产超广谱β- 内酰胺酶肺炎克雷伯菌耐药性及其基因分型分析

目的:了解新疆独山子地区肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的发生率、作为指示剂的五种抗生素的检出情况及ESBLs主要基因型。方法:收集临床分离的148株肺炎克雷伯菌,采用双纸片协同筛选法、NCCLS推荐的表型筛选和确证试验对细菌进行ESBLs产酶株的识别;耐药基因的质粒重组、转化,聚合酶链反应(PCR)扩增阳性产物测序,通过GenBank对序确定基因型。结果:本地区肺炎克雷伯菌ESBLs的分离率达31.1%,头孢曲松(CRO)安曲南(ATM)和头孢噻肟(CTX)头孢泊肟(CPD)、头孢他定(CAZ)作为指示剂检出率分别为97.8%、95.6%、93.4%、76.0%、65.2%;本地区产ESBLs菌株耐药基因型CTX-M-22占54.3%,CTX-M-18占41.3%,TEM61.8%,52.1%的产ESBLs肺炎克雷伯菌SHV耐药基因阳性。结论:CRO、ATM和CTX对检测ESBLs阳性率较高;CTX-M-22、CTX-M-18是本地区产ESBLs菌株的主要基因型。     

噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染的研究进展

肺炎克雷伯菌是肠杆菌科家族中的一员,在各种环境中广泛存在,可导致诸如奶牛乳房炎在内的多种动物疫病,引起人类的肺炎、尿路感染、菌血症、伤口性感染和化脓性脓肿在内的多种临床感染。该菌对抗生素的耐受日趋严重,而且高毒力菌株不断出现,给该菌的防控带来了巨大挑战。噬菌体是一种裂解细菌的病毒,因其具有治疗耐药细菌感染的潜力而备受关注,世界各地均有使用噬菌体成功治疗耐药细菌感染的案例。本文基于国内外对肺炎克雷伯菌及其噬菌体的研究数据,综述了肺炎克雷伯菌的流行病学调查情况和噬菌体在治疗肺炎克雷伯菌感染方面的应用,以期为基于肺炎克雷伯菌噬菌体的抗菌研究和临床应用提供参考。     

一株新型牛源肺炎克雷伯菌噬菌体的分离鉴定

【背景】肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一种广泛分布于环境中的重要致病菌,该菌较高的耐药性致其在养殖业中治疗较为困难。【目的】分离一株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体,对分离株进行生物学特性鉴定和基因组学分析。【方法】使用双层平板法从四川省某奶牛场中分离、纯化出一株裂解性噬菌体,测定其裂解谱、热稳定性、酸碱耐受度、最佳感染复数及一步生长曲线等生物学特性,并进行全基因组的测序及注释分析。【结果】得到一株裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体vB_Kpn_B01,该噬菌体拥有透明且无晕环的噬菌斑,热稳定性较高,在极酸或极碱环境下不进行裂解活动,特异性较强,属长尾噬菌体科(Siphoviridae)。vB_Kpn_B01全基因组大小为113 227 bp,GC含量为47.97%。注释结果显示噬菌体拥有149个编码序列和25个tRNAs,不含耐药基因及毒力基因。通过噬菌体的进化树分析发现,该噬菌体为Sugarlandvirus。【结论】vB_Kpn_B01拥有高效的生长...     

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的检测及药敏分析

目的对3年间分离的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的肺炎克雷伯菌进行鉴定和药敏试验分析。方法采用1999年NCCLS建议的纸片扩散确证法,从76株肺炎克雷伯菌中分离出14抹产超广谱β-内酰胺酶细菌,检出率为18．4％。结果产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌对7种常用抗生素的药敏结果可以看出,亚胺培南对肺炎克雷伯菌作用最强,可作为治疗产ESBLs肺炎克雷伯菌感染的首选药物,敏感率高达86％,是控制感染的最有效的药物。其次为头孢哌酮／舒巴坦,敏感率达59．7％,也有一定的抗菌活性。结论产超广谱β-内酰胺酶检测对指导临床合理使用抗生素具有重要意义。     

噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染的研究进展

随着细菌的进化以及部分抗生素的滥用，耐药细菌的感染已成为21世纪主要的公共卫生挑战之一。其中，耐药肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)问题尤为突出。噬菌体在治疗耐药细菌感染引起的疾病方面展现出一定的潜力及独特优势，但目前噬菌体治疗尚缺乏统一的临床指导规范。虽然临床上有少数将噬菌体用于治疗肺炎克雷伯菌感染的成功案例，但多数情况下是采用噬菌体配合抗生素疗法，噬菌体在其中的作用仍不明确。本文综合评述国内外研究数据，回顾与噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染相关的数个重点问题，包括噬菌体的特性以及影响其疗效的因素，旨在为肺炎克雷伯菌和其他耐药细菌的噬菌体治疗提供参考。     

