动物源溶菌酶研究进展

动物源溶菌酶是一种动物体内广泛存在的酶类,它可以水解细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键,具有消化分解细菌、抑制外源微生物生长、增强机体免疫力的作用.目前溶菌酶已被用作研究蛋白功能、性质以及分子进化的模型.首先介绍了溶菌酶及其分子的晶体结构,溶菌酶基因及其蛋白研究进展,其次介绍了动物源溶菌酶的功能,包括溶菌酶生物学功能和重组蛋白功能活性,重点介绍了溶菌酶基因在转基因工程中的应用研究,最后对动物源溶菌酶研究进行了展望.研究动物源溶菌酶对于基础科学,并应用其转变成现实生产力具有重要的指导意义.     

日本鳗鲡的C-型和G-型溶菌酶研究

研究以日本鳗鲡(Anguilla japonica Temminck et Schlegel)为研究对象, 根据其基因组数据库, 预测并扩增出2类, 共5个溶菌酶基因, 包括1个C-型溶菌酶和4个G-型溶菌酶, 分别命名为AJLysC、AJLysG1、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4。它们的cDNA全长分别为811、749、1352、1175和733 bp, 编码143、193、185、185和187个氨基酸。SignalP预测表明, AJLysC和AJLysG1的N-端分别包括15和19氨基酸的信号肽, 另外3种溶菌酶没有信号肽。基因组分析显示, AJLysC、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4的基因结构与其他鱼类的同类溶菌酶的基因结构相似, C-型溶菌酶具有4个外显子, G-型则具有5个。但是, AJLysG1的基因结构与其他鱼类G-型溶菌酶不同, 具有6个外显子, 与其他鱼类溶菌酶的蛋白序列比较, 发现AJLysG1缺失其他G-型溶菌酶存在的第2个酶活性位点氨基酸, 即天冬氨酸Asp。AJLysC与其他很多物种的C-型溶菌酶具有较高的同一性, 如与牙鲆的同一性为72.7%。G-型溶菌酶中AJLysG2、AJLysG3、AJLysG4彼此之间以及与其他物种G-型溶菌酶的同一性相对较高; 而AJLysG1与其他物种以及与其他3种G-型溶菌酶的同一性均不高, 且都在50%以下。组织表达分析显示, 所有5个溶菌酶基因在12种检测的组织中均有表达。C-型溶菌酶在胃及免疫相关组织的表达量较高; G-型溶菌酶在各组织/器官中的表达则差异较大, AJLysG1在皮肤和肌肉中的表达量最高, AJLysG2在免疫组织/器官如血液、头肾、体肾和鳃中表达量较高。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)刺激48h后, 这5个溶菌酶基因在组织/器官中的表达量均有上调, 其中在血液、肠道和头肾等的上调较为显著。此外, 研究尝试重组表达这些抗菌肽, 获得了AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4基因在鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)细胞中的表达, 重组蛋白表现出对溶壁微球菌(Micrococcus lyso-deikticus)生长的明显抑制作用。文章较全面地研究了日本鳗鲡溶菌酶基因的组成和类型及其表达变化, 并重组表达了部分基因, 这为进一步研究这些溶菌酶的功能, 特别是对病原微生物的作用奠定了基础。     

重组人溶菌酶研究进展

与其他来源的溶菌酶相比,人溶菌酶具有独特的优越性和多种多样的药理作用效果,在临床上具有多种重要应用价值。但天然人溶菌酶来源极其困难,利用重组DNA技术进行生产是解决这一难题的有效途径。迄今人们已利用化学合成或从人类细胞组织中制备cDNA等途径获取人溶菌酶基因,并在大肠杆菌、酵母菌和真菌表达系统中进行了表达,最高水平为40mgL,低于人乳中溶菌酶含量(50～250mgL),虽然距离工业化生产仍有一定距离。但重组人溶菌酶发展前景看好。     

