转座子Tn5-Mob对菜豆根瘤菌共生基因的诱变、转移和初步定位

转座子Tn5-Mob在质粒RP4-4配合下能诱动(Mobilization)菜豆根瘤菌RCR3622内源质粒的诱动转移。在种间根瘤菌杂交过程中,二个巨型质粒的转移频率均大于10~(-3);分子量约为285kb的psym3622是带有结瘤(nod)和产黑素(mel)基因的共生质粒(Symbiotic plasmid);这二个基因的最大距离不超过70kb左右。另一个分子量约为135kb的质粒在试验中为不具结瘤功能的隐蔽质粒。将psym3622共生质粒导入不结瘤(Nod-)的豌豆根瘤菌菌株B151,能够使后者在菜豆植物上表达结瘤的特性,形成无效根瘤。将psym3622共生质粒导入不结瘤的菜豆根瘤菌菌株JI8400,能够在菜豆植物上形成正常发育的有效根瘤。     

菜豆根瘤菌sym和mel基因在农杆菌中的转移和表达

豆根瘤菌(Rhizobium phaseoli)共生质粒pSYM3622具有诱导宿主植物(phaseolusvulgaris cv."Jamapa")结瘤固氮的有效基因,以及菜豆根瘤菌特征性的产黑素基因(Melanin production gene)。在诱动因子RP4的存在下,共生质粒能够有效地向三叶草根瘤菌和农杆菌转移。种间和属间杂交子都能诱导菜豆植物形成无效根瘤,并且具备在特定培养基上产生黑素的能力。pSYM3622在三叶草根瘤菌菌株RCR226中具有明显的不亲和性,但是在农杆菌杂交子中,这些结癌和产生黑素的特征在植物根瘤分离菌中能够稳定地保持下去。试验同时研究了pSYM3622向假单胞菌和大肠杆菌的诱动转移。     

菜豆根瘤,类根瘤以及根颈瘤的细胞学观察

菜豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv.phaseoli)的共生质粒 pSym 3622转移到具有 C58染色体背景的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中以后,杂交子可以通过伤口感染菜豆(Phaseolus vulgaris)根系,并在接种位点周围诱导类根瘤形成。类根瘤的结构与根瘤和菜豆根颈瘤的结构完全不同,其维管组织位于中央,周围为含有丰富淀粉粒的、高度液泡化的薄壁细胞,而且它的任何细胞以及胞间隙内均不含细菌。但是菜豆有效根瘤则含有大片含菌细胞区,不仅其细胞含有类菌体,而且在胞间隙中也存在细菌。由农杆菌 A208(pTiT37)所诱导的菜豆根颈瘤的任何细胞和胞间隙内也不含细菌。肿瘤的内部结构可以明显地分成许多不同的细胞层次,它们分别起源于不同的分生区;并且其内还可以分化出根伏突起,通过继续发育而形成新根系。此外肿瘤内许多区域的细胞都有明显解体的现象。     

水杨酸诱导普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病性的研究

普通菜豆是人类主要食用豆类之一,其营养价值高、栽培面积大。镰孢菌枯萎病是普通菜豆典型的土传病害,给普通菜豆生产带来严重损失。水杨酸(SA)被认为是诱导植物抗病反应的重要信号分子之一,参与植物的过敏反应(HR)和系统获得性抗性反应(SAR)。本研究通过不同植物激素处理普通菜豆BRB-130,结果表明,SA处理普通菜豆叶片使植株根中SA的含量升高,并显著提高植株对枯萎病原菌FOP-DM01菌株的抗性。SA诱导普通菜豆根组织中苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶活性及过氧化氢的含量显著升高,从而诱导普通菜豆产生HR和SAR。因此,SA作为普通菜豆抗病信号途径中重要的化学激活因子,能够显著提高普通菜豆对枯萎病原菌的抗病性,为发展环境友好型化学农药提供新的思路。     

西花蓟马取食与机械损伤对菜豆叶片抗氧化系统的影响

本文研究了西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)取食和机械损伤诱导对菜豆抗氧化系统的影响,比较了不同损伤形式诱导的抗氧化酶活力和抗氧化物质含量的变化差异。结果表明,西花蓟马取食和机械损伤均可诱导菜豆叶片内过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)3种抗氧化酶活性有不同程度的升高,但两种处理诱导的抗氧化酶活性变化规律不完全相同,各种酶活性达到最高点时间不同,西花蓟马取食对抗氧化酶活力的诱导作用大于机械损伤的。两种处理诱导下的类胡萝卜素的含量变化不大,但不论西花蓟马取食还是机械损伤均导致菜豆叶片内类黄酮和总酚含量整体呈下降趋势,西花蓟马的取食诱导的下降幅度大于机械损伤的。因此,西花蓟马取食诱导明显高于机械损伤对菜豆抗氧化系统的影响。     

