阪崎克罗诺杆菌的ITS序列分析

摘 要：以分离自不同来源（不同地区乳制品及某一企业婴儿配方乳粉加工生产环境）、经API20E鉴定为阪崎克罗诺杆菌的37株分离株为研究对象,采用ITS序列对其进行鉴定分析。结果表明,ITS序列分析在阪崎克罗诺杆菌鉴定中具有一定的优越性,且研究发现,ITS序列中含有两种功能基因tRNAgul和tRNAile+ala,这为今后阪崎克罗诺杆菌的鉴定及ITS基因的进一步分析提供了可供参考的理论依据。     

黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用

【目的】分析黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌生物膜的抑制作用。【方法】采用XTT法评价黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌起始粘附性及生物膜内细菌细胞活性的影响,并且采用荧光实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)检测了阪崎克罗诺杆菌生物膜相关基因glp Q、nlp D、gsi B、deo B、lux S、sdi A的表达水平。【结果】黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌的抑制效果呈剂量依赖型。黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌的MIC80值为1 024 mg/L,该浓度的黄芩苷对阪崎克罗诺杆菌BAA-894和IQCC10423菌株生物膜的抑制率分别为83.7%和53.2%。浓度为2 048 mg/L的黄芩苷能够通过降低阪崎克罗诺杆菌的粘附性来抑制新生物膜的形成。另外,实时定量PCR结果表明黄芩苷可能通过下调阪崎克罗诺杆菌生物膜相关基因的表达来抑制其生物膜的形成。【结论】黄芩苷有可能被作为抗菌剂以预防和灭活阪崎克罗诺杆菌生物膜。     

食品污染克罗诺杆菌(阪崎肠杆菌)的分离及鉴定

[目的]对300份奶粉样品和50份非奶粉类食品中克罗诺杆菌的污染情况做定量检测,并对分离得到的克罗诺杆菌进行鉴定.[方法]通过分子方法和9管法对奶粉和其他食品中克罗诺杆菌的污染情况做定量检测;通过吲哚产生、丙二酸盐利用、卫矛醇、肌醇、松三糖和松二糖发酵产酸等六种生化试验对分离株进行鉴定;同时对分离株的16S rRNA基因序列进行同源性分析,通过N-J(Neighbour-Joining)法构建系统发育树.[结果]定量检测结果表明,350份样品中有23份样品分离出克罗诺杆菌,共分离到24株克罗诺杆菌,检出率为6.6％;23份受污染样品中有4个样品的克罗诺杆菌大于100 MPN/100g;24株克罗诺杆菌被鉴定到种或亚种,其中19株为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii);2株为丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus);2株为都柏林克罗诺杆菌奶粉亚种(C.dublinensis subsp.lactaridi);1株为莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii).[结论]分子方法和9管法联用适合污染率低而定量检测要求高的克罗诺杆菌的奶粉调查;采用生化和分子生物学方法将24株分离株鉴定到种或亚种,其中阪崎克罗诺杆菌为优势种;奶粉中克罗诺杆菌的污染问题对婴幼儿安全存在隐患,应引起消费者和有关部门的重视.     

一株恒河猴克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）的分离鉴定及序列分析

目的对恒河猴粪便中分离到的一株克罗诺杆菌进行鉴定,为实验恒河猴疾病检测、鉴别诊断和治疗提供参考依据j方法通过细菌培养特性、菌落形态观察及微生物鉴定系统（ID32E）生化试验进行菌落鉴定;并进行抗生素敏感试验和小白鼠致病性试验;用PCR方法扩增分离菌株的23SrRNA基因并测序,并将其与GenBank上参考菌株23SrRNA基因核苷酸序列进行同源性分析。结果经细菌形态学和生化鉴定该细菌为克罗诺杆菌,23SrRNA基因序列与GenBank中分离自婴幼儿配方奶粉中的阪崎克罗诺杆菌（CP004091）同源性为98％。药敏试验表明该菌对甲硝哒唑耐药,对其他15种抗生素敏感。致病性试验证明该分离菌株对小白鼠有强致病性。结论该株从恒河猴中分离到的克罗诺杆菌具有较强的致病性,对实验恒河猴饲养及相关研究人员有潜在的危害,因此,在恒河猴饲养及研究过程中应引起重视。头孢、庆大霉素和诺氟沙星等药物可作为治疗恒河猴克罗诺杆菌感染的临床用药。     