人溶菌酶工程菌株培养条件的研究

人溶菌酶在食品工业和医药上具有广泛的用途,最近发现它在癌症的继承性免疫治疗上也有作用。为使人溶菌酶达到工业化生产,我们已成功地人工合成厂人溶菌酶基因,并构建了人溶菌酶基因的重组质粒和工程菌株。为提高该工程菌人溶菌酶的表达水平,我们对影响该工程菌表达人溶菌酶的培养条件进行探讨。     

密码子优化后的柞蚕溶菌酶在酵母中的表达及活性测定

【目的】提高柞蚕溶菌酶在毕赤酵母中的表达量,对柞蚕溶菌酶活性进行测定。【方法】根据毕赤酵母密码子偏爱性对柞蚕溶菌酶基因进行优化,并在目的基因3′端加上6个组氨酸标签,优化后的基因克隆至表达p PIC9K载体中,并通过电转化的方法导入毕赤酵母GS115中。利用不同浓度梯度的G418进行高拷贝转化子的筛选,经甲醇诱导实现分泌表达。通过硫酸铵盐析、镍柱亲和层析等工艺分离纯化柞蚕溶菌酶,利用琼脂扩散方法测定柞蚕溶菌酶对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、苍白杆菌及过氧化醋杆菌的抑菌作用,利用比浊法测定酶活大小。【结果】密码子优化后的柞蚕溶菌酶在诱导温度25°C、甲醇量0.75%和p H 7.0条件下实现了最高表达,表达量达到了2.4 g/L,并且纯化后的柞蚕溶菌酶酶活达到23 970 U/mg。【结论】密码子优化后的柞蚕溶菌酶在毕赤酵母中实现了高效表达,纯化后的柞蚕溶菌酶对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、苍白杆菌及过氧化醋杆菌均有抑菌作用。     

两种沼虾溶菌酶基因ORF的克隆和罗氏沼虾溶菌酶基因的组织表达(英文)

分别提取罗氏沼虾和日本沼虾血细胞总RNA,RT-PCR扩增获得特异性cDNA片段,纯化后克隆到T载体上。序列测定表明所克隆的两种沼虾溶菌酶基因的开放阅读框(ORF)为477bp,共编码158个氨基酸,包括溶菌酶成熟肽140个氨基酸残基和信号肽18个氨基酸残基。同源性分析表明,罗氏沼虾和日本沼虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列高度同源,分别为99.4%和98.1%。两种沼虾溶菌酶基因的碱基序列和推测氨基酸序列与Gen-Bank上其他对虾溶菌酶的同源性达83.0%和80.0%以上。两种沼虾溶菌酶都具有c-型溶菌酶典型的两个酶活性位点(Glu51)和(Asp68),以及8个保守结构氨基酸残基Cys,且在101、106和107位上缺少Asp,因而推测本实验所克隆的两种沼虾溶菌酶基因属c-型溶菌酶基因的非钙结合亚型。以PCR法制备罗氏沼虾溶菌酶基因的生物素标记探针,斑点杂交检测感染弧菌后溶菌酶基因mRNA在各组织中的转录水平,结果表明受感染6h后在眼、肌肉、鳃、肝胰腺、肠管中的表达量均有升高,其中在肝胰腺中的表达量最高,约为对照组的560%。在不同感染时间里,肝胰腺中该基因表达量有较大的变化:感染后3h表达量最低,24h后表达量升至最高,大约为对照组的430%,48h时的表达量又有所下降,但仍明显高于对照组(约为330%)。受弧菌感染后罗氏沼虾溶菌酶基因转录的上调证明溶菌酶基因在非特异性免疫中的直接作用,同时表明肝胰腺可能在沼虾的免疫防御过程起重要作用。       