胶体纳米银对产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的抑制作用

目的探讨胶体纳米银对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的抑制作用。方法以产ESBLs肺炎克雷伯菌为研究对象,采用涂布法检测杀菌作用,肉汤微量稀释法测量最低抑菌浓度(MIC),电镜法观察胶体纳米银对产ESBLs肺炎克雷伯菌的作用机理。结果≥0.5μg/mL的胶体纳米银对产ESBLs的肺炎克雷伯菌具有100%杀菌作用;≥0.05μg/mL的胶体纳米银对产ESBLs的肺炎克雷伯菌也具有明显的杀菌作用;5μg/mL胶体纳米银对产ESBLs肺炎克雷伯菌5、15、30和60 min均有明显的杀菌作用;胶体纳米银对产ESBLs肺炎克雷伯菌的MIC为3.125μg/mL;不同因素对胶体纳米银的杀菌作用,蛋白因素影响显著(P0.05);胶体纳米银对产ESBLs肺炎克雷伯菌的形态学有明显影响。结论胶体纳米银对产ESBLs肺炎克雷伯菌具有明显的抑制作用,这些结果将为胶体纳米银的临床应用提供了实验依据。     

产超广谱β- 内酰胺酶肺炎克雷伯菌感染调查及耐药性分析

目的:探讨我院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌阳性率及耐药性的变化,以指导临床合理应用抗生素。方法:对我院自2009年1月至2011年8月住院患儿送检的各类标本中分离得到的肺炎克雷伯菌413株进行ESBLs筛选和确证。结果:共分离得到413株肺炎克雷伯菌,其中产ESBLs的菌株共204株,占49.39%,且有逐年上升趋势。ESBLs阳性菌株对头孢他啶、头孢噻吩、头孢噻肟、阿莫西林耐药程度最为严重,耐药率为100%;对美洛培南、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、环丙沙星高度敏感,敏感率为90.2%～100%。结论:产ESBLs的肺炎克雷伯菌已成为主要耐药菌,应加强耐药监测,重点监管并指导临床合理应用抗生素。     

儿科产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌感染现状及耐药性分析

目的研究吉林市2005年1月至2007年12月期间儿科产超广谱β－内酰胺酶（extended speetrurn β－lactamases,ESBLs）肺炎克雷伯菌感染现状及耐药性。方法按照CLSI／NCCLS2005年标准筛选确认ESBLs表型,采用琼脂纸片扩散法进行药敏试验。结果ESBLs总检出率为56．3％,3年检出率分别为2005年33．3％、2006年47．1％和2007年为57．1％。产ESBLs菌株全部表现为多重耐药,对氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛和头孢唑啉的耐药率达100％,对阿米卡星、头孢吡肟、头孢他啶和哌拉西林／他唑巴坦的耐药率低于50％,对头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南的耐药率逐年上升,发现对亚胺培南耐药菌株。结论吉林市儿科产ESBLs肺炎克雷伯菌检出率较高,临床治疗中应重视产ESBLs菌的监测,并动态监测其耐药性变迁,防止ESBLs肺炎克雷伯菌的传播。     

蓝莓提取物对产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的抑菌活性

【背景】随着细菌耐药性的增强,产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的出现严重危害食品安全和人体健康。蓝莓中含有丰富的多酚和花青素,是天然抗菌材料的优选。【目的】分析蓝莓提取物对3株产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的抑制活性及作用机制,并以牛乳为样品检测食品基质对蓝莓提取物抑菌活性的影响。【方法】利用甲醇制备巴尔德温和黑珍珠蓝莓提取物并检测提取物中总酚和花青素含量,利用纸片扩散法检测肺炎克雷伯菌的耐药性,利用最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)和生长曲线研究蓝莓提取物的抗菌活性,通过共聚焦激光扫描显微镜观察蓝莓提取物对细胞膜完整性的影响,并检测其在牛乳中的抑菌活性。【结果】巴尔德温和黑珍珠蓝莓提取物中的总酚含量分别为2.3 mg/g和3.5 mg/g,花青素含量分别为67.5 mg/100 g和92.5 mg/100 g。两种蓝莓提取物对肺炎克雷伯菌KP106、KP305和KP408的MIC均为25mg/mL,MBC均为50mg/mL。生长曲线表明...     

肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶基因检测及耐药性分析

目的 了解下呼吸道感染肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和质粒AmpC酶的产生情况及耐药性,研究AmpC酶的基因型别.方法 用纸片扩散确证法检测ESBLs;用酶提取三维试验检测AmpC酶,聚合酶链反应（PCR）扩增AmpC酶的基因,DNA序列测定检测AmpC酶的基因型;K-B法检测细菌耐药性.结果 58株下呼吸道感染肺炎克雷伯菌中ESBLs阳性21株,AmpC酶阳性5株,其中3株ESBLs和AmpC酶均阳性,5株AmpC酶阳性菌中,4株扩增出DHA基因,经测序均为DHA-1,1株扩增出MIR基因.产酶菌株的耐药性明显高于非产酶株.结论 肺炎克雷伯菌中ESBL＊s和AmpC酶均有较高的检出率,AmpC酶以DHA基因型为主.产ESBLs和AmpC酶是肺炎克雷伯菌耐药的主要原因.     

一株肺炎克雷伯菌噬菌体的生物学特性及全基因组分析

【背景】随着抗生素的广泛使用甚至滥用,细菌耐药性问题日益显著,利用噬菌体治疗耐药致病菌的方法重新开始被人们关注。【目的】对一株烈性肺炎克雷伯菌噬菌体vB_KpnP_IME279进行生物学特性研究及生物信息学分析。【方法】以一株多重耐药的肺炎克雷伯菌为宿主菌,从医院污水中分离噬菌体,应用双层平板法检测噬菌体效价、最佳感染复数(Optimal MOI)、一步生长曲线以及裂解谱,纯化后通过透射电镜观察噬菌体形态;应用蛋白酶K/SDS法提取噬菌体全基因组,使用Illumina MiSeq测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后对噬菌体全基因组序列进行组装、注释、进化和比较基因组学分析。【结果】分离到一株新的肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为vB_KpnP_IME279;其最佳感染复数为0.1,一步生长曲线显示潜伏期为20 min,平均裂解量140 PFU/cell,电镜观察显示该噬菌体属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。基因组测序表明,噬菌体基因组全长为42 518 bp,(G+C)mol%含量为59.3%。BLASTn比对结果表明,该噬菌体与目前已知噬菌体的相似性较低,基因组仅70%区域与已知噬菌体有同源性。构建噬菌体主要衣壳蛋白的基因进化树,分析了噬菌体IME279与其他短尾科噬菌体的进化关系,结果表明该噬菌体是短尾科噬菌体的一名新成员。【结论】分离鉴定了一株新的肺炎克雷伯菌噬菌体,进行了生物学特性、全基因组测序和生物信息学分析,为研究肺炎克雷伯菌噬菌体与宿主之间的相互作用关系以及治疗多重耐药细菌感染奠定了基础。     

肺炎克雷伯菌HdeA蛋白的抗酸理化性质鉴定

肺炎克雷伯菌是一种常见的院内条件致病菌,通常定植在人体的呼吸道和胃肠道。但肺炎克雷伯菌是怎样在胃液的强酸条件下存活并进入肠道尚不十分清楚。本研究发现,酸性条件能够诱导肺炎克雷伯菌KpHdeA基因表达上调。克隆KpHdeA基因并将其转化大肠杆菌,获得可溶性的KpHdeA蛋白并利用镍离子亲和层析纯化得到目的蛋白。光散射分析证明,酸性胁迫下,KpHdeA蛋白能够减少酸诱导的醇脱氢酶聚集。荧光实验证明,酸胁迫可以诱导KpHdeA蛋白的疏水基团暴露。圆二色谱实验证明,酸性条件能够诱导KpHdeA蛋白形成无序结构。此外KpHdeA蛋白的表达能提高大肠杆菌的耐酸能力。故推测,KpHdeA蛋白具有分子伴侣活性,并在肺炎克雷伯菌抵抗酸胁迫中起重要作用。     

A comparative study of induction of pneumonia in mice with planktonic and biofilm cells of Klebsiella pneumoniae