阪崎克罗诺杆菌噬菌体JC01的筛选和特性

【背景】阪崎克罗诺杆菌是一种食源性病原体,摄入受污染的婴儿配方奶粉(powdered infant formula, PIF)常引起新生儿坏死性小肠结肠炎和脑膜炎,对早产儿和免疫功能低下的婴儿健康甚至生命产生严重威胁。噬菌体具有特异性杀菌性,可成为一种新型生物防控制剂预防阪崎克罗诺杆菌和其他食源性致病菌的污染。【目的】从污水中分离出感染阪崎克罗诺杆菌噬菌体,评价其生物学特性、基因组生物信息及在婴儿配方奶粉中杀菌作用。【方法】采用双层琼脂法分离鉴定噬菌体,并测定其酸碱稳定性、温度稳定性、宿主范围和一步生长曲线,透射电镜观察形态,对其基因组进行二代测序和裂解功效测定。【结果】从污水中分离到一株新的能裂解阪崎克罗诺杆菌的噬菌体JC01,具有二十面立体对称头部和非收缩的长尾,噬菌体JC01基因组为双链DNA,由61 736 bp组成,预测有76个开放阅读框(open reading frame, ORF),不含有tRNA,基因组中不含有耐药基因和毒力基因。系统发育分析及基因比对分析显示噬菌体JC01是全新的噬菌体,归类于有尾噬菌体纲(Caudoviricetes)卡金斯病毒科(Casjensviridae)雅昆病毒属(Jacunavirus),被命名为Jacunavirus 01。噬菌体JC01在不同温度(−20-40 °C)和pH 5.0-9.0范围内稳定,且对婴儿配方奶粉污染的阪崎克罗诺杆菌具有良好的杀菌效果。【结论】JC01噬菌体是裂解阪崎克罗诺杆菌的新噬菌体,作为生物安全防控剂在食品生产和加工方面具有很大潜力。     

一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定

【目的】对一株引起马来甜龙竹组培污染内生菌的分离与鉴定。【方法】采用改良的NA培养基分离纯化菌株,并通过菌体的形态结构观察、生理生化试验及其16SrDNA序列同源性分析对其进行鉴定。【结果】菌株SWFU01的形态特征及生理生化试验结果与解淀粉芽孢杆菌[Bacillus amyloliquefaciens(Fukumoto)Priest et al.]的描述基本相同;16S rDNA序列分析表明,该菌株与解淀粉芽孢杆菌JS在同一系统发育分支,其同源性为99.28%。【结论】综合形态学特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析的研究结果,菌株SWFU01被鉴定为解淀粉芽孢杆菌。     

ε-聚赖氨酸对阪崎克罗诺杆菌细胞结构与生物被膜形成的影响北大核心CSCD

ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)作为一种抗菌活性强、安全性高、热稳定性好的阳离子型天然多肽,已作为安全的食品防腐剂受到关注。以阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)为供试菌株,揭示ε-PL的抑菌机理,为细菌耐药性和食品防腐措施研究提供理论支持。研究了ε-PL作用下对阪崎克罗诺杆菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、细胞膜壁通透性、细胞表面疏水性及运动性等生理特性的影响,并利用透射电子显微镜对ε-PL作用下的细菌细胞形态变化进行了观察,在此基础上,探究了ε-PL对阪崎克罗诺杆菌生物被膜(biofilm,BF)的抑制和清除作用效果,并利用荧光染色显微观察清除后被膜菌通透性的改变。ε-PL对阪崎克罗诺杆菌的抑菌活性具有浓度依赖性,ε-PL对阪崎克罗诺杆菌ATCC51329的MIC为256 μg/mL。ε-PL能够增强细胞膜壁通透性,使其细胞内容物如核酸、碱性磷酸酶等大量渗出,从而表现对阪崎克罗诺杆菌的杀菌作用。同时ε-PL能够降低阪崎克罗诺杆菌的表面疏水性和运动性,进而影响阪崎克罗诺杆菌生物被膜的形成。ε-PL对阪崎克罗诺杆菌生物被膜抑制和清除的作用效果显著,结合物理振荡,可大大提高生物被膜清除效率。ε-PL能够破坏阪崎克罗诺杆菌的细胞结构,从而达到抑菌效果。ε-PL能够降低阪崎克罗诺杆菌细胞表面的疏水性、运动性,进而ε-PL能够抑制生物被膜的形成,对成熟生物被膜也具有清除作用。     