固氮作用

863252一种与菜豆根瘤菌基因连接的质粒psi抑制产生外多糖并且是共生固氮所需要的〔会,英〕/Borthakur,D.…厂Abs,6thl:卜ternatl.Syrn.NitrogenFixation一1985,9一03 菜豆根瘤菌(Rhi:obium力haseoli)一个菌株在消除了其共生质粒pRPZ月之后,保持制造外多糖(EPS)的能力。但是,pRPZJI的一段,当以增加的拷贝数克隆在广范宿主载体中并转移到这个或别的根瘤菌菌株中时,抑制了EPS合成。这种基因称为Psi(抑制多糖)并定位于共生质粒中靠近结瘤和固氮基因的一个区段。Psi在共生作用中是重要的,因为一株含有克隆在多拷贝质粒上的PSi的野生菌…     

丹皮多糖PSM_(2b)体外对小鼠免疫细胞功能的影响

中药丹皮提取的丹皮多糖有效部位PSM2b在体外能直接促进小鼠脾细胞增殖 ,并能协同ConA诱导的脾细胞增殖作用。对小鼠腹腔巨噬细胞亦有激活作用 ,可增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红 ;诱导巨噬细胞合成一氧化氮。结论 :PSM2b可增强T淋巴细胞功能 ,并对巨噬细胞具有激活作用     

丹皮多糖PSM2b体外对小鼠免疫细胞功能的影响

中药丹皮提取的丹皮多糖有效部位PSM2b在体外能直接促进小鼠脾细胞增殖,并能协同ConA诱导的脾细胞增殖作用,对小鼠腹腔巨噬细胞亦有激活作用,可增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红,诱导巨噬细胞合成一氧化氮。结论：PSM2b可增强T淋巴细胞功能,并对巨噬细胞具有激活作用。     

外源茉莉酸诱导的菜豆叶片生化抗性及其对西花蓟马体内保护酶和解毒酶活性的影响

为探讨外源茉莉酸诱导的菜豆叶片抗性及对西花蓟马体内酶活性的影响,在室内对菜豆植株分别喷施1、0.1、0.01和0.001 mmol·L^-1 4个浓度的茉莉酸,以健康植株为对照,分别于处理后1、5和10 d测定菜豆叶片营养物质及次生物质的含量.另在同样处理叶片上分别接西花蓟马2龄若虫,分析其体内保护酶和解毒酶活性的变化.结果表明: 不同浓度茉莉酸处理1 d后,菜豆叶片的蛋白质含量和健康植株没有明显差异,但在5和10 d时显著低于健康植株;菜豆叶片游离氨基酸含量在茉莉酸处理1 d后显著高于健康植株,之后逐渐降低;茉莉酸处理下菜豆叶片可溶性糖含量显著低于健康植株,并随着茉莉酸浓度的升高和处理时间的延长而进一步下降;叶绿素含量在处理1 d后显著降低,随着处理时间的增加逐渐升高.叶片单宁、黄酮和总酚的含量在不同浓度茉莉酸和处理时间下均显著高于对照.蓟马取食导致菜豆叶片生化物质含量的变化与外源茉莉酸诱导的相似.西花蓟马取食茉莉酸处理的菜豆植株24 h后,体内保护酶系(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶)和解毒酶系(谷胱甘肽S-转移酶、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶)均明显高于健康植株,但茉莉酸浓度与处理时间对其影响程度不同.取食虫害菜豆叶片后西花蓟马体内酶活性的变化与取食外源茉莉酸诱导的叶片相似.说明外源茉莉酸处理可诱导菜豆植株的抗性,西花蓟马取食处理后的菜豆叶片可产生明显的反防御来适应寄主植物的变化.     

