人碱性成纤维细胞生长因子基因克隆,cDNA5‘端修饰及在大 …

采用ｃＤＮＡ－ＰＣＲ技术,从人胎盘ｃＤＮＡ文库ＤＮＡ中克隆了人碱性成纤维在子（ｈｂＦＧＦ）基因,用ＰＣＲ突变法对其５＆端序列进行修饰,奖天然和修饰后的ｈｂＦＧＦ基因分别克隆至表达载体ｐＢＶ２２１,免疫抑迹和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果证明,经修饰后的基因在大肠杆菌ＤＳ５α中获得了表达,表达量占菌体总蛋白９％。     

耐热碱性磷酸酯酶的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

以pUC118质粒为载体,以E.coil TGl为受体,构建了产耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的菌株Thermus sp.FD3041的染色体基因文库。在包含1.2万个转化子的文库中,90％的转化子插入有3～10kb的外源DNA片段。用菌落原位碱性磷酸酯酶显色法从文库中筛选到5个阳性克隆。对其中的1个克隆(pTAP362)所产的TAP进行了研究,发现克隆的TAP与出发菌株所产的TAP的热稳定性、最适反应温度和最适pH等性质都相同。通过做物理图谱和测定部分缺失的质粒的TAP活性,将TAP基因定位于2kb的BamHⅠ-HindⅢ DNA片段上。模拟PCR实验表明该酶可用于PCR扩增产物的检出。     

碱性成纤维细胞生长因子的研究进展

碱性成纤维细胞生长因子是一种多肽细胞生长因子,具有广泛的生理功能。碱性成纤维细胞生长因子的研究近年来取得了迅速发展,尤其是基因的表达及临床应用等方面。本文就该生长因子基因的克隆和表达,生物功能及临床应用研究进展作一概述。     

大肠杆菌可溶性表达人碱性成纤维细胞生长因子的研究

包涵体的形成与外源基因在大肠杆菌中的表达量高度相关,在适当的范围内,降低hbFGF在表达宿主BL21(DE3)plysS中的表达,成为实现高可溶性表达的关键。在不改变氨基酸序列的条件下,对hbFGF高表达菌株突变重组子起始密码ATG下游前3个密码子的摇摆碱基进行随机回复突变,共有7种组合,合成引物PCR扩增后,克隆至表达载体pET3c, 将重组子转导BL21(DE3)plysS后,IPTG诱导表达,发现其中1株有较高可溶性和活性的菌株。可见部分降低外源蛋白的表达量可以避免与减少包涵体的形成。     

碱性成纤维细胞生长因子的研究进展

碱性成纤维细胞生长因子是一种多肽细胞生长因子,具有广泛的生理功能。碱性成纤维细胞生长因子的研究近年来取得了迅速发展,尤其是基因的表达及临床应用等方面。本文就该生长因子基因的克隆和表达、生物功能及临床应用研究进展作一概述。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的高效表达*

利用基因改造的方法可以优化外源基因在大肠杆菌中的表达。利用逆转录PCR技术从原代培养的人成纤维细胞中克隆出人碱性成纤维细胞生长因子基因,在不改变氨基酸序列的前提下对该基因的上游部分序列进行改造,并将其插入表达载体pET-3c,转入大肠杆菌阳BL21（DE3）,IPTG诱导表达,表达蛋白占菌体总蛋白的30％以上,并具有良好的生物活性。     

人酸性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用Ncol Ⅰ和EcoRI双酶酶切,获得人酸性成纤维细胞生长因子haFGF基因,将该基因片断连接进入pBV220的EcoRI位点。连接物转化入大肠杆菌RR1,用菌落原位杂交的方法筛选出杂交阳性菌株,用酶切和Southern Blot的方法确定haFGF的插入与否以及插入方向的正反,结果我们得到了haFGF正向插入在pBV220 PLPR启动子下游的重组质粒pBV-αFGF。42℃热诱导使重组子表达,其菌体的裂解液对3T3细胞的DNA合成有较强的促进作用,说明重组菌株能够表达具有生物活性的hαFGF。SDS-PAGE结果表明,hαFGF表达产物约占菌体总蛋白的15％。hαFGF表达产物以包涵体的形式存在。     

人甲状旁腺激素的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

人甲状旁腺激素(Hon,an parathyroid hormone hPTH)是84个氨基酸组成的多肽激素。从人甲状旁腺肿瘤组织分离纯化总RNA．其mRNA逆转录得cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增得hPTH基因。将该基因克隆到表达载体pBV220上,转化大肠杆菌DH5n细胞,获得了表达。细胞抽提液1000倍稀释后hPTH的放免活性265,77ng／dl,为对照的480倍。表达产物粗分离后经Resource-s阳离子柱进行了分离．对活性峰进行了MALDI质谱分析及HPLCC18反相柱分析。     

