桔小实蝇V-ATPase G亚基基因的克隆及组织表达特异性分析

空泡型ATP酶（vacuolar-type H⁺-ATPase, V-ATPase）作为质子泵几乎在所有的真核生物细胞中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE技术获得了桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)V-ATPase G亚基序列全长, 命名为BdorATPG。测序结果表明, BdorATPG阅读框全长354 bp, 编码117个氨基酸。氨基酸序列比对表明, BdorATPG的N端序列与其他物种的ATPG亚基对应区域具有较高的序列一致性。BdorATPG与拟暗果蝇Drosophila pseudoobscura ATPG亚基的氨基酸序列一致性最高, 为88.9%。三维结构模建结果表明, BdorATPG N端（第1~59位氨基酸）序列为α-螺旋结构, 亲水性和疏水性氨基酸在螺旋两侧呈对称分布。BdorATPG在不同组织中的荧光定量PCR分析表明, BdorATPG在各组织中都有表达, 其中在触角中的表达量最高; 在雄虫生殖节中的表达量是雌虫中的6.04倍。结果提示BdorATPG可能在雄虫生殖生理过程中发挥重要作用。     

玉米根V-ATPase的A亚基磷酸化位点的鉴定

以玉米 (Zea mays L.) 根的高纯度液泡膜为材料进行的磷酸化反应表明,液泡膜蛋白的磷酸化可明显提高V型H -ATPase (V-ATPase) 的ATP水解活性和H 转运活性。进一步研究表明,纯化的液泡膜蛋白能被硫代磷酸化,用V-ATPase的A亚基抗体将一条约69 kD的条带鉴定为A亚基。为了测定V-ATPase的A亚基的磷酸化位点,从硫代磷酸化的凝胶中切下A亚基条带并用胰蛋白酶彻底消化。用RP-HPLC分离纯化酶解片断,收集纯化的硫代磷酸化肽段进行质谱分析所测定的分子量为573.83 Da。A亚基胰蛋白酶彻底消化后能产生61个肽段,只有F56肽段的分子量573.66 Da与573.83 Da最接近,而且F56肽段上只有第525位的丝氨酸可以被磷酸化。因此可以确定,玉米根V-AT-Pase A亚基的潜在磷酸化位点为Ser525。就我们所知,这是首次确定植物V-ATPase A亚基的磷酸化位点。     

向日葵V-ATPasea3亚基基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从向日葵P50中克隆V-ATPase a3亚基基因c DNA全长,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析不同浓度、不同时间的Na Cl、ABA和PEG模拟干旱胁迫条件下V-ATPase a3亚基基因的表达特征,以及相同胁迫条件下该基因在向日葵不同器官的表达特征。序列分析表明,该基因c DNA全长2 873bp,含5'-UTR 109bp、3'-UTR 295bp及编码区2 469bp,编码822个氨基酸,其编码蛋白质的理论分子质量为204.55k Da,等电点为6.29,Gen Bank登录号为KU315054。该基因编码的蛋白质为疏水性的跨膜蛋白,亚细胞定位预测其在质膜上。向日葵V-ATPase a3亚基与已报道的10种植物的V-ATPase a3亚基的同源蛋白有高度相似的保守区域,在进化上与朝鲜蓟的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,向日葵受到Na Cl、ABA和PEG模拟干旱三种非生物胁迫后,V-ATPase a3亚基基因均上调表达,但表达模式不同,不同器官存在特异性表达差异。研究认为,V-ATPase a3亚基基因响应了向日葵非生物胁迫的应答,为加强对V-ATPase基因的利用奠定基础。     

