人eNOS复制缺陷型重组腺病毒的构建

目的:构建以巨型细胞病毒(CMV)为启动子的heNCS重组腺病毒转移载体.方法和结果:将heNOS cDNA全长亚克隆到穿梭质粒启动子CMV的下游,通过I-Ceu Ⅰ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得重组腺病毒质粒DNA(pAdeno-heNOS),后者经限制性内切酶PacⅠ切割,利用脂质体转染法获得heNOS重组腺病毒.PCR双引物法鉴定是否成功构建heNCS重组腺病毒.结论:PCR双引物检测含有heNOS片段,表明成功构建了heNOS重组腺病毒转移载体AdhCMV-heNOS.     

大黄鱼MSTN成熟肽区基因的原核表达

根据本实验室克隆的大黄鱼肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物,通过RT-PCR法扩增大黄鱼MSTN成熟肽区域的基因,将目的片段插入pMD18-T克隆质粒,并测序验证。验证后用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切含目的片段的pMD18-T克隆质粒和pET-28 a表达质粒,构建MSTN-pET-28 a重组表达质粒。将重组表达质粒转化至BL21菌中,经IPTG诱导后表达蛋白的大小约17 kD。     

基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体的构建

目的：制备基于XcmⅠ酶切的高效TA克隆载体,并检测其克隆PCR产物的效果。方法：设计一对互补配对的寡核苷酸,经过变性及退火后插入质粒pUC19的多克隆位点,从而在该多克隆位点中引入2个XcmⅠ酶切位点,用XcmⅠ酶切后即获得含有3’突出T碱基的T载体;为了提高该T载体的克隆效率,优化了2个XcmⅠ酶切位点之间的碱基数目,排除了载体自连产生白色克隆的可能性,使假阳性大大减少;此外,为了便于完全酶切与未完全酶切载体的分离,在2个XcmⅠ之间插入了一段无关DNA片段。结果：改进得到的T载体可以有效克隆PCR产物,其阳性克隆率可达95％。结论：构建了基于XcmⅠ酶切的TA克隆载体,经过改进的T载体具有很高的克隆效率。     

棉铃虫核多角体病毒进化保守性基因iap2基因表达载体的构建及表达

分析棉铃虫核多角体病毒基因组 ,结合GenBank中已知的序列 ,发现iap2基因位于其基因组的BamHⅠ F片段上 ,回收此片段作为模板 ,设计引物 ,通过PCR扩增得到了抗细胞凋亡基因iap2的DNA片段。将扩增产物克隆到pGEM T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到表达载体pET 2 8a上 ,构建了重组质粒pET iap2。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的DNA序列与所发表序列完全相同。含重组质粒pET iap2的大肠杆菌BL2 1 (DE3)表达了抗细胞凋亡蛋白IAP2。     

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。     

甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因原核表达载体的构建与表达

目的:用原核表达的方法获取大量带6个His标记的甘蔗花叶病毒E株系(ScMV-E)外壳蛋白(CP)。方法:用带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的特异引物,以带有多个基因的重组质粒pNUSCP为模板,扩增出片段长度为942bp的ScMV-E外壳蛋白基因,亚克隆到pMD18-T载体上,转化E.coliDH5α,经双酶切检测获得阳性克隆。BamHⅠ和SalⅠ双酶切阳性克隆质粒,回收目的片段ScMV-E的CP基因。把目的片段插入表达载体pET29a( ),转化E.coliBL21(DE3),测序。结果:阳性质粒pET29a-CP在E.coliBL21(DE3)中得到大量特异表达。SDS-PAGE分析表明,该蛋白的相对分子质量约36000,与预测一致。结论:以上方法可以得到带6个His标记的目的蛋白,有利于纯化并获取高纯度的ScMV-E的外壳蛋白。     

人RHD基因的克隆和鉴定

目的克隆人RHD基因,并对其进行鉴定。方法以RhD阳性志愿者骨髓为材料,用TRIzol试剂提取总RNA;设计、合成人RHD基因扩增引物,RT-PCR方法扩增RHD基因片段;T／A克隆后将其亚克隆人pET28a（＋）载体中,经酶切、PCR和测序对重组质粒进行鉴定。结果骨髓总RNA被成功提取;RT-PCR成功扩增出RHD基因片段,其大小与预期约509bp基本一致;T／A克隆后再将其亚克隆,通过酶切和PCR证明RHD基因成功亚克隆入pET28a（＋）载体中;基因测序结果比对显示,与已公布的RHD基因（GenBank登录号为NM016124）序列基本一致,同源性为98％。结论成功克隆了RHD基因,这将为进一步研究奠定基础。     