In the present study, the course of acute pneumonia in normal BALB/c mice infected by intranasal inoculation of planktonic and preformed biofilm cells (3 days old) of Klebsiella pneumoniae B5055 was studied and compared. With both cell forms the peak of infection was observed on the third post infection day, as assessed on the basis of lung bacterial load and corresponding pathology. There was an intense neutrophil infiltration in bronchoalveolar lavage fluid. Tissue damage was assessed on the basis of increased amounts of nitrite, malondialdehyde and lactate dehydrogenase in lung homogenates. The phagocytic potential of alveolar macrophages was lower in biofilm cell-induced infection than in that induced by planktonic cells. Biofilm cell induced infection generated significantly greater production of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β on the third and fifth days of infection, respectively. Production of interleukin-10 was, however, variable. There was no significant difference in the ability of planktonic and biofilm cell forms of K. pneumoniae to induce acute pneumonia in mice in terms of bacterial counts and histopathological changes. However, biofilm cell-induced infection showed delayed clearance as compared to infection induced with the planktonic form.     

一株新型裂解K63荚膜型肺炎克雷伯菌的噬菌体分离鉴定和生物学特性研究及全基因组分析

[背景]噬菌体具有特定的杀菌能力,对生态和细菌的进化具有重要影响。近年来由于多重耐药细菌的全球出现,噬菌体疗法逐渐引起了人们的关注。[目的]对一株新型裂解K63荚膜型肺炎克雷伯菌的噬菌体vB_KpnP_IME308进行生物学特性研究、测序和比较基因组学的分析。[方法]以一株从临床分离到的肺炎克雷伯菌为宿主菌分离噬菌体,应用双层平板法进行噬菌体最佳感染复数(optimal multiplicity of infection)、一步生长曲线(one-step growth curve)、温度以及pH敏感性实验测定,纯化噬菌体并通过透射电镜观察噬菌体形态;应用标准的苯酚-氯仿提取方案提取噬菌体全基因组,使用Illumina MiSeq测序平台进行噬菌体全基因组测序,测序后对噬菌体全基因组序列进行组装、注释、进化和比较基因组学分析。[结果]分离到一株新型的肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为vB_KpnP_IME308;其最佳感染复数为0.001,一步生长曲线结果显示,其感染宿主菌的潜伏期约为20 min,裂解期约为80 min,平均裂解量330PFU/cell;噬菌体vB_KpnP_IME308在4-50℃和pH 5.0-10.0范围内稳定;电镜观察该噬菌体属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。基因组测序结果表明,噬菌体基因组全长为43 091bp,(G+C)mol%含量为53.9%,(A+T)mol%含量为46.1%。BLASTn比对结果表明,该噬菌体与目前已知噬菌体基因组仅84%区域有相似性。噬菌体进化树结果表明该噬菌体属于Autographivirinae亚科的Drulisvirus属的成员。[结论]从医院污水中分离鉴定了一株新型的肺炎克雷伯菌噬菌体,表征并分析了噬菌体全基因组序列,这些结果均表明该噬菌体具有开发为抗肺炎克雷伯菌制剂的潜力,为噬菌体治疗多重耐药细菌感染奠定了基础。     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌血流感染危险因素及预后分析

目的 探讨碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌血流感染（CSKP）的危险因素以及影响患者28 d预后的相关因素。方法 回顾性分析我院2016年1月至2017年12月期间住院的肺炎克雷伯菌血流感染患者的临床病史资料,按患者血培养标本采集后28 d内预后情况分为存活组与死亡组,应用单因素分析及多因素Logistic回归分析探讨碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌血流感染的危险因素,应用Cox回归分析研究影响肺炎克雷伯菌血流感染28 d预后的相关因素。结果 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌血流感染的危险因素包括高APACHEⅡ评分、高Pitt菌血症评分、感染时入住ICU、感染前30 d内手术、有创操作、深静脉置管、有创机械通气、器官移植、使用免疫抑制剂、感染前3个月内入住ICU和感染前使用抗菌药物。Logistic回归分析显示高APACHEⅡ评分（OR=1.066,95% CI：1.027~1.107,P=0.001）、手术（OR=3.777,95% CI：1.816~7.855,P<0.001）、有创操作（OR=2.864,95% CI：1.303~6.295,P=0.009）、器官移植（OR=3.892,95% CI：1.553~9.752,P=0.004）、感染前使用抗菌药物（OR=5.626,95% CI：2.740~11.553,P<0.001）是发生碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌血流感染的独立危险因素。影响肺炎克雷伯菌血流感染28 d预后的相关因素有高APACHEⅡ评分、高Pitt菌血症评分、感染时入住ICU、感染前30 d内手术、有创操作、深静脉置管、有创机械通气、器官移植、感染前3个月内ICU入住史、使用抗菌药物、粒细胞缺乏、血液透析和菌株对碳青霉烯类耐药。Cox回归分析发现高APACHEⅡ评分（HR=1.061,95% CI：1.039~1.084,P<0.001）、有创操作（HR=2.505,95% CI：1.239~5.063,P=0.011）、入住ICU（HR=1.589,95% CI：1.042~2.424,P=0.031）是影响患者预后的独立危险因素。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）血流感染患者的28 d病死率明显高于碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌感染患者（χ2=41.612,P<0.001）。结论 高APACHEⅡ评分、手术、有创操作、器官移植、感染前使用抗菌药物可导致耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌血流感染的发生风险增加。CRKP血流感染患者死亡率显著高于CSKP感染者,但CRKP感染并非患者短期死亡的独立危险因素。而高APACHEⅡ评分、有创操作、入住ICU则可显著增加患者短期病死率。     