XeCl准分子激光辐照对溶菌酶结构的影响

利用荧光光谱、SDS-PAGE和NMR方法,考察308 nm XeCl准分子激光辐照对溶菌酶结构与活性的影响。使用能量密度为0.3 mJ/mm2的激光辐照溶菌酶,脉冲数分别为25、50、100、200、600、1200、1800、3600和7200。结果表明,用低强度激光辐照(低于200个脉冲)时,溶菌酶的活性出现增高趋势。随着激光辐照脉冲数的进一步增大,溶菌酶的活性又开始逐步降低。激光辐照处理后,溶菌酶的荧光强度发生了与生物活性相对应的先增高再降低现象,说明溶菌酶的高级结构发生了显著变化。SDS-PAGE结果显示,经激光辐照后,溶菌酶出现了分子间的聚合。分析溶菌酶的1H-NMR谱发现,辐照后,溶菌酶色氨酸(Trp)111、Trp63和Trp62的化学位移发生了变化,此结果进一步说明,激光辐照使溶菌酶的高级结构发生了变化。该实验可为激光辐照诱导蛋白质去折叠的研究提供参考。     

溶菌酶对微小小单胞菌生物膜的影响

目的测定溶菌酶对微小小单胞菌及其生物膜的抑菌作用,并测出最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)和抑菌率。方法采用对倍稀释的方法,测定溶菌酶对微小小单胞菌的MIC、MBC;在96孔板中体外建立微小小单胞菌生物膜模型,采用MTT法检测溶菌酶对微小小单胞菌生物膜的影响;在六孔板中建立生物膜模型,使用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察不同浓度溶菌酶对微小小单胞菌生物膜作用后的变化。结果溶菌酶对微小小单胞菌的MIC为0.0195 mg/mL,MBC为0.3125 mg/mL;CLSM观察结果显示,溶菌酶对微小小单胞菌生物膜的抑制作用随着浓度的增加而增强。结论溶菌酶对微小小单胞菌及其生物膜的生长和活性均具有抑制作用。     

罗非鱼3种C型溶菌酶重组蛋白的制备及与几种鱼虾溶菌酶溶菌谱的比较

应用基因工程技术制备了3种奥利亚罗非鱼C型溶菌酶的重组蛋白,并应用比浊法比较了它们与草鱼C型溶菌酶、G型溶菌酶和斑节对虾C型溶菌酶重组蛋白对无乳链球菌、嗜水气单胞菌等8种细菌的溶菌作用.研究发现,6种重组溶菌酶对这8种菌均具有溶菌活性,但是溶菌活力强弱不一.其中罗非鱼C3溶菌酶对革兰氏阳性菌无乳链球菌的溶菌作用最强,草鱼C型与G型溶菌酶次之;所有重组溶菌酶对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌均具较强的溶菌活性.与斑节对虾C型溶菌酶、草鱼C型与G型溶菌酶相比,罗非鱼的C型溶菌酶对嗜水气单胞菌具有较强的溶菌作用,且以C1的溶菌活性最强.本研究结果可为选择具较强溶菌活力的溶菌酶应用于养殖生产提供依据,并可为应用转基因技术培育抗病品种提供靶基因.     

金纳米探针瑞利共振散射法测定溶菌酶

利用共振散射技术研究了金纳米微粒与溶菌酶的相互作用.金纳米微粒可以通过静电引力及疏水作用与溶菌酶结合,使金纳米微粒粒径变大,从而导致纳米金瑞利共振散射光谱显著增强,并且在一定范围内光散射强度的增加量与溶菌酶浓度成正比.考查了作用时间、溶液酸度、共存离子及有机溶剂等条件的影响.将纳米金作为测定溶菌酶的探针,在最佳反应条件下,对溶菌酶的检出限为0.08 μg/mL.将此方法用于蛋清中溶菌酶的测定,检测结果与文献报道方法一致,结果令人满意.     

