功建立,为副溶血性弧菌及携带tdh和/或trh基因的致病性副溶血性弧菌的检测提供了一种准确、高效、便捷的分子技术手段。     

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种环介导等温扩增荧光方法的建立

【目的】建立一个基于环介导等温扩增与荧光探针结合的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)特异性检测方法。【方法】通过多重序列比对分析,选择B. gladioli pv. cocovenenans共有的bonA为靶位点,设计环介导等温扩增的特异性引物和荧光探针,通过19株B. gladioli和3株非目标菌株,验证该方法的特异性。将该方法的检测特异性与现有的基于实时荧光定量PCR鉴定B. gladioli pv. cocovenenans的方法进行比较,并对建立的方法进行灵敏度探究。【结果】建立的环介导等温扩增荧光鉴定方法对B. gladioli pv.cocovenenans具有特异性,能在30 min内得出结果,且该方法能进行可视化直接观测。该方法的基因组DNA最低检测限度为1.98pg/μL,检测灵敏度为2.7×10²CFU/mL。另外,该方法能应用到食品样品中B. gladioli pv. cocovenenans的检测。【结论】本研究建立了一个快速、可视化、特异性强的检测方...     

油气田土壤甲烷氧化菌实时荧光定量PCR检测技术的 建立与应用

【目的】建立快速检测甲烷氧化菌含量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术,用于油气微生物勘探。【方法】以含有甲烷氧化菌功能基因pmoA片段的重组质粒为标准品,优化实验条件,建立标准曲线,进行敏感性、重复性和特异性评价,并将该技术用于实际样品的检测。【结果】该技术标准曲线的相关系数R2为0.999 9,扩增效率为99.976%,检测范围为3.897×101-3.897×109 copies/μL,检出限约为40 copies/μL,重复性实验中CT值的变异系数优于3%,对12种非甲烷氧化菌均没有扩增,显示该技术具有很好的敏感性、重复性和特异性。利用该技术对气田、油田和非油气田土样进行了检测,发现气田具有明显的异常高值。【结论】为油气田的勘探建立了一种高效、特异、灵敏、准确的甲烷氧化菌荧光定量PCR检测技术,同时为其它指示菌检测技术的建立提供了参考。     

添加有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法

【目的】发掘副溶血弧菌特异性更强的检测靶点,并人工构建扩增内标,建立可以有效避免假阴性的新PCR检测体系。【方法】利用生物信息学方法,从副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)基因组DNA中发掘特异性很高的序列,并设计相应的特异性引物,人工构建扩增内标,建立PCR检测体系。【结果】本研究发掘得到的序列vp1332特异性很强,经检索,该序列是编码ABC转运子接合蛋白组分的基因片段,根据此序列设计一对特异检测引物(vp1332L/vp1332R),同时,构建了扩增内标,并建立了PCR检测体系。利用该体系对296株副溶血弧菌和33株非副溶血弧菌进行检测,结果显示,所有以副溶血弧菌为模板的PCR反应均可扩增到一条343bp的特异片段,而模板来源于非副溶血弧菌的则只能扩增到一条499bp的扩增内标片段。灵敏度实验表明,该PCR反应体系的检测灵敏度为1.6×102cfu/mL。人工污染实验表明,起始染菌量为1.24cfu/25g样品时经8h增菌,即可检测到副溶血弧菌。实际样品检测结果也证实该方法的有效性。【结论】本研究建立的PCR反应体系能特异地检测副溶血弧菌,并可有效地排除假阴性,提高检测准确率。     

四重PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法的建立

【目的】建立同时检测副溶血性弧菌tox R、tdh、trh、tlh基因的四重PCR快速检测方法。【方法】分别以副溶血性弧菌的tox R、tdh、trh、tlh 4个基因为靶基因,设计4对特异性引物,对4对引物浓度和退火温度进行优化,获得最佳引物比例和扩增条件,建立快速检测致病性副溶血性弧菌的四重PCR体系。通过特异性验证、灵敏度验证以及模拟样品检测进行方法确认。【结果】四重PCR体系扩增条带与预期相符,即115 bp(tox R)、244 bp(tdh)、418 bp(trh)、759 bp(tlh)4个目的条带;用74株副溶血性弧菌和37株非目标菌的测试结果表明,所建立的方法有良好的特异性。该方法对模板DNA的检测灵敏度为50μg/L,纯培养物的检测灵敏度为6.7×103 CFU/m L;副溶血性弧菌含量为1.36 CFU/g的人工模拟样品增菌6 h后,tox R、tlh、tdh、trh 4个基因可同时被检出。【结论】该方法可实现同时检测携带tox R、tdh、trh、tlh 4种基因的副溶血性弧菌,对开展致病性副溶血性弧菌的检测研究具有一定现实意义。     

水产品中创伤弧菌和副溶血弧菌 双重PCR检测方法的建立

目的建立一种同步检测创伤弧菌和副溶血弧菌的双重PCR方法。方法选择副溶血弧菌tlh基因和创伤弧菌vvhA基因作为靶序列各设计一对引物。用合成的引物对副溶血弧菌和创伤弧菌进行双重PCR扩增,确定特异性和最低检出限。然后用此方法对53株副溶血弧菌和7株创伤弧菌进行检测。结果确定了双重PCR检测创伤弧菌和副溶血弧菌的最优反应条件,其中退火温度为60℃,方法具有较好的特异性。对副溶血弧菌的最低限为1.0×10~2 CFU/mL,创伤弧菌最低限为4.2×10~4 CFU/mL。双重PCR对分离株检测符合率达100%。结论建立的双重PCR方法简便、快速、特异性好,可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌,为水产品中病原菌的基层检测提供解决方案。     

基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立

【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方法】样品DNA制备前经EMA渗透预处理, 再进行实时荧光定量PCR特异扩增菌体DNA。【结果】终浓度为2.0 mg/L的EMA能有效排除1.0×107 CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的DNA扩增均没有影响。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×100?5.0×104 CFU范围内时, 扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样品可在24 °C与4 °C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR方法能有效检测青枯菌VBNC细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌PCR检测的假阳性和假阴性。     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.     

杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展

杆状病毒是一类感染节肢动物的病原微生物,其基因组为双链环状DNA,大小为80～180kb.     

Inception of the Modern Public Health System in China and Perspectives for Effective Control of Emerging Infectious Diseases: In Commemoration of the 140th Anniversary of the Birth of the Plague Fighter Dr. Wu Lien-Teh

In this article, we systematically review Dr. Wu Lien-Teh's academic achievements and outstanding contributions in the prevention and control of the plague epidemic in northeast China and introduce the development of the earliest public health epidemic prevention system in China in order to commemorate the 140th anniversary of Dr. Wu Lien-Teh's birth. We hope that this article will provide insights into the effective prevention and control of emerging infectious diseases as well as the current worldwide pandemic of COVID-19, facilitating the improvement and development of public health systems in China and around the globe.