西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.     

薰衣草非特异性脂质转移蛋白基因nsLTP2-1和nsLTP2-2的克隆与功能分析

非特异性脂质转移蛋白（nsLTP,non-specific lipid transfer proteins）在植物脂质转运和分泌中发挥重要作用。本研究从薰衣草（Lavandula angustifolia）中克隆到2个II型nsLTP基因,命名为nsLTP2-1和nsLTP2-2,并对其进行功能分析。生信分析表明,nsLTP2-1和ns LTP2-2分别编码119个和117个氨基酸,具有脂转移蛋白（LTP,lipid transfer proteins）保守结构域和8个高度保守的半胱氨酸残基;系统进化分析显示它们处于两个分支,与同科的紫苏（Perilla frutescens）相似性最高。基因表达分析显示2个基因均在花蕾中高表达,在叶片、茎和花瓣中几乎不表达,在花萼中的表达存在差异,nsLTP2-1和nsLTP2-2分别在成熟花萼和幼嫩花萼中表达量更高;2个基因在花蕾和叶片中的表达均受到强光诱导,且在花蕾中的表达均受脱落酸诱导,而叶片中nsLTP2-1和nsLTP2-2的表达分别受茉莉酸甲酯和乙烯诱导。亚细胞定位显示2个nsLTPs均定位在细胞膜和细胞壁上,可能与次生代谢物的转运有关。...     

小桐子非特异性脂质转移蛋白A的基因克隆及其表达和功能分析

基于我们最近获得的小桐子低温驯化转录组和数字基因表达谱数据,本工作研究了低温驯化条件下差异表达变化较大的非特异性脂质转移蛋白A基因JcnsLTPA。克隆到该基因的cDNA序列全长833 bp,开放阅读框长度513 bp,编码170个氨基酸,存在ATT_LTSS典型保守功能基序。其启动子区域中鉴定到了TATA框、CAAT框、CATA框、W框等顺式作用元件以及CRT/DRE低温响应元件。半定量RT-PCR分析表明,该基因在茎、根、叶中都有表达,以茎中表达量最高、且受低温诱导最显著。同时,酵母表达JcnsLTPA也提高了重组酵母菌的抗低温能力。这些结果充分说明了小桐子JcnsLTPA是与抗冷性密切相关的基因,可以用于小桐子的抗冷性遗传改良。     

甘薯非特异性脂质转移蛋白基因克隆与表达分析(英文稿)

非特异脂质转移蛋白（nsLTP）是植物界普遍存在的一类涉及多种胁迫反应的可溶性蛋白。为了阐明甘薯中非特异性脂质转移蛋白基因IbLTP1和IbLTP2在盐胁迫反应中的功能,本研究运用PCR技术,对IbLTP1和IbLTP2基因进行了克隆,并通过生物信息学方法分析了序列结构、蛋白质保守结构域和系统进化关系;利用qRT-PCR方法检测了这两个基因在不同组织中的表达模式以及盐胁迫条件下的表达差异;将IbLTP1和IbLTP2基因克隆到大肠杆菌的原核表达载体pET32a中,对重组菌BL21（pET32a-LTP）的耐盐性进行分析。序列分析表明：IbLTP1和IbLTP2编码区均不含内含子并都具有等位基因。IbLTP1和IbLTP2基因的蛋白质序列分别包括114和94个氨基酸残基并且不含色氨酸残基,蛋白序列N端含有信号肽序列。保守结构域和系统进化分析结果表明：IbLTP1和IbLTP2均含有nsLTP蛋白的保守结构域,IbLTP1属于Type Ⅰ而IbLTP2属于Type Ⅱ。实时荧光定量PCR分析表明：IbLTP1在幼叶中表达量最高,根中表达量最低;而IbLTP2在茎中表达量最高,成熟叶中表达量最低。在NaCl胁迫条件下,IbLTP1和IbLTP2表达量在根中基本无变化而在茎和叶中上调。大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达IbLTP1和IbLTP2基因能够提高转基因菌株对NaCl的耐受性。因此,本研究推测IbLTP1和IbLTP2基因可能在甘薯盐胁迫反应中发挥了作用。     