溶菌酶C及其生物学功能

在已知6类溶菌酶中,溶菌酶C是唯一存在于脊椎动物、原索动物和无脊椎动物中的类型,也是当前研究最广泛、最透彻的类型。该文从基因数目、基因表达、基因进化和基因功能几个方面详细介绍溶菌酶C的分子生物学研究进展,并认为未来的研究重点已经不是溶菌酶的杀菌作用,而是其消化功能和其他未知的生物学功能。     

反刍动物溶菌酶研究进展

目前,抗生素滥用带来的副作用日益凸显,寻找抗生素的有效替代品显得尤为迫切。溶菌酶能水解细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键,具有消化分解细菌、抑制外源微生物生长、增强机体免疫力的作用,在动物尤其是反刍动物体内广泛存在。本文讨论了反刍动物溶菌酶的来源与分布、基因序列、蛋白结构和酶学性质、蛋白功能及活性,对其耐酸分子机理进行了归纳总结;同时阐述了反刍动物溶菌酶基因的进化研究,最后对反刍动物溶菌酶研究进行了展望。研究反刍动物溶菌酶对于基础科学,并应用其转变成现实生产力意义重大。     

斑节对虾溶菌酶基因克隆及序列分析

参考对虾溶菌酶基因和类溶菌酶基因及其他多种生物的溶菌酶基因序列 ,设计并合成引物。运用RT PCR技术 ,从斑节对虾血细胞总RNA中扩增获得特异性片段。所获片段回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明 ,所克隆的斑节对虾溶菌酶基因片段长 6 5 8bp ,包括溶菌酶基因开放阅读框 (ORF)4 77bp和 3′端非编码区的 181bp。 4 77bpORF共编码 15 8个氨基酸 ,包括溶菌酶成熟肽 14 0个氨基酸残基和信号肽 18个氨基酸残基。斑节对虾溶菌酶成熟肽推测分子量为 16 ,32kd ,等电点为 8 78。与南美白对虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列比较 ,同源性分别为 89 5 %和 93 0 % ;与日本对虾类溶菌酶基因的同源性分别为 84 0 %和91 0 %。进一步的序列分析表明 ,斑节对虾溶菌酶氨基酸序列与多种类群生物的c 型溶菌酶氨基酸序列具有较高的同源性 ,并具有与c 型溶菌酶相同的活性位点氨基酸残基Glu51和Asp68,且与活性位点相邻的序列高度保守。斑节对虾溶菌酶氨基酸序列还具有与c 型溶菌酶相同的结构氨基酸——— 8个半胱氨酸残基。因而可认为所克隆的斑节对虾溶菌酶基因属c 型溶菌酶基因。     

溶菌酶的研究进展

溶菌酶普遍存在于动物、植物和微生物中。溶菌酶是一种小分子碱性蛋白,长期以来一直被作为一种“模型”体系．用于研究蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子进化、分子免疫间的关系。介绍了溶菌酶的来源、结构、性质、作用机制。并对近年来其在食品工业、医学和酶工程中的应用进行了综述;分析了溶菌酶应用中存在的主要问题,并对其应用前景进行了展望。     

异育银鲫c型溶菌酶全长cDNA序列的生物信息学分析及其组织表达分析

利用RACE及克隆等方法获得了异育银鲫（Carassius auratus gibelio）c型溶菌酶基因全长cDNA序列．序列分析表明,所克隆的异育银鲫溶菌酶的cDNA全长751 bp,包括溶菌酶基因开放阅读框（ORF）438 bp,5′ 非编码区（UTR）为109 bp和3′ UTR为204 bp．438 bp ORF共编码146个氨基酸,其成熟肽的分子量预测值为14　543.6,理论等电点为8.86．通过ClustalW软件,将异育银鲫和其它多个物种c型溶菌酶的氨基酸序列进行多序列比对发现,所克隆的异育银鲫溶菌酶编码的氨基酸序列中存在c型溶菌酶的活性中心（Glu53和Asp69）,且与活性位点相邻的氨基酸序列高度保守．同时,8个保守的半胱氨酸残基也与其它物种的c型溶菌酶相一致．结合BLASTN分析的结果,可以确认所获得的异育银鲫溶菌酶cDNA序列属于c型溶菌酶．异育银鲫c型溶菌酶和人c型溶菌酶（pdb 1at6_）在蛋白质序列上有50%相似性,其三维（3-D）结构非常类似．通过氨基酸空间位置比较发现,两者具有类似的酶活中心,异育银鲫c型溶菌酶只能形成3个二硫键,比人少1个．荧光定量RT-PCR检测和溶菌酶活性测定显示,异育银鲫头肾和脾脏c型溶菌酶mRNA的表达量约为肝胰脏的2.9 倍和1.7 倍,异育银鲫头肾和脾脏的溶菌酶活性约为肝胰脏的6.2 倍和4倍．     