水浮莲中一株西瓜枯萎病拮抗菌的分离、筛选及鉴定

从水浮莲(Pistia stratiotes L.)的叶中分离出1株对西瓜枯萎病有明显拮抗作用的内生细菌XJPL-YB-26, 其发酵液上清在280 nm处有最大紫外吸收峰。利用软件Primer 6.0 设计16S rDNA引物并对其基因组DNA进行扩增并测序得到XJPL-YB-26的部分16S rDNA序列, GenBank接收号为EU251191。经Blastn调出与菌株16S rDNA同源的序列, 并用软件MEGA 3.1按Neighbor- Joining方法构建16S rDNA系统发育树。菌株XJPL-YB-26与AB271744处于同一分支, 相似性为99%, 最终鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。     

水浮莲中-株西瓜枯萎病拮抗菌的分离、筛选及鉴定

从水浮莲(Pistia stratiotes L.)的叶中分离出1株对西瓜枯萎病有明显拮抗作用的内生细菌XJPL-YB-26,其发酵液上清在280 nm处有最大紫外吸收峰.利用软件Primer 6.0设计16S rDNA引物并对其基因组DNA进行扩增并测序得到XJPL-YB-26的部分16S rDNA序列.GenBank接收号为EU251191.经 Blastn调出与菌株16S rDNA同源的序列,并用软件MEGA 3.1按Neighbor-Joining方法构建16S rDNA系统发育树.菌株XJPL-YB-26与AB271744处于同一分支,相似性为99%,最终鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.     

无绿藻PCR ITS1-ITS2基因分型法的建立及应用

目的建立无绿藻(Prototheca)PCR ITS1-ITS2基因鉴定分型方法,并通过系统发育树以研究各型别无绿藻菌株间的亲缘关系。方法抽提5株无绿藻临床分离菌株的DNA,通过特异性引物扩增ITS1及ITS2区后,根据该区域核苷酸片段的差异进行基因分型,借助MEGA6.0软件建立系统发育树,并通过SSU rDNA测序加以验证。结果 5株菌株中,1株鉴定为P.zopfii hydrocarbonea,2株鉴定为P.wickerhamii。虽然由于数据库中缺乏P.zopfii portoricensis菌株ITS序列导致1、2号菌株不能被鉴定,但ITS区系统发育树中这两株菌仍被归为P.zopfii中独立的一簇,与SSU rDNA系统发育树相近,证明此分型方法无误。结论 PCR ITS1-ITS2基因分型法可作为一种有效基因分型方法用于鉴定和监测无绿藻感染。     

南方红豆杉内生细菌分离鉴定及系统发育分析

目的:了解南方红豆杉内生细菌类群及其系统发育关系;方法:对分离菌株进行形态学、生理生化和分子鉴定,并做系统发育分析.结果:从南方红豆杉茎、皮和叶中共分离到内生细菌52株.对12株内生细菌16S rDNA进行PCR扩增,扩增产物大小约为1 400bp,对11株内生细菌16S rDNA测序结果,用BLAST软件进行相似性比对,发现TB02株为Enterobacter属,相似性99％;9株为Bacillus属,相似性99％～ 100％:TB13株为Lysinibacillus,相似性97％.通过构建系统发育树发现这11株内生细菌明显聚为两大支.结论:11株内生细菌分别鉴定为肠杆菌、芽孢杆菌和Lysinibacillus,芽孢杆菌为南方红豆杉内生细菌优势菌属.芽孢杆菌和Lysinibacillus亲缘关系较近,二者和肠杆菌之间亲缘关系较远.     