西花蓟马对不同处理菜豆及其挥发物的行为反应

利用Y型嗅觉仪比较了西花蓟马雌成虫对健康、机械损伤、西花蓟马若虫为害、西花蓟马成虫为害、外源茉莉酸和水杨酸甲酯诱导的6种不同处理菜豆的行为反应差异,并测定了西花蓟马对8种挥发物标样在不同浓度下的行为反应。结果表明:西花蓟马对不同处理菜豆的反应不同,与干净空气相比,外源茉莉酸与水杨酸甲酯诱导的菜豆对西花蓟马有明显的驱避作用,而其他处理的菜豆与空气之间没有明显的差异;健康菜豆和机械损伤菜豆对西花蓟马的吸引作用明显高于其他处理的菜豆;在健康菜豆和机械损伤菜豆的组合中,西花蓟马并未表现出明显的偏好性;外源茉莉酸和水杨酸甲酯诱导处理的菜豆与其他处理的菜豆相比对西花蓟马均具有显著的驱避作用,但前者对西花蓟马的驱避作用明显弱于后者;8种挥发物单体(10-1~10-5μL·μL-1,浓度以10倍递减)对西花蓟马的行为反应显示,叶醇不论在何种浓度下始终对西花蓟马有明显的引诱作用,α-蒎烯、1-辛烯-3-醇、乙酸叶醇酯和异戊醇则是分别在10-2~10-5、10-4~10-5、10-4~10-5、10-3μL·μL-1时,才具有显著的引诱作用,叶醛、环戊醇和异戊醛分别在10-1~10-3、10-1~10-4、10-4μL·μL-1浓度下对西花蓟马具有强烈的排斥作用。     

低磷和铝毒胁迫条件下菜豆有机酸的分泌与累积

以水培方式研究了低磷、铝毒胁迫条件下,不同菜豆基因型根系有机酸的分泌及其在植穆不同部位的累积,结果表明,低磷,铝毒胁迫诱导菜豆有机酸的分泌与累积存在显著的基因差异。低磷、铝毒胁迫诱导菜豆主要分泌柠檬酸、酒石酸和乙酸,其中,50μmol/LAl^3 诱导柠檬酸分泌量最高;低磷（小于20μmol/LH2PO4^－）胁迫诱导柠榨菜酸分泌量显著高于高磷处理,但低磷处理之间差异不明显,铝毒胁迫诱导菜豆有机酸的分泌与累积显著高于低磷胁迫处理,低磷,铝毒胁迫植株不同部位有机酸的含量为叶片大小根系,低磷,铝毒胁迫时,G842菜豆型柠檬酸有机酸分泌总量显著高于273、AFR和ZPV,其干重和磷吸收明明显于大G273,AFR和ZPV,且铝吸收量小于G273,AFR和ZPV,说明,G482菜豆基因型对低磷,铝毒的适应能力强于G273,AFR和ZPV基因型,菜豆有机酸,,尤其柠檬酸的分泌是其适应低磷、铝毒胁迫的重要生理反应。     

铝毒胁迫诱导菜豆柠檬酸的分泌与累积

水培试验结果表明 ,铝毒诱导菜豆柠檬酸的分泌与累积存在着显著的基因型差异 .Al3 + 浓度 <5 0 μmol·L-1时 ,柠檬酸分泌量随Al3 + 浓度的增大而增加 ;Al3 + 浓度在 5 0～ 80 μmol·L-1时 ,柠檬酸分泌量随Al3 + 浓度的增大而减小 .不同菜豆基因型以G1984 2的柠檬酸分泌量最大 ,单位干重Al吸收量最小 .铝毒胁迫时 ,不同菜豆基因型叶片柠檬酸累积量无明显差异 ,根系柠檬酸累积量为G1984 2 >AFR >ZPV >G5 2 73.菜豆柠檬酸分泌量缺P处理 <铝毒胁迫 ,5 0 μmol·L-1LaCl3 不能诱导菜豆分泌柠檬酸 ,表明柠檬酸的分泌与累积是菜豆抗铝毒胁迫的重要生理反应     

外源茉莉酸诱导菜豆对西花蓟马和南方小花蝽的行为反应

【目的】为明确茉莉酸诱导的菜豆对西花蓟马Frankliniella occidentalis和南方小花蝽Orius similis的行为反应。【方法】采用四臂嗅觉仪测定了西花蓟马和南方小花蝽对不同浓度茉莉酸诱导菜豆后的行为反应,并用气相色谱-质谱联用仪测定了不同浓度茉莉酸处理后菜豆挥发物的成分。【结果】不同浓度茉莉酸处理的菜豆植株对西花蓟马和南方小花蝽分别有不同程度的驱避和吸引作用,以1 mmol/L的茉莉酸处理植株对西花蓟马的驱避作用最强,0.1 mmol/L的茉莉酸处理植株对南方小花蝽的吸引作用最强。不同处理菜豆的挥发物在含量和成分上存在显著差异,(Z)-3-己烯丙酸酯、2-异丙基-甲氧基毗嗦只有在茉莉酸处理植株中检测到。结合不同浓度茉莉酸处理植株对西花蓟马和南方小花蝽的行为反应及菜豆挥发物含量的变化趋势,推测(E)-2-己烯醛对西花蓟马有驱避作用,(E)-2-乙酸叶醇酯对南方小花蝽具有引诱作用。【结论】茉莉酸处理菜豆后,植物挥发物种类和含量发生了变化,在增强菜豆植株抗虫性的同时,还可增强捕食性天敌南方小花蝽的搜索和捕食能力。     