限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺

目前有关限制性内切酶NotⅠ的性质特征及功能机制等方面的研究日渐增多,但商品化NotⅠ及某些限制性内切酶的价格依然居高不下,其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在。为探索限制性内切酶NotⅠ提纯的新工艺,从豚鼠耳炎诺卡菌(Nocardia otitidis-caviarum)中克隆出限制性内切酶NotⅠ的基因并使之在大肠杆菌中高效表达。首先将由成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)中克隆所得甲基化酶EagⅠM(EagⅠ methylase gene)基因连接到pBR322载体上,转化大肠杆菌ER2566,将豚鼠耳炎诺卡菌中克隆所得的限制性内切酶NotⅠR(NotⅠrestriction endonuclease gene)基因连接到表达载体pACYC184-PT₇上,将此重组质粒转化到上述已转入甲基化重组质粒pBR322-EagⅠM的ER2566中,构建成NotⅠ蛋白表达菌ER2566 。重组工程菌经IPTG诱导可表达限制性内切酶NotⅠ,并对诱导条件进行优化使之以可溶形式高效表达。应用KTA purifier 100蛋白纯化系统,对纯化工艺进行创新,通过DEAE Sephrose FF离子交换层析、phenyl HP疏水层析和Superdex 75 10/300 GL分子筛层析对蛋白进行提纯。纯化后NotⅠ经酶活力及纯度鉴定,其比活力为1.37×10⁶U/mg,提纯35倍,得率为17.8％,产量达9.8×10⁶ Units /g wet cell,提纯时间缩减为原来的1/10,在产量和效率上较以前报道均有很大提高。该纯化工艺的新方法,为实验室制备及工业化生产Ⅱ型限制性内切酶提供了进一步的借鉴。且该酶的成功获得为后续研究提供了材料,为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考。     

LB克隆系统的构建及在鞘氨醇单胞菌基因融合表达中的应用

为摆脱限制性酶切位点不足的限制,构建可灵活改变多基因融合方向的表达载体,基于ⅡS型和ⅡT型限制性内切酶LguⅠ和BbvC Ⅰ设计开发了 LB克隆系统.该克隆系统是以广宿主质粒pBBR1MCS-3为初始载体,利用 PCR的方法,在其多克隆位点区插入LB片段(GCTCTTCCTCAGC)构建得到的.LB片段含Lgu Ⅰ和B...     

限制性内切酶介导的重叠延伸在人环氧合酶-1(COX-1)基因克隆中的应用

建立一种用于克隆全长基因的、限制性内切酶介导的重叠延伸法 .对全长基因进行分段扩增 ,并利用适当的限制性内切酶对基因序列内相应的限制性位点进行酶切 ,从而使分段扩增片段得以重叠并互为模板 ,在DNA聚合酶的作用下延伸获得全长基因 .将环氧合酶 1 (COX 1 )基因的外显子 9巧妙地拼接到了缺失外显子 9的COX 1cDNA片段中 ,获得了COX 1基因的全长cDNA .该方法分 3步进行 .首先 ,通过RT PCR分别扩增跨外显子 9的cDNA片段和缺失外显子 9的cDNA片段 ,并克隆到pMD1 8 T载体上 ;其次 ,PCR扩增外显子 9片段 ,限制性内切酶StuI酶切缺失外显子9cDNA片段的重组质粒 ,二者以一定的比例混合 ,互为模板 ,在pfuDNA聚合酶的作用下进行延伸 ,从而产生一个双链的DNA分子 .最后 ,以延伸产物为模板 ,用COX 1cDNA两端的引物进行PCR扩增 ,产生包含外显子 9的COX 1基因的全长cDNA .这种限制性内切酶介导的重叠延伸方法 ,对于克隆mRNA剪接水平上受调控的基因尤为有用 ,同时也为基因的重组和修饰提供一个新的思路     

重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ用pET_(31)b载体的表达和纯化

化学全合成虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )基因在大肠杆菌中被表达 ,采用pET31b载体 ,表达产物N端为大肠杆菌酮基立体异构酶的融合蛋白 ,经亲和连续 6个组氨酸的亲和柱层析后 ,溴化氰切割融合蛋白 ,再经高效液相色谱反相柱纯化 ,得到了重组虎纹捕鸟蛛毒素Ⅰ .质谱分析及N端测序表明 ,rHWTX Ⅰ系正确表达产物 .还原复性的rHWTX Ⅰ表现出与天然HWTX Ⅰ一致的生物学活性     

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒.酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子.重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100％相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带.     

牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB51成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。通过TA克隆技术,将PCR产物克隆至pGEMT Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEMT51。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEMT51和pET28a(+),并将纯化的MPB51基因亚克隆至pET28a (+)中,构建出原核表达质粒pET28a51。将pET28a51转化至感受态E.coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导和SDSPAGE分析,可见约30kD外源蛋白带。Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB51的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。     

人工锌指核酸酶的设计与表达纯化

设计表达了四个锌指核酸酶,用于切断人基因组中的rRNA基因家族的内部转录间隔序列,造成双链断裂,以此提高针对多位点基因打靶的效率,为后续基因打靶应用于基因治疗研究奠定基础。首先,在人rRNA基因家族ITS1序列中找到两个合适的9 bp长的序列(中间间隔6 bp)为锌指蛋白识别位点,根据识别位点序列每个位点分别设计两个三锌指蛋白。通过设计引物进行重叠延伸PCR得到全长编码锌指蛋白的DNA,分别克隆到表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒pET28a-ZFP,转化大肠杆菌RossettaTM（DE3）,实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与纯化。同时,将限制性内切酶Fok I的切割结构域分别与四个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆到表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒pET28a-ZFN,转化到大肠杆菌RossettaTM（DE3）,实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。     