褐飞虱V-ATPase d亚基基因的克隆与mRNA表达分析

液泡型H+-ATPase(V-ATPase)在昆虫生长发育过程中具有重要作用。本文通过RT-PCR获得褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)V-ATPase d亚基基因NlVHA-d的cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR对NlVHA-d基因的表达进行了分析。结果表明,NlVHA-d基因编码349个氨基酸,不同昆虫V-ATPase d亚基高度保守。NlVHA-d基因在褐飞虱2龄若虫中表达量最高,雌虫表达量显著高于雄虫表达量。LD10和LD30三唑磷处理的羽化3 d短翅雄虫NlVHA-d基因相对表达倍数分别是丙酮处理的2.15和2.46倍。亚致死剂量三唑磷处理褐飞虱短翅雄虫NlVHA-d基因的表达上调可能与褐飞虱再猖獗相关。     

拟南芥复制因子C亚基1在胚胎发生中起重要作用

复制因子C包含1个大亚基和4个小亚基,在DNA复制、损伤修复和细胞增殖中起重要作用,拟南芥复制因子C亚基1(AtRFC1)是人类复制因子C大亚基p140的同源蛋白。在对3个复制因子C亚基1的T-DNA插入突变株系rfc1-1、rfc1-2和rfc1-3的检验中,证实插入位点分别位于第16、19号外显子和启动子区域。T-DNA在外显子中的插入突变引起胚胎发育异常并导致胚胎和种子败育。将野生型拟南芥复制因子C亚基1基因转化到突变株系rfc1-1和rfc1-2后恢复了突变株的野生型表型,证明胚胎发生异常表型是由拟南芥复制因子C亚基1基因突变所引起的,AtRFC1在拟南芥胚胎发生中起重要作用。     

过表达VHA-c1基因对拟南芥根长及ABA与糖响应的影响

为初步探讨液泡H+-ATPase c亚基基因(VHA-c1)在植物生长发育及信号转导中的作用,该实验构建了拟南芥VHA-c1的过表达载体,转化并获得转基因拟南芥纯合株系,通过半定量RT-PCR技术分析了VHA-c1的表达量,然后对其进行暗培养、ABA和糖处理。结果显示:(1)该实验获得7个T2代转基因纯系,其mRNA表达水平均高于野生型,表明过表达载体的构建是有效的。(2)黑暗条件下,6个拟南芥VHA-c1过表达纯合株系的根长变短。(3)光照条件下,4个转基因株系主根伸长和子叶的展开以及7个转基因株系的种子萌发对ABA的抑制不敏感。(4)分别有5个和4个转基因株系的种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制不敏感。推测VHA-c1可能参与了ABA和糖介导的信号转导途径,并可能影响了拟南芥根细胞的扩展。     

外源1Dx5基因导致小麦高分子量麦谷蛋白亚基表达变异

目的:为了结合基因枪转化和传统杂交方法培育优质小麦品种,对转基因小麦和国内主栽小麦品种杂交后代外源基因遗传表达行为进行了研究。方法:采用SDS-PAGE对2个小麦杂交组合川89-107×B72-8-11b和鄂麦18×B72-8-11b的杂交及回交后代籽粒进行高分子量麦谷蛋白亚基遗传表达分析。结果:在亲本中能够稳定超量表达的外源基因1Dx5在杂交后代中出现了不同的表达量,而且在外源基因的影响下,杂交后代出现了新的、杂交亲本并不表达的高分子量麦谷蛋白亚基。结论:多拷贝的外源基因在不同于受体环境的细胞质中的表达发生了变化,且由于外源基因的插入引起了内源高分子量麦谷蛋白亚基组成的变异。     

酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化

目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5启动子驱动外源基因的表达

将小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的胚乳组织特异性表达启动子驱动的外源突变型1Dx5基因和gus基因导入小麦中.对其转基因植株连续3代的跟踪研究表明,突变型1Dx5基因的重复序列导致其表达蛋白分子量增大,并影响其它1Bx17 1By18亚基基因的表达.组织化学分析观察到gus基因在1Dx5基因启动子驱动下的表达表现出胚乳组织特异性,在开花2周后开始表达,表达量呈持续上升,至腊熟期达到最高,其次为籽粒成熟期.     