肺炎克雷伯杆菌疫苗中试生产中细菌培养工艺的改进及优化

目的中试生产中对肺炎克雷伯杆菌培养工艺进行改进及优化。方法采用液体综合培养基代替半综合培养基在10L和100L中国丽生物反应器中对肺炎克雷伯杆菌进行培养,在10L中国丽生物反应器探讨不同的培养基配方、pH值、培养温度、搅拌转速、溶氧,工艺参数稳定后,扩大培养到100L中国丽生物反应器,并探讨培养过程中补加葡萄糖的浓度及补加方式等对细菌浓度及荚膜多糖含量的影响。结果肺炎克雷伯杆菌液体综合培养基可代替半综合培养基用于该菌的培养,培养过程中维持pH值7．2、温度37℃、通气60L／h、搅拌转速250r／min、培养到2h时开始以恒速补加30mL／L40％葡萄糖溶液、培养时间为5h,细菌长势最好,收获的荚膜多糖含量最高。结论肺炎克雷伯杆菌的培养工艺放大到100L中国丽生物反应器中,经过多次试验初步建立了稳定的肺炎克雷伯杆菌中试培养工艺。     

Production of a novel bioflocculant MNXY1 by Klebsiella pneumoniae strain NY1 and application in precipitation of cyanobacteria and municipal wastewater treatment

Aims: To isolate and characterize the novel bioflocculant‐producing bacteria, to optimize the bioflocculant production and to evaluate its potential applications. Methods and Results: Klebsiella pneumoniae strain NY1, a bacterium that produces a novel bioflocculant (MNXY1), was selected on the chemically defined media. It was classified according to the 16S rRNA gene sequence, morphological and microscopic characteristics. MNXY1 was characterized to contain 26% protein and 66% total sugar. The constituent sugar monomers of MNXY1, revealed by NMR analysis, are glucose, galactose and quinovose. Favourable culture conditions for MNXY1 production were determined. Strain NY1 produces a high level (14.9 g l^?1) of MNXY1. MNXY1 is thermostable and tolerant to the extreme pH. It precipitated 54% of cyanobacteria from laboratory culture and 72% of the total suspended solids from raw wastewater. Conclusions: Strain NY1 was identified to produce a novel bioflocculant MNXY1. The outstanding performance of MNXY1 in practical applications and its availability in copious amounts make it attractive for further investigation and development for industrial scale applications. Significance and Impact of the Study: This is first report for the identification of a quinovose‐containing bioflocculant and application of a protein–polysaccharide complex bioflocculant in precipitation of cyanobacteria. These findings suggest that MNXY1 holds great potential for use in management of harmful algae and city wastewater treatment.     

多重耐药肺炎克雷伯菌噬菌体KP002的生物学特性及基因组学研究

以上海某些医院临床分离到的多重耐药肺炎克雷伯菌为宿主菌,从不同环境的污水中分离获得1株肺炎克雷伯菌噬菌体KP002。电子显微镜显示其为有尾噬菌体,头部直径约70nm,尾长约80nm,尾宽约20nm。对其生物学特性进行研究,结果显示此株噬菌体在pH 3~9及4~50℃的环境中具有较高活性;6min吸附率达95%以上;潜伏期为10min,爆发期为50min;裂解量为172pfu/cell。结果表明,该噬菌体对pH值和温度适应范围较宽。对其全基因组进行测序分析,结果显示其基因组为环状双链DNA,全长47 173bp,GC含量为48%。本研究筛选获得1株对pH值和温度适应范围较宽的耐药肺炎克雷伯菌烈性噬菌体KP002,为建立耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体库以用于治疗临床多重耐药菌感染提供了新的思路。