水稻非特异性脂质转移蛋白的原核表达、纯化及抑菌功能

将编码水稻非特异性脂质转移蛋白 (nonspecificlipidtransferprotein ,nsLTP)基因 (LTP110 )的克隆到硫氧还蛋白融合表达载体PET32a( )中 ,在BL2 1(DE3)trxB-宿主菌中实现了融合蛋白的高表达。通过Ni2 chelatingSepharosefastflow柱纯化融合蛋白后 ,通过肠激酶酶切再过该亲和柱得到了重组LTP110。CD谱扫描表明重组蛋白质与体内提取的nsLTP二级结构相似 ;荧光脂质结合实验表明该蛋白质具有结合脂肪酸分子的活性。对该蛋白质的抑菌功能进行研究后表明 ,LTP110具有抑制稻瘟病菌孢子萌发的功能 ,在较低浓度即能发挥活性     

丹参非特异性脂质转移蛋白基因（SmLTP1）的克隆及其表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,获得一个新的非特异性脂质转移蛋白基因,命名为SmLTP1（GenBank注册号为EF187461）。该基因cDNA全长593bp,包含一个长为357bp的开放读码框,编码118个氨基酸。生物信息学结构分析表明,该蛋白具有植物nsLTP的典型结构,即4对二硫键,4个a-螺旋,1个可结合和容纳脂肪酸分子的类似口袋状的疏水结构。实时荧光定量PCR分析结果表明,SmLTP1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其表达受病原菌和茉莉酸甲酯的诱导,显示SmLTP1基因在植物防御反应中发挥作用。     

西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的硫堇(THI)基因的部分序列,应用RACE技术克隆了具有PolyA的全长cDNA序列。基因全长789bp,5'非翻译区90bp,3'非翻译区276bp,开放阅读框编码140个氨基酸。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物THI蛋白前体高度相似,N端具24个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的70个氨基酸为酸性多肽部分。西伯利亚蓼THI蛋白与丹参等双子叶植物THI蛋白有较高的同源性,具保守的植物THI标签序列C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C。此成熟THI蛋白带正电荷,偏碱性,推定可能具有抗病原微生物活性,为一种新的植物THI蛋白,GenBank登录号为DQ981482。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

西伯利亚蓼中PsMnSOD基因的克隆及其抗逆性检测

采用RACE技术从西伯利亚蓼中克隆了锰超氧化物歧化酶基因PsMnSOD的cDNA（GenBank登录号FJ848572）。长为792bp的PsMnSODcDNA序列含有编码234个氨基酸的705bp的开放读码框、57bp的5＇非翻译区和30bp的3＇非翻译区。构建了PsMnSOD基因的酵母表达载体pYES2-PsMnSOD并将其转化到野生型酵母菌株中。分析PsMnSOD基因在酵母中的表达对酵母SOD酶活性的影响及其对盐胁迫、PEG胁迫、高温和低温胁迫下抗逆性影响的结果表明,PsMnSOD基因在酵母中表达后酵母SOD酶活性提高,酵母对盐渍、PEG、高温和低温等非生物胁迫的抗逆性也增强。     

绿豆非特异性脂转移蛋白结构与功能的关系分析

利用硫酸铵沉降、弱阳离子色谱、强阳离子交换色谱、高效液相离子交换色谱和凝胶色谱等方法从绿豆中分离纯化非特异性脂转移蛋白nsLTP,并培养出绿豆nsLTP的晶体。对绿豆非特异性脂转移蛋白结构与功能关系作了分析报道。     