宽频噪音对谷氨酸中毒损伤AD模型大鼠不同脑区NMDAR1(ζ1)、NMDAR2A(ε1)亚基表达的影响

目的:观察AD大鼠模型颞叶和额叶在98 dB宽频噪音暴露5 min后不同脑区NMDAR1(ζ1)、NMDAR2A(ε1) 表达的影响.方法: 采用Western Blot及 RT-PCR技术,结合ABR测定方法.结果:①AD模型组大鼠、空白对照组大鼠在98 dB宽频噪音暴露5 min后额叶、颞区、海马及小脑NMDAR1(ζ1)亚基表达无明显差异,但AD模型组表达明显弱于空白对照组;②生理盐水组加噪音后NMDAR1(ζ1)亚基小脑表达最强,颞叶最弱; NMDAR2A(ε1)表达最强为颞叶,海马最弱.③在海马三组大鼠NMDAR1(ζ1) 、NMDAR2A(ε 1)亚基表达有较明显的下调趋势;④空白对照组大鼠NMDAR1(ζ1)、NMDAR2A(ε1)亚基mRNA表达各区无差异.⑤AD模型组大鼠颞叶、海马NMDAR2A(ε1) 表达明显减弱 ,最弱为小脑,额叶次之.结论:噪音刺激抑制AD大鼠模型海马NMDAR1(ζ1)亚基表达,且不在mRNA水平.噪音刺激抑制AD模型大鼠颞叶、海马NMDAR2A(ε1) 亚基表达,且有部位差异,在mRNA水平已调节.     

过表达AhAREB1影响GA代谢调控拟南芥的株型

与野生型相比,过表达AhAREB1的拟南芥植株茎节间的生长受抑制,花序轴短和分枝数多。普遍认为植株的矮化可能与植物体内促进生长的激素作用的异常有关。本文测定了过表达AhAREB1植株体内激素GA3、IAA和ABA含量,并通过外施ABA、IAA和GA3观察植株表型变化及检测相关基因表达,研究AhAREB1在植物株型方面的作用。结果表明,与野生型植株相比,过表达AhAREB1拟南芥植株内源ABA、IAA和GA含量均升高,外施GA3可使植株的表型恢复至野生型水平,推测AhAREB1通过影响GA代谢失活及降低其生理活性水平而引起株型矮化。     

斜纹夜蛾铁硫亚基蛋白的表达及功能鉴定

铁硫亚基蛋白(rieske iron-sulfur protein, RISP) 是线粒体复合物Ⅲ的关键蛋白亚基之一, 在呼吸链电子传递过程中起到重要作用。本研究通过RT-PCR克隆得到斜纹夜蛾Spodoptera litura RISP基因SlitRISP的ORF, 构建了pET32a-SlitRISP原核表达载体, SDS-PAGE和Western blot检测结果显示, SlitRISP原核表达蛋白以包涵体的形式存在于菌体沉淀中, 且RISP抗体可成功用于该蛋白的免疫印迹检测。为了进一步鉴定SlitRISP在斜纹夜蛾离体细胞系SL-1中的功能, 通过向细胞内转染siRNA, 利用RNAi技术沉默SL-1中的SlitRISP。qRT-PCR结果表明, 分别经50 nmol/L和100 nmol/L siRNA处理48 h后, SL-1中SlitRISP的表达均几乎完全被抑制; Western blot结果显示, SL-1中SlitRISP含量显著低于CK。当SL-1 SlitRISP被成功沉默后, 通过检测SL-1线粒体膜电位、 细胞ATP含量和细胞增殖抑制率鉴定RISP在线粒体电子传递过程中的重要作用。流式细胞仪测定结果表明, 经50 nmol/L和100 nmol/L siRNA处理24 h后, SL-1线粒体膜电位相对于CK分别降低23.52%和11.32%, 而处理48 h后, SL-1线粒体膜电位则分别升高5.58%和27.66%; siRNA处理24 h和48 h后, SL-1 ATP含量相对于CK分别降低82.71%和84.50%, 最终导致SL-1细胞增殖抑制率分别为53.64%和67.94%。这些结果表明SlitRISP在SL-1中参与线粒体膜电位的形成和细胞ATP的合成。介于RISP在线粒体电子传递链中的重要作用, 其可能成为新型杀虫作用靶标, 这可为研制新型呼吸抑制剂提供参考。     

