HSP70系统分析与ER的起源

HSP 70是迄今研究过的进化上最保守的蛋白质之一,是分子伴侣的主要成分,对蛋白的跨膜转运及特定构象的维持等起着重要作用。对其序列进行系统分析表明,古细菌,真细菌和真核细胞内的HSP 70虽具有很强的相似性,但各具特点。真核细胞各区室(细胞器)的HSP 70顺序也既有共性,又有特性。根据ER HSP 70的特点,可推测出ER起源于真核细胞诞生的早期阶段,并由此引起细胞内的区室化,这是真核细胞区别于原核细胞的本质特征之一。     

荷斯坦牛HSP70-1基因遗传多态性与乳腺炎抗性关系

以253头中国荷斯坦奶牛为研究对象, 检测HSP70-1基因的多态性, 并分析其多态性与中国荷斯坦牛体细胞评分(Somatic cell score, SCS)的相关性。首先以PCR-SSCP法寻找HSP70-1基因编码区的突变, 并通过测序确定突变的类型, 根据突变类型寻找合适的内切酶, 最终采用PCR-RFLP方法鉴定实验牛基因型; 然后分析基因多态性与中国荷斯坦牛SCS的相关性。结果表明HSP70-1基因的1 623 bp处产生G→A→C突变, 2 409 bp处产生G→A突变, 两位点都是沉默突变, 未引起氨基酸序列的改变; 经χ2 适合性检验, 中国荷斯坦牛在两个位点均未达到Hardy-Weinberg平衡状态; 同时, 群体基因座不同基因型与SCS相关分析的结果表明, 2409位点基因型与SCS相关性不显著(P>0.05), 1623位点基因型与SCS相关性显著(P<0.05), CC型SCS显著低于AG、GG型(P<0.05), CC基因型为乳腺炎抗性基因型。在中国荷斯坦奶牛群体中, HSP70-1基因CC基因型可作为改良奶牛乳腺炎抗性性状的分子遗传标记。     

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE 技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4（GenBank 登录号为EU977182）。该基因全长2 182 bp,包含1 959 bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9 kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激（4℃）和热激（40℃）1 h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。     

HSP70单克隆抗体的制备

利用DEAE 离子交换和ATP 亲和层析法从热休克的大鼠肝脏中分离纯化了热休克蛋白 70 (HSP70 )。用它做抗原免疫小鼠 ,通过分离脾淋巴细胞和细胞融合技术 ,得到了杂交瘤细胞 ;用酶联免疫吸附测定法筛选出了阳性克隆 ;经过多次亚克隆、抗体的大量制备及分离纯化 ,得到了抗HSP70的单克隆抗体。用此一抗和Western免疫印迹技术分析了C6 大鼠神经胶质瘤细胞中HSP70的表达。     

雷蒙德氏棉HSP70基因家族的进化分析及其同源基因在陆地棉中的表达分析

热激蛋白70家族(HSP70)是一类在植物中高度保守的分子伴侣蛋白,在细胞中协助蛋白质正确折叠。文章利用隐马可链夫模型(HMM)在雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii L.)全基因组范围内进行HSP70基因家族成员进化分析,共得到30个HSP70家族成员。利用生物信息学对雷蒙德氏棉HSP70基因的结构、染色体分布、基因倍增模式以及系统进化进行分析,结果表明,HSP70基因家族根据亚细胞定位结果可分为不同的基因亚家族,各亚家族中HSP70基因具有相对保守的基因结构;染色体片段重复和串联重复是雷蒙德氏棉HSP70基因家族扩增的主要方式。通过对不同物种的HSP70基因家族进行系统进化分析可知,HSP70亚组的分化发生在单细胞植物形成前,且细胞质型HSP70成员大量扩增。比较陆地棉棉纤维发育不同时期的深度测序表达谱,发现HSP70基因可能参与棉纤维的生长发育。本研究结果有助于了解棉属植物HSP70基因家族的功能,以期为深入研究棉纤维发育过程中的分子调控机理提供基础。     

奶牛乳铁蛋白基因5’侧翼区遗传多态性及其与乳腺炎关联性分析

牛乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是保护乳腺组织的防御因子之一,是具有多种功能的糖蛋白,关于牛LF基因的多态性研究的报道较多,但其多态性与奶牛乳腺炎相关性的研究较少,文章采用PCR-RFLP、CRS-PCR对268头中国荷斯坦牛LF基因启动子区的-926(G/A)、-915(T/G)、-478(/G)、+72(T/C)突变进行基因型分型,应用最小二乘线性模型分析LF基因多态性与体细胞评分(Somatic cell score,SCS)的相关性,结果表明,新发现+72(T/C)和-478(/G)对SCS有显著影响,而其他两个位点对SCS影响不显著(P>0.05),+72(T/C)的AB基因型是优良基因型,其个体的SCS值均显著低于AA型(P<0.01),BB型个体(P<0.05).-478(/G)位点的C等位基因是优良的等位基因,CC基因型个体的SCS值极显著低于CD、DD基因型个体(P<0.01).因此,LF基因+72(T/C)的AB基因型和-478(/G)位点的CC基因型均是奶牛乳腺炎抗性的优良基因型,可作为分子标记应用于奶牛乳腺炎抗性筛选.     