人碱性成纤维细胞生长因子突变体的高效表达

用PCR法将人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因中编码第25、69和92位的半胱氨酸(Cys)密码子突变为丝氨酸(Ser)密码子,将突变的hbFGFcDNA片断与表达质粒pET3c连接,构建重组质粒pET3chbFGFSer25,69,92。hbFGFSer25,69,92在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量大于30%。通过阳离子交换和肝素亲和层析两步纯化,得到纯度大于95%的hbFGFSer25,69,92。MTT法测定纯化的产物活性表明,hbFGFSer25,69,92突变体促Balb/c细胞增殖的活性与野生型hbFGF相当,为下一步对hbFGFSer25,69,92突变体进行定点化学修饰打下了基础。     

香菇C91-3菌凋亡相关基因24414功能域片段原核表达载体的构建

目的构建高效快速且方便的His-标签原核表达体系,对香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域进行克隆。方法根据香菇C91-3凋亡相关基因24414的基因序列,分别设计特异性上下游引物,采用PCR方法,以24414基因序列为模板,扩增出24414基因的功能域序列。并将功能域基因连入pMD19-TSimpleVector克隆载体中,进行蓝白斑筛选,挑选出阳性菌落,提取质粒经双酶切及PCR验证后,进行基因测序。将克隆载体上目的基因连入pET-32a原核表达载体,构建重组质粒。转化入E．coli JM109宿主菌,经双酶切验证后,进一步测序鉴定验证重组质粒。结果PCR扩增出大小为747bp的基因片段,测序结果显示与香菇C91-3,凋亡相关基因24414的功能域片段同源性为100％,并成功构建了原核表达体系。结论重组原核表达载体pET-32a-24414的成功构建为进一步研究香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域的表达纯化及生物学活性奠定了基础。     

K-Cl cotransporter gene expression during human and murine erythroid differentiation

The K-Cl cotransporter (KCC) regulates red blood cell (RBC) volume, especially in reticulocytes. Western blot analysis of RBC membranes revealed KCC1, KCC3, and KCC4 proteins in mouse and human cells, with higher levels in reticulocytes. KCC content was higher in sickle versus normal RBC, but the correlation with reticulocyte count was poor, with inter-individual variability in KCC isoform ratios. Messenger RNA for each isoform was measured by real time RT-quantitative PCR. In human reticulocytes, KCC3a mRNA levels were consistently the highest, 1-7-fold higher than KCC4, the second most abundant species. Message levels for KCC1 and KCC3b were low. The ratios of KCC RNA levels varied among individuals but were similar in sickle and normal RBC. During in vivo maturation of human erythroblasts, KCC3a RNA was expressed consistently, whereas KCC1 and KCC3b levels declined, and KCC4 message first increased and then decreased. In mouse erythroblasts, a similar pattern for KCC3 and KCC1 expression during in vivo differentiation was observed, with low KCC4 RNA throughout despite the presence of KCC4 protein in mature RBC. During differentiation of mouse erythroleukemia cells, protein levels of KCCs paralleled increasing mRNA levels. Functional properties of KCCs expressed in HEK293 cells were similar to each other and to those in human RBC. However, the anion dependence of KCC in RBC resembled most closely that of KCC3. The results suggest that KCC3 is the dominant isoform in erythrocytes, with variable expression of KCC1 and KCC4 among individuals that could result in modulation of KCC activity.     

CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达

目的：研究CPSF在真核表达载体上的克隆与瞬时表达。方法：以质粒pBS1761为模板扩增TAP-tag片段,PCR产物经纯化后克隆在真核表达载体pTRE2-hyg上。再以pUK-CPSF30k、73k、100k为模板扩增CPSF基因片段,将其克隆在质粒pTRE2-hyg-TAP-tag中TAP-tag片段的下游,并将重组质粒转化入细胞株Hela Tet-offS3细胞内。结果：细胞抽提液经SDS PAGE电泳后进行蛋白质印迹杂交,胶片上出现野生型的CPSF条带和分子量较大的滞后条带。后者经分子量与分子标记对照,确系重组体TAP-tag-CPSF所表达的蛋白条带。结论：重组质粒pTRE2hyg-TAP-tag-CPSF30k,73k,100k在Hela tet-offS3内完好表达。     