玉米叶绿体偶联因子ε亚基基因在E.coli中的表达

玉米叶绿体偶联因子ε亚基基因（ａｔｐＥ）被克隆到载体ｐＪＬＡ５０５和ｐＷＡ的多聚接头处,形成重组质粒ｐＪＬＡ５０５－ａｔｐＥ和ｐＷＡ－ａｔｐＥ,转化Ｅ．ｃｏｌｉ,并进行温敏诱导表达研究。在大肠杆菌中温敏诱导的基因表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,表达量达全菌蛋白质的３０％以上．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析结果表明温敏诱导的表达产物可特异性地与ε亚基抗体反应,在免疫双扩散中也观察到沉淀线。大肠杆菌表达的玉米叶绿体ａｔｐＥ基因产物以包含体形式存在于细菌中。经对包含体处理后;获得的粗产物可达８０％以上纯度,并具有天然ε亚基蛋白质的生物功能．     

紫萍磷转运蛋白1;1 cDNA序列的克隆及表达模式

紫萍Spirodela polyrrhiza是一种在生物质资源开发利用和水体生物修复中广泛使用的漂浮植物.随着水体富营养化日益严重,紫萍在水面随处可见.有文献报道紫萍对水体中的氮和磷有良好的净化作用.为了深入研究紫萍对水体中无机磷的吸收和转运,以紫萍为材料提取RNA反转录为cDNA,以此为模板,扩增得到1条特异性片段,...     

拟南芥GH3.9基因的过表达及其表型分析

为研究GH3.9基因在植物生长发育过程中的作用,利用RT-PCR成功克隆到GH3.9基因,该基因全长为1 750bp。通过构建pEGAD-GH3.9过表达载体转化拟南芥,获得过表达GH3.9基因纯系转基因株系GH3.9ox-3和GH3.9ox-7。对拟南芥野生型(WT)和转基因株系(GH3.9ox-3和GH3.9ox-7)幼苗用不同光强和光质进行处理,结果显示:在蓝光、红光、远红光等不同光照强度下培养,过表达株系幼苗下胚轴的生长均明显受到抑制,且较野生型明显;采用不同光周期处理拟南芥幼苗,过表达幼苗下胚轴的伸长明显低于野生型;对成年植株表型进行观察,发现过表达株系植株矮小、雄蕊变短、果荚短小。研究表明:GH3.9基因参与了拟南芥生长发育调控,过表达GH3.9基因对拟南芥生长有抑制作用。     

盐地碱蓬叶片液泡膜H+-ATPase B亚基的克隆及盐胁迫下表达分析

植物液泡膜H -ATPase在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na 区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用.本实验从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)cDNA文库分离到碱蓬叶片液泡膜H -ATPase B亚基cDNA克隆.测序表明该基因长达1 974 bp,开放阅读框有1 470 bp编码489个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量约为54.29 kD.Northem及Western印迹表明盐地碱蓬液泡膜H -ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导,并且在NaCl胁迫下,B亚基在转录及翻译水平上与液泡膜H -ATPase c亚基存在协同作用.盐胁迫下,盐地碱蓬液泡H -ATPase B亚基与c亚基的协同表达增加了液泡H -ATPase的数量,从而提高了液泡H -ATPase活性,为碱蓬叶片液泡Na 区域化提供了动力,最终提高了碱蓬植株的耐盐性.     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达载体的构建

采用PCR技术将霍乱弧菌CTB基因的终止密码子定点突变并引入一个EcoR Ⅰ位点,然后与人工合成的Linker连接,构建成了新颖的融合蛋白表达载体。在CTB 3′端的Linker上有四个单一人酶切位点,在任何限制性位点融合外源基因序列后,都可在3′端形成转译终止密码子。     