TIBA、LaCl_3、Verapamil和TFP对菜豆下胚轴生长素诱导的导管分化和形成的效应

通过ＴＩＢＡ、ＬａＣｌ３、Ｖｅｒａｐａｍｉｌ和ＴＦＰ对菜豆下胚轴导管分化和形成的调控作用,证明生长素、Ｃａ２＋和ＣａＭ是木质部导管分化和形成所必需的。ＮＡＡ能诱导菜豆下胚轴导管的分化;ＴＩＢＡ能抑制生长素类诱导的导管分化和形成;ＬａＣｌ３和ＴＦＰ在导管分化诱导期（最初２４ｈ）具抑制作用;Ｖｅｒａｐａｍｉｌ与ＴＩＢＡ相似,在导管分化诱导期和导管形成期（伤口形成后７２ｈ之内）都有抑制作用。     

TIBA,LaCl3,Verapamil和TFP对菜豆下胚轴生长素诱导的导管分化…

通过ＴＩＢＡ、ＬａＣｌ３、Ｖｅｒａｐａｍｉｌ和ＴＦＰ对菜豆下胚轴导管分化和形成的调控作用,证明生长素、Ｃａ＾２＋和ＣａＭ是木质部导管分化和形成所必需的。ＮＡＡ能诱导菜豆下胚轴导管的分化;ＴＩＢＡ能抑制生长素类诱导的导管分化和形成;ＬａＣｌ３和ＴＦＰ在导管分化诱导期（最初２４ｈ）具抑制作用;Ｖｅｒａｐａｍｉｌ与ＴＩＢＡ相似,在导管分化诱导期和导管形成期（伤口形成后７２ｈ之内）都有抑制作用。     

鼠疫抗原LcrV在乳酸乳球菌中的表达与鉴定

目的以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)为载体,将鼠疫抗原LcrV基因导入乳酸乳球菌内,构建重组肠道微生态菌株,作为黏膜免疫疫苗的先期探索和尝试。方法采用酸诱导P170启动子,乳酸乳球菌本身的SP310mut2信号肽,将鼠疫杆菌LcrV抗原结构基因克隆到质粒pAM J397上,电转化感受态Lactococcus lactis PSM565。结果经重组子PCR鉴定,SDS-PAGE检测,W estern-b lot鉴定,在Lactococcus lactisPSM565/pAM J397-V培养基上清中获得了38 kD的鼠疫抗原LcrV蛋白。结论在乳酸乳球菌中成功表达了鼠疫V抗原,为下一步鼠疫黏膜疫苗的研制打下基础。     

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体RL1的表达及其抗凋亡作用

单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体(LAT)-RL1对放线菌素D诱导的凋亡作用的研究。构建重组pEGFP-RL1质粒,转染Vero细胞,RT-PCR及荧光鉴定重组质粒的表达。放线菌素D诱导Vero细胞凋亡,通过Hochest33342荧光染色观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1荧光观察膜电位变化,Caspase 3凋亡蛋白检测。RT-PCR和荧光观察表明该真核表达载体能在Vero细胞中高表达。Hochest33342染色转染了pEGFP-RL1的Vero细胞经放线菌素D凋亡诱导后,细胞形态正常。流式结果表明转染重组质粒pEGFP-RL1且经诱导凋亡组与正常对照组凋亡率无差异,而显著低于诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2诱导凋亡组。转染重组质粒pEGPF-RL1的细胞JC-1染色后,红色细胞的比例要远大于绿色细胞的比例,而转染空质粒pEGFP-C2被染成绿色细胞的数量较多。Caspase-3结果表明转染了空质粒pEGFP-C2的Vero细胞经诱导凋亡后,活性显著高于转染了pEGFP-RL1经放线菌素D诱导凋亡后的Vero细胞和正常Vero细胞。HSV-2 LAT RL1具有抗放线菌素D诱导的Vero细胞的凋亡作用。     