西伯利亚蓼铜伴侣蛋白基因在盐胁迫条件下的表达分析

铜伴侣蛋白是细胞质中负责传递铜离子的一种小分子转运蛋白,在逆境胁迫过程中铜伴侣蛋白的ATX1家族具有消除活性氧的作用．本研究应用RACE技术从西伯利亚蓼中克隆了具有完整编码区的铜伴侣蛋白全长cDNA序列,命名为PsATX-1．PsATX-1基因全长516 bp,其中开放读码框为228 bp,编码75个氨基酸,5′非编码区为83 bp,3′非编码区为204 bp．GenBank中登录号为EU620702．经比对发现,该基因所编码蛋白拥有重金属结合位点MXCXXC,缺少多数高等植物铜伴侣蛋白(CCH)所特有的C末端结构域（CTD）．实时荧光定量PCR分析显示,PsATX-1基因在西伯利亚蓼的地下茎、茎、叶中皆有表达,其中叶中表达量最高;PsATX-1基因受3% NaHCO3胁迫诱导,在不同部位表达模式有差异．     

西伯利亚蓼谷氨酰胺合成酶基因的克隆及碱性盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的谷氨酰胺合成酶基因(Glutamin synthetase,GS)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列,以下简称为PsGS基因。该序列全长1 273 bp,其5'非翻译区178 bp,3'非翻译区24 bp,开放阅读框编码356个氨基酸残基;根据与其他植物谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列的比对以及系统进化分析的结果,确定此基因为谷氨酰胺合成酶基因家族成员;经过SignalP3.0预测该蛋白没有信号肽,无切割位点,为非分泌蛋白。经过ProtParam计算该蛋白的理论等电点为5.55,分子量为39.2 kD,不稳定系数为43.82%,为非稳定蛋白。实时定量PCR分析表明,PsGS在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达。在3%NaHCO3诱导下,该基因在叶和茎中表达升高,在地下茎中表达受到抑制,推测该基因在抵御碱性盐迫时具有重要作用。     

西伯利亚蓼PsGRX基因的克隆及其在NaHCO_3胁迫下的表达

采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术从西伯利亚蓼叶cDNA文库中克隆到谷氧还蛋白基因（PsGRX）的完整编码区cDNA序列（GenBank注册号为GU139794）,长度为465bp,编码106个氨基酸。根据与其他植物谷氧还蛋白的氨基酸序列的比对以及系统进化分析的结果,初步确定此基因为谷氧还蛋白基因家族成员。实时定量PCR的结果显示,PsGRX在西伯利亚蓼的叶、茎、地下茎中均有表达,叶中表达量最高,地下茎和茎中较低。在NaHCO3胁迫的过程中,此基因在叶、茎和地下茎中的表达模式也有较明显的差异。     

钙调素对钙调素结合蛋白-10和玉米非特异性脂转移蛋白与脂质结合活性的影响

荧光标记的脂质结合实验表明,钙调素结合蛋白-10（CaMBP-10）具有典型的植物非特异性脂质转移蛋白与脂质结合的特性。进一步实验研究了钙调素（calmodulin,CaM）对CaMBP-10和玉米nsLTP与脂质结合的活性的影响,结果显示无论在有钙和无钙条件下,CaM对两者的影响均有不同之处,W-7和TFP能消除CaM的影响。提示CaM不仅与CaMBP-10和玉米nsLTP特异性相互作用,而且对2种脂转移蛋白可能具有不同的调节机制。     

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。     

盐胁迫下西伯利亚蓼6个时期混合叶cDNA文库的构建和初步分析

以3％NaHCO3胁迫处理西伯利亚蓼2h、6h、12h、1d、2d和3d共6个时期混合叶为材料,提取总RNA。根据Stratagene公司cDNA建库试剂盒构建了西伯利亚蓼混合叶cDNA文库。原始文库滴度为2．0×10^6pfu·mL^-1,扩增后文库滴度为4．5×10^9pfu·mL^-1,重组率为95．9％,插入片段大小在0．3—1．5kb之间,平均长度为0．45kb左右。经测序获得2575个EST序列,拼接出1977个假定独立转录本（TUTs）,其中文库中含有大量低丰度表达基因,约占TUTs总数的89．58％。BlastX分析表明,1977个TUTs中共有720个TUTs有明确功能注释,其中参与胁迫过程中代谢、能量、光合作用和蛋白合成基因表达量较高,而涉及转录、信号转导、细胞防御和救援基因表达量较低。