美洲大蠊肠道内生微杆菌的分离鉴定及其抑菌活性研究

对美洲大蠊肠道内生微杆菌进行形态学和分子生物学鉴定,对其抑菌活性进行初步研究,并从基因水平分析微杆菌产生卤化次级代谢产物的潜力。利用平板划线法对美洲大蠊肠道内生微杆菌进行分离和纯化,革兰氏染色后进行光学显微镜观察,并利用16S rDNA PCR、BLAST同源性比对和构建系统发育树等方法对分离菌株进行分子生物学鉴定以及部分抗生素合成关键酶基因的筛选。在此基础上,以8株常见致病菌为指示菌,利用牛津杯法对分离菌株的抑菌活性进行初步研究。分离得到的8株微杆菌其菌落颜色呈淡黄色或白色;16S rDNA基因测序和BLAST比对结果表明,该8株微杆菌与已知微杆菌同源性均达到98%以上,系统发育树结果表明8株微杆菌与土壤、海洋来源的微杆菌同源性较高。部分抗生素合成关键酶基因筛选结果表明8株微杆菌中有6株至少对FADH2-依赖性卤化酶、非核糖体多肽合成酶(NRPS)及Ⅰ型聚酮合酶(PKSI)3种基因中的2种呈阳性表达。抑菌实验显示,8株微杆菌中有6株微杆菌对受试真菌和细菌的生长表现出了不同程度的选择性抑制作用,表明美洲大蠊肠道存在具有抑菌活性的内生微杆菌。     

黑水虻幼虫肠道和体表产酶细菌的分离和鉴定

从野外收集和室内饲养的黑水虻Hermetia illucens L.幼虫体表和肠道分离出同时具蛋白质和有机磷分解能力的细菌10株,其中编号为T2、T4、T6、T7和T8的菌株分离自体表,编号为S14、S15、S16、S19和S20的菌株分离自肠道。克隆细菌的16S rDNA和DNA促旋酶B亚基编码基因gyrB对10株细菌进行了鉴定。通过16S rDNA序列确定10株菌为芽孢杆菌属,根据gyrB基因以及BLAST结果构建系统发育树,将10株细菌鉴定为枯草芽孢杆菌。然后将10株菌的gyrB基因以B.subtilis subsp.subtilisstr.168和模式菌株B.subtilis subsp.subtilis BCRC10255相应基因序列为参照构建系统发育树,分析10株菌在种的水平上的亲缘关系,发现10株菌存在亲缘关系差异,没有重复菌株。     

发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种分离及鉴定

采用改良MRS培养基从蒙牛冠益乳酸奶中选择性分离得到2种乳酸菌, 表型特征检测初步确定目标菌株BB-12, 该菌株符合双歧杆菌属特征描述。通过Biolog微生物自动鉴定系统鉴定、16S rDNA序列分析、atpD基因序列分析, 多相鉴定表明: 菌株BB-12为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)。系统发育学分析表明: atpD基因序列比16S rDNA序列在动物双歧杆菌亚种水平鉴定上有更好的分辨率。     

新疆盐碱地土壤耐盐芽胞杆菌的分离和鉴定

为了开发利用新疆盐碱地的耐盐菌资源,从该盐碱地土样中分离并纯化出11株耐盐能力较高的菌株,并从形态特征和16S rDNA序列分析对这些菌株进行鉴定。结果表明,11个菌株均为产芽胞,革兰氏阳性细菌。通过对这11个菌株的16S rDNA进行测序和同源性比较,发现它们与芽胞杆菌的相似性均达到99%。因此,这些菌株被鉴定为Bacillus sp.。11株菌均不能在NaCl质量浓度大于220 g/L条件下生长,属于中度耐盐菌株。耐盐基因的PCR扩增结果表明,只有NYT21、23、25、27、29等5株菌株含有pro耐盐基因,暗示这些耐盐芽胞杆菌具有不同的耐盐机制。     