水合溶菌酶及其热稳定性的NMR研究

本文用90MHz脉冲NMB波谱仪记录了具不同含水量的溶菌酶的质子宽谱线NMR谱图及自由感应衰减曲线,并记录了水合度为0.10及0.19克水/克溶菌酶的溶菌酶样品从室温到热变性温度范围内的谱图.用线宽参量随水合度及温度的变化讨论溶菌酶在水合及热变性过程中溶菌酶分子及水分子运动性的变化.结果表明,溶菌酶分子及水分子的运动性与水合溶菌酶中的水含量密切相关;低水含量的水合溶菌酶在热变性过程中酶分子运动性的变化经历了两个转变,分别对应于酶分子间的解缔合及分子内的解旋.     

溶菌酶的研究进展

溶菌酶在自然界中广泛存在,是一种与单核-巨噬细胞系统有关的非特异性防御机制。人溶菌酶在临床上具有潜在的使用价值。由于来源有限,利用基因工程技术从细菌或酶母中生产人溶菌酶实现产业化,是解决其供需矛盾的有效途径。有关溶菌酶抗菌功能以外的其它未知生物学作用,也是当前研究的热点。     

不同来源溶菌酶的性质比较

比较两种从新鲜鸡蛋清中提取溶菌酶的方法。采用较为简单的并且产率较高的结晶法分别从鸡蛋清、鹌鹑蛋清中提取了溶菌酶 ,并分别测定了各溶菌酶的酶活力、最适pH值和最适温度。同时 ,证明了该法无法从鸭蛋清中提取出纯溶菌酶 ,故仅对粗提物进行了酶活力、最适 pH值和最适温度的测定     

海参i型溶菌酶基因及其编码产物的结构特点

通过RT-PCR 和 RACE PCR技术,从海参(Stichopus japonicus)体壁中克隆得到一种溶菌酶基因(GenBank：EF036468).生物信息软件分析表明,其中全长cDNA为 713 bp,5′非编码区（UTR）246 bp,3′UTR 29 bp,开放阅读框438 bp,编码145个氨基酸,包括溶菌酶成熟肽124个氨基酸和信号肽21个氨基酸.对海参溶菌酶与多种无脊椎动物的c、g和i型溶菌酶进行分析比较,发现它与i型溶菌酶有较高的同源性,并具有i型溶菌酶高度保守的2个活性位点,即Glu34和Ser50.活性位点附近具有i型溶菌酶的一段特有的氨基酸保守序列MDVGSLSCG(P/Y)(Y/F)QIK,所以推断克隆的海参溶菌酶为i型.另外,通过搜索蛋白保守结构域数据库,发现海参溶菌酶与医用水蛭失稳酶相似性最高,并且这2个酶的三级结构模型也极其相似.因此推测,海参i型溶菌酶具有双功能特性,既能作用于细菌细胞壁的糖苷键使细胞裂解,又具有失稳酶的一些生化功能,能够水解纤维蛋白,这些特点在海参自溶过程中发挥重要的作用.     

溶菌酶的研究进展

对溶菌酶的稳定性的改善、制备、基因工程表达产物的复性处理作了介绍,并且对溶菌酶在医药、食品工业和生物工程上的应用作了概述。