中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定

构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件。使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的pET-30a载体中;转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。用抗HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定。结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白。测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69％-92．7％及88．8％-96．8％之间。在最佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),最高表达量占菌体蛋白18．9％。Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶。HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型奠定了基础。     

The human adenocarcinoma-associated gene, AGR2, induces expression of amphiregulin through Hippo pathway co-activator YAP1 activation

Anterior Gradient Homolog 2 (AGR2) is expressed by the normal intestine and by most human adenocarcinomas, including those derived from the esophagus, pancreas, lung, breast, ovary, and prostate. Xenografts of human adenocarcinoma cell lines in nude mice previously demonstrated that AGR2 supports tumor growth. In addition, AGR2 is able to induce in vitro a transformed phenotype in fibroblast and epithelial cell lines. The mechanism underlying the growth promoting effects of AGR2 is unknown. The present study shows that AGR2 induces expression of amphiregulin (AREG), a growth promoting EGFR ligand. Induced AREG expression in adenocarcinoma cells is able to rescue the transformed phenotype that is lost when AGR2 expression is reduced. Additional experiments demonstrate that AGR2 induction of AREG is mediated by activation of the Hippo signaling pathway co-activator, YAP1. Thus AGR2 promotes growth by regulating the Hippo and EGF receptor signaling pathways.     

广东虫草邻氨基苯甲酸合酶基因克隆及不同实验条件下的表达

【背景】邻氨基苯甲酸合酶(TrpE)广泛存在于植物和微生物中,参与色氨酸和生长素的生物合成,在生长发育及胁迫响应过程中具有重要的作用。广东虫草(Tolypocladium guangdongense)是华南地区特有的一种极具开发价值的虫草资源。【目的】明确TgtrpE基因特征,并探究该基因在不同发育时期和不同温度下的表达模式。【方法】从广东虫草中克隆TgtrpE编码区序列,并进行生物信息分析和系统发育分析,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析TgtrpE在广东虫草中不同发育时期及温度胁迫下的表达模式。【结果】TgtrpE编码区序列长度为1613bp(DNA)和1563bp(cDNA),编码521个氨基酸,预测其蛋白分子量约为56.86kD。系统发育分析显示,TgTrpE蛋白与子囊菌中的TrpE蛋白聚为一个分支,与奇异弯颈霉(Tolypocladiumparadoxum)和头状弯颈霉(Tolypocladiumcapitatum)具有较高的相似性。RT-qPCR结果表明:在广东虫草原基和幼嫩子实体的发育过程中,TgtrpE显著上调,而在成熟子实体期该基因显著下调;在温度胁迫过程中,TgtrpE显著下调表达。【结论】TgtrpE可能在广东虫草原基形成、子实体发育及温度胁迫响应过程中具有重要调控作用。     

富集液中六六六（γ-BHC）脱氯基因的克隆、表达及降解试验

从长期受六六六污染的土壤中获得高效降解六六六的富集液 ,其对六六六 4种异构体的降解效果均为10 0 % ,但至今未能获得纯培养。根据国外报道的六六六脱氯基因linA序列 ,设计并合成一对引物 ,通过PCR技术从富集液总DNA中扩增了 4 71bp的基因片段 ,命名为linN ,测序结果表明linN与报道的脱氯基因linA和linA2的同源性达 99% ,与linA1的同源性达 97%。将linN定向克隆到pET 2 9α表达载体中 ,转化至E .coliBL2 1,经IPTG诱导后可表达分子量约 17kD的蛋白 ,表达产物占菌体总蛋白的 30 %左右 ;诱导后转化子的降解能力明显提高 ,粗酶也有很好的降解效果 ,为进一步分离纯培养和构建多功能农药残留降解菌提供了基础     

非洲爪蟾中一种长型肽聚糖识别蛋白的克隆与表达分析(英文)

肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是固有免疫系统中一类重要的模式识别受体。该文首次从两栖类模式生物-非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)中克隆得到了一个长型PGRP(XtPGRP-L)基因。XtPGRP-L具有5个外显子和4个内含子的基因组结构,该结构在进化的过程中比较保守。序列比对与系统进化分析显示XtPGRP-L具有保守的酰胺酶活性位点。蛋白质建模显示XtPGRP-L拥有保守的3-D结构。实时定量PCR检测显示,XtPGRP-L在非洲爪蟾胚胎早期不表达,到72h蝌蚪期开始表达。在成体的肝脏、肺、肠和胃高表达。同时,在LPS刺激后,XtPGRP-L在肝脏、肠和胃中呈明显上调表达。结果表明,XtPGRP-L在非洲爪蟾固有免疫系统中可能具有重要的作用。