一株新的胡萝卜软腐欧文氏菌的分离和鉴定

从大白菜软腐组织中分离出一株软腐病细菌BC1,经过形态观察、生理生化特性分析、致病性检测和16S rDNA序列分析,该分离物被鉴定为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora subsp. carotovora, Ecc）的一个新菌株,编号为BC1。这是首次从16S rDNA序列水平上对在我国分布的软腐欧文氏菌进行鉴定。Ecc BC1的16S rDNA序列与其它软腐欧文氏菌株的16S rDNA序列之间同源性达987%～993%,而且在系统发育树中独立于Ecc其它菌株。序列分析结果表明,Ecc BC1具有至少2种不同的16S rDNA序列,它们都在第459位和473位（相对于大肠杆菌16S rDNA序列）发生碱基突变,同一基因中两个突变位点之间彼此互补,处于16S rRNA螺旋H17颈部,而且这两处碱基变异只存在于BC1菌株中。通过与其它软腐欧文氏菌亚种和菌株16S rDNA序列进行比对分析,还进一步鉴定出一些BC1菌株特异的16S rDNA碱基突变位点。本文报道的Ecc BC1两个16S rDNA序列在GenBank中的登录号分别为AY309068和AY309069。     

地衣芽孢杆菌16S rRNA基因的TD-PCR扩增及系统发育分析

运用16SrRNA基因序列分析了中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保存的30株地衣芽孢杆菌的系统发育关系,结果显示:24株菌株位于地衣芽孢杆菌系统发育分支;3株菌株位于蜡状芽孢杆菌-苏云金芽孢杆菌系统发育分支;1株菌株位于枯草芽孢杆菌系统发育分支;2株菌株与其它地衣芽孢杆菌菌株间序列同源性为96.4%~97.4%,明显低于其它地衣芽孢杆菌菌株间同源性,分类地位不明确,有待进一步讨论。通过比较分析16SrRNA基因5′端500bp、3′端500bp以及其全基因的系统发育树,表明16SrRNA基因5′端500bp可以很好的代表全基因序列进行系统发育研究,可用于区分地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及蜡状芽孢杆菌分支。     

一株碱性纤维素酶产生菌的分离、鉴定及酶谱分析

目的:从土样中分离株碱性纤维素酶高产菌株.方法:利用CMC平板初筛,然后利用摇瓶复筛,筛选酶活力高的菌株,对分离出的一株高产菌株进行了鉴定并对其所产酶进行了酶谱分析.结果:获得一株碱性纤维素酶高产菌株H12,酶活力达到1.96U/ml.结论:该菌株呈长杆状、革兰氏染色为阳性、产芽孢;16S rDNA基因序列为1 419bp,与短小芽孢杆菌16S rDNA基因序列具有最高的同源性,基于16S rDNA基因序列的同源性分析以及系统发育分析等方面的多相分类研究,鉴定菌株H12为为短小芽孢杆菌;碱性纤维素酶的酶谱分析只有一条水解条带,酶分子量在75kD左右.     

MALDI-TOF质谱技术对克罗诺杆菌的鉴定与分型

以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术用于克罗诺杆菌的鉴定与分型。通过对获得的克罗诺杆菌属典型菌株、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌近似菌株以及克罗诺杆菌分离株的蛋白质质量图谱进行对比分析,找出克罗诺杆菌特征性离子峰,将其作为鉴定克罗诺杆菌的生物标识物;对全细菌蛋白质质量图谱进行聚类分析,将克罗诺杆菌属进一步划分为不同类型,结果显示,4株克罗诺杆菌参考菌株质量图谱约在5740(m/z)离子质荷比处出现1个相近离子峰,28株克罗诺杆菌分离株中27株(占96.4%)表现出相同结果;32株克罗诺杆菌被分为6种类型(以50%距离水平为分类界限)。MALDI-TOFMS作为一种新的技术,不仅能够用于克罗诺杆菌的鉴定,而且根据获得的细菌蛋白质质量图谱可将克罗诺杆菌划分为不同类型。     

高产β-葡萄糖苷酶N1菌株的分类鉴定

从纳豆中分离纯化得到1株β-葡萄糖苷酶高产菌株,命名为N1菌,利用16S rDNA分析对该菌作了系统进化鉴定.首先提取N1菌基因组DNA,根据不同种属细菌的16S rDNA序列两端的保守性设计通用引物,对N1菌16S rDNA片断进行PCR扩增,对扩增得到的目标片段测序,利用BLAST对测序结果进行比对,构建系统进化树进行分析,初步确定该菌属于枯草芽孢杆菌.研究表明以16S rDNA分析对该菌鉴定完全可行.