害虫取食和机械损伤对菜豆不同部位叶片防御酶活性的影响

【目的】本研究旨在探究菜豆Phaseolus vulgaris植株对不同害虫危害的系统防御机制。【方法】分别以斜纹夜蛾Spodoptera litura、二斑叶螨Tetranychus urticae、西花蓟马Frankliniella occidentalis取食或昆虫针穿刺处理菜豆中部叶片6,24,48,72和96 h后,测定菜豆植株中部处理叶片以及上部和下部未处理叶片的过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化。【结果】不同害虫取食后,POD,CAT和SOD活性在受害的菜豆中部叶片发生了明显变化,但不同害虫造成酶活性的变化趋势不同。与未处理的对照植株中部叶片相比,POD活性均是先升高后恢复至对照水平。POD活性在二斑叶螨取食后,于24 h达到最大值,是对照的4.6倍;POD活性在机械损伤和西花蓟马取食后在48 h达到峰值,而斜纹夜蛾取食诱导下POD活性升高最缓慢,直到72 h才达到最大值。中部叶片的CAT活性在机械损伤和3种害虫取食后变化不同,机械损伤24 h后CAT活性明显升高,而3种害虫取食后CAT活性变化较早,在6 h就明显升高,但随时间的延长,CAT活性的变化趋势不同。中部叶片SOD活性在不同处理下变化较大,在机械损伤诱导下仅在96 h明显升高,而二斑叶螨取食24 h以后均明显升高;但斜纹夜蛾及西花蓟马取食后,SOD活性在72 h时受到明显的抑制。在菜豆植株的上部和下部未受害叶片中,3种害虫取食和机械损伤处理后,以上3种酶的活性也发生了明显变化,POD活性在上部未受害叶片不同处理96 h时被抑制,而在下部叶片不同处理下均被激发,但诱导程度不同。机械损伤、斜纹夜蛾、二斑叶螨和西花蓟马处理后,菜豆植株上部和下部未受害叶片CAT活性都分别在24,6,6和24 h被明显诱导。上部和下部未受害叶片SOD活性在机械损伤96 h,斜纹夜蛾和二斑叶螨取食72 h后,均被明显激发;但西花蓟马取食后,SOD活性在48 h和72 h明显被抑制。【结论】斜纹夜蛾、二斑叶螨和西花蓟马取食均能显著诱导菜豆植株受害叶和未受害叶防御酶活性的变化,即引起菜豆植株的系统防御反应,但3种害虫诱导的防御酶活性变化程度不同,表明植物防御反应的时空效应与害虫种类有关。     

蓟马取食、机械损伤以及外源水杨酸甲酯和茉莉酸对菜豆叶片防御酶活性的影响

【目的】探讨菜豆对昆虫取食防御反应的生化机制。【方法】研究了西花蓟马Frankliniella occidentalis取食、机械损伤以及外源水杨酸甲酯（MeSA）和茉莉酸（JA）处理后菜豆叶片防御酶活性的变化。【结果】西花蓟马取食、机械损伤及MeSA和JA处理均能明显提高过氧化物酶（POD）的活性,前2种处理POD活性在72 h上升到最高峰,而后2种处理则在48 h达到最高峰。蛋白酶抑制剂（PI）活性在西花蓟马取食后升高最明显。JA途径关键酶脂氧合酶（LOX）和多酚氧化酶（PPO）的活性在西花蓟马取食、机械损伤和JA诱导处理均升高,但外源MeSA诱导处理则不能诱导它们的活性(P>0.05)。SA途径的关键酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）在西花蓟马取食和机械损伤后均有一个先升高后下降的过程,外源MeSA诱导只在24 h引起PAL活性升高,其余时间下和对照没有明显的区别,外源JA诱导未能引起PAL活性的显著变化(P>0.05)。西花蓟马取食、JA和MeSA诱导以及机械损伤均能诱导β-1,3 葡聚糖酶（PR-2）活性上升(P<0.05)。【结论】结果说明,不同处理可诱导菜豆植株产生明显的防御反应,但酶活性的变化与处理方式和处理时间有关。     

短芽孢杆菌a-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用PCR方法扩增短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pALDl。pALDl中的ALDC基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶80单位以下,比原始菌株提高200余倍。SDS-PAGE蛋白质分析表明,大肠杆菌DH5α(pALDl)表达的ALDC占细胞总蛋白量的40％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌DH5α(PALDl)和HB101(pALDl)分别在无选择压力下30℃连续培养50代以上,41℃诱导不同时间,DH5α(pALDl)在热诱导5h后,未发现质粒不稳定性,HB101(pALDl)在热诱导3h后,质粒基本稳定,但热诱导5h后,丢失质粒的细胞约占70％。