Cloning and expression of Mycobacterium bovis secreted protein MPB83 in Escherichia coli

The gene encoding MPB83 from Mycobacterium bovis Vallee111 chromosomal DNA was amplified by using polymerase chain reaction (PCR) technique, and the PCR product was approximately 600bp DNA segment. Using TA cloning technique, the PCR product was cloned into pGEM-T vector and the cloning plasmid pGEM-T-83 was constructed successfully. pGEM-T-83 and pET28a(+) were digested by BamHI and EcoRI double enzymes. The purified MPB83 gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-83 was constructed. Plasmid containing pET28a-83 was transformed into competence Escherichia coli BL21 (DE3). The bacterium was induced by isopropyl-Beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and its lysates were loaded directly onto sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), approximately 26 kDa exogenous protein was observed on the SDS-PAGE. The protein was analyzed using Western-blotting. The results indicated that the protein was of antigenic activity of M.bovis. The results were expected to lay foundation for further studies on the subunit vaccine and DNA vaccine of MPB83 gene in their prevention against bovine tuberculosis.     

果胶裂解酶基因PelC表达载体的构建及原核表达分析

从实验室分离保存的1株产果胶酶的菌株（BTC105）中克隆果胶裂解酶基因（PelC）完整开放阅读框,通过载体构建,将目的基因连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希茵BL21（DE3）进行融合表达,在LB（Luria—Bertani）中进行摇瓶发酵,1mmol／LIPTG（异丙基－β－D－硫代半乳糖苷）诱导。结果表明,拘建了表达载俸pET28a－felC,果胶裂解酶主要在胞内表达,酶活最适pH为5．4,最适温度为50℃,Ca^2＋对酶活促进作用最为明显,Cu^2＋完全抑制了酶的活性。     

蜘蛛大壶状腺丝蛋白基因的克隆和原核表达

以悦目金蛛(Argiope amoena)丝腺SMARTRACEcDNA文库为模板进行RT-PCR,克隆了1条大壶状腺丝蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)基因cDNA序列。该条cDNA序列编码的氨基酸序列可区分为两部分(1)富含丙氨酸的片段和富含甘氨酸的片段相间排列构成的重复氨基酸序列区,并且富含甘氨酸的片段中有脯氨酸分布;(2)约100个氨基酸残基组成的C末端非重复氨基酸序列区。把MaSp基因cDNA序列亚克隆到质粒pET28b( )中,构建原核表达质粒pET28b( )-MaSp,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、氨基酸组成测定和N末端氨基酸序列测定的结果表明,表达产物为重组MaSp,表达量约为40mg/L。还对C末端非重复氨基酸序列对重组MaSp在水媒介中溶解性的影响进行了探讨。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株单加氧酶基因的克隆与表达

构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株荧光素样单加氧酶基因表达克隆载体,并进行融合表达。PCR扩增出嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株基因组DNA中包含单加氧酶基因约1300bp的核酸片段,将其克隆到T载体pMD-18中进行序列测定,所得序列申请并获得GenBank登记号(GQ122330)。DNA star软件分析发现该基因片段中含有一个996bp的完整开放读码框架(ORF),与GenBank中收录的S.maltophilia R551-3(CP001111/GenomeProject17107)和K279a(AM743169)的MO基因核酸序列同源性分别为90%和89%,氨基酸序列同源性分别为93%和90%。根据该ORF序列设计分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的表达克隆扩增引物,PCR扩增、双酶切后将产物亚克隆到pET32a载体中,经过双酶切验证,证实成功获得了表达重组载体pET32a/MO;将其转化宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导后成功表达出54.2ku的MO融合蛋白,为该酶进一步的功能研究和开发奠定了基础。     

一株Sanguibacter sp.C4产几丁质酶基因的克隆与表达

Chi58是Sanguibacter sp．strain C4产生的一种胞外几丁质酶。通过chiA的特异性PCR引物探测到菌株C4中存在几丁质酶,并将扩增到的几丁质酶基因片段（chiA-F）克隆、测序后,提交GenBank数据库进行同源性搜索。对从GenBank中获得的高同源性序列进行比对,并根据保守区域设计2对PCR引物进行嵌套PCR,扩增出Chi58基因的开放阅读框（ORF）。测序结果表明该酶的ORF由1692个核苷酸组成,编码563个氨基酸,在N端有23个氨基酸的信号肽,其成熟蛋白的分子量应为58．544kDa。对其推导氨基酸的序列分析表明Chi58与沙雷氏菌的几丁质酶（如徂）有高度同源性（88．9％-99．6％）,其结构主要包括信号肽序列、PKD结构域和18家族糖苷水解酶结构域。将该基因克隆到pET32a（＋）载体构建重组质粒pChi58,转入大肠杆菌BL-21（DE3）进行融合表达。经IPTG诱导后,可见分子量约81．1kDa的融合蛋白的表达。