藻蓝蛋白亚基脂质体光动力作用对LKB1在乳腺癌细胞中表达的影响

为了探讨肿瘤抑制因子LKB1蛋白在肿瘤光动力疗法中作用,先用MTT法检测藻蓝蛋白亚基脂质体（PEG-PCS-Lip）对人乳腺癌细胞MCF-7,鼠乳腺癌细胞MA-782的光动力杀伤效果,分光光度法检测活性氧ROS的产量,Western blot检测LKB1激酶表达水平;然后用免疫组织化学方法观察PEG-PCS-Lip介导的光动力作用在乳腺癌模型鼠对LKB1基因表达影响. 结果显示在光照剂量为29.17 J/cm2时,用0~25 μg/mL PEG-PCS-Lip处理会小幅度促进MA-782和MCF-7细胞的生长,同时细胞中的ROS和LKB1蛋白的量下降;当用25~100 μg/mL PEG-PCS-Lip处理则明显抑制MA-782和MCF-7细胞的生长,同时细胞中的ROS和LKB1蛋白的量随PEG-PCS-Lip量的增加而增加.用10 mg/kg PEG-PCS-Lip静脉注射荷瘤小鼠,光照剂量为208.2 J/cm2时,其抑瘤率可达到68.9 %,LKB1在乳腺癌组织中的表达量则增加了33.9 %,同时,LKB1激酶从细胞核转移到细胞质的量也在增加. 因此,PEG-PCS-Lip PDT作用所产生的ROS可能是激活LKB1的表达的原因之一,二者协同作用在一定的光敏剂浓度范围内增强了PDT抑制肿瘤生长的疗效.     

LC-MS分析CmSnf1基因过表达对蛹虫草代谢组的影响

Sucrose-nonfermenting1(SNF1)蛋白激酶调节大量基因的转录,改变代谢酶的活性,并控制各种营养反应性细胞发育过程。本研究通过LC-MS非靶向代谢组学技术比较蛹虫草Cordyceps militaris野生型菌株Cm01和CmSnf1基因过表达菌株菌丝体的化学成分,从整体代谢物水平阐明CmSnf1基因过表达对蛹虫草代谢产物积累的影响。研究表明：CmSnf1基因过表达后,在LC-MS正负离子模式下检测出547种差异代谢物,同野生型菌株相比,220种产物上调和327种下调。尤其显著的是黄酮类物质2-香叶基-3,4,2′,4′-四羟基二氢查耳酮上调了140.55倍,甘油磷脂代谢中的磷脂酰丝氨酸(PS)下调了47.53倍。差异代谢产物参与甘油脂代谢、氨基酸生物合成和降解、半乳糖代谢、丙酮酸和酮类化合物代谢等多种途径。CmSnf1过表达菌株与野生型相比在酮类化合物代谢上具有优势,推测CmSnf1基因在蛹虫草药用功效中发挥着重要的作用。     

黑腹果蝇GABA受体GRD亚基和LCCH3 亚基的克隆、表达与鉴定

昆虫GABA受体（γ-aminobutyric acid receptor, GABAR）是杀虫剂的重要靶标之一。本研究以黑腹果蝇Drosophila melanogaster整体组织的cDNA作为模板, 采用RT-PCR技术扩增了黑腹果蝇GABA受体LCCH3亚基和GRD亚基的cDNA序列, 并克隆至pET-32a表达载体上, 测序结果表明获得的序列与基因库中已发表的序列一致性在99%以上, 无移码突变。在IPTG的诱导下, LCCH3基因成功在大肠杆菌Escherichia coli中表达, 而GRD基因未表达。通过包涵体洗涤、变性、Ni²⁺亲合层析纯化、稀释复性获得纯化的重组表达的LCCH3蛋白, 并用圆二色谱测定了目标蛋白的二级结构, 主要富含β结构。该研究结果为研究昆虫GABAR的结构和功能关系提供了重要的参考数据。