奶牛乳铁蛋白基因5′侧翼区遗传多态性及其与乳腺炎关联性分析

牛乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)是保护乳腺组织的防御因子之一, 是具有多种功能的糖蛋白。关于牛LF基因的多态性研究的报道较多, 但其多态性与奶牛乳腺炎相关性的研究较少。文章采用PCR-RFLP、CRS-PCR对268头中国荷斯坦牛LF基因启动子区的-926(G/A)、-915(T/G)、-478(/G)、+72(T/C)突变进行基因型分型, 应用最小二乘线性模型分析LF基因多态性与体细胞评分(Somatic cell score, SCS)的相关性。结果表明, 新发现+72(T/C)和-478(/G)对SCS有显著影响, 而其他两个位点对SCS影响不显著(P>0.05)。+72(T/C)的AB基因型是优良基因型, 其个体的SCS值均显著低于AA型(P<0.01)、BB型个体(P<0.05)。-478(/G)位点的C等位基因是优良的等位基因, CC基因型个体的SCS值极显著低于CD、DD基因型个体(P<0.01)。因此, LF基因+72(T/C)的AB基因型和-478(/G)位点的CC基因型均是奶牛乳腺炎抗性的优良基因型, 可作为分子标记应用于奶牛乳腺炎抗性筛选。     

大鼠自发性高血压与HSP70基因关系的研究

本实验采用热休克蛋白７０核酸分子杂交方法,检测了自发性高血压大鼠和正常血压大鼠离体培养的主动脉平滑肌细胞受热刺激后ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ水平的变化以及整体动物肝组织ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ的水平,并对肝组织基因组ＤＮＡ进行了限制性酶切片段长度多态性分析。结果表明：３７℃培养的ＳＨＲ ＡＳＭＣ及整体ＳＨＲ肝组织ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ的基础表达水平均低于ＷＫＹ鼠,ＳＨＲ ＡＳＭＣ受热刺激（４２℃ １５ｍｉｎ）后２     

牛源HSP70基因点突变、分子进化和pET32a-c(+)原核表达

设计引物PCR方法克隆了奶牛1926bp的HSP70基因,连接到pGEMR○-T Easy Vector上测序,与NCBI上的序列比对,发现开放阅读框内的点突变(941位点,T→C),致使314位L(亮氨酸)→P(脯氨酸)。DNAstar Protean分析点突变对蛋白的原核表达一、二级结构、等电点进行了分析,结果显示螺旋转角区数目增多,不规则卷曲发生轻微变化,但其它指标均不变。此外,通过DNAstar MegAlign用Clustal V方法分析HSP70家族蛋白的同源性、氨基酸残基替换频率并构建了分子进化树,结果发现碱性、酸性氨基酸(R和K)、分支的氨基酸(V和L)、极性氨基酸(S和T)等在生物HSP70分子进化中氨基酸发生替换的频率最高,HSP70可以作为研究生物系统演化的一个重要的工具。在上述基础上,在HSP70基因上、下游引物分别加上EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,构建了pET-32a-c( )-bHSP70原核表达质粒,IPTG诱导成功得到重组牛源HSP70蛋白,293细胞和Hela细胞的体外实验表明原核表达的蛋白有抗凋亡生物活性[动物学报51(6)1080-1090,2005]。     

急性冷应激对牦牛乳腺上皮细胞 HSP70 mRNA 表达的影响

本文主要研究了急性冷应激对牦牛乳腺上皮细胞热休克蛋白７０ （Heat stress protein,ＨＳＰ７０） 表达量的影响。采用实时荧光定量ＰＣＲ 技术,以急性冷刺激１０℃ 为典型研究环境,分析了ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 表达的变化规律。结果显示,乳腺上皮细胞在１０℃分别冷处理２ ｈ、４ ｈ、６ ｈ 和８ ｈ,其ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 的表达量变化均不显著（Ｐ ＞０. ０５）;分别在１０℃冷处理２ ｈ、４ ｈ、６ ｈ 和８ ｈ,再复温培养４ ｈ,ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 的表达量均极显著增加（Ｐ ＜０. ０１）,于６ ｈ 达到峰值;在１０℃先冷处理４ ｈ,然后分别复温２ ｈ、４ ｈ、６ ｈ 和８ ｈ,ＨＳＰ７０ ｍＲＮＡ 的表达量亦均显著增加（Ｐ ＜０. ０１）,并于４ ｈ 达到峰值。结论：急性冷应激诱导牦牛乳腺上皮细胞ＨＳＰ７０ 表达量的增加不是发生在冷处理过程中,而是发生在复温过程中,并且在一定范围内随冷处理时间的增长表达量增高。     

人热休克蛋白70和热休克固有蛋白70的基因克隆和表达

目的:克隆人热休克蛋白70(HSP70)和热休克固有蛋白70(HSC70)基因,并在大肠杆茵中表达,获得重组蛋白.方法:用RT-PCR法从HepG2细胞中扩增HSP70及HSC70cDNA序列.测序后,将相应的cDNA插入pRSET-A表达载体,在大肠杆菌中表达,重组蛋白纯化后用SDS-PAGE及Western Blotting分析.结果:DNA序列结果显示.本研究所获得的HSP70及HSC70 cDNA序列与参考序列一致.将全长cDNA分别插入表达质粒后,转化BL21(DE3)细菌,在IPTG的诱导下,表达产物SDS-PAGE显示相应的分子量(70kDa)位置有明显的蛋白条带.Western Blotting结果证实了其为目的蛋白,经镍树脂柱纯化,获得了相应的重组多肽.结论:成功构建了原核表达重组质粒HSP70-pRSET-A和HSC70-pRSET-A,并获得了纯化的重组人HSP70和HSC70蛋白,为进一步研究这两种蛋白的结构、功能及临床应用奠定了基础.     

柞蚕热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

HSP70蛋白是受热等因素刺激后而诱导产生的蛋白质,是热休克蛋白家族中最重要的一员。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)热休克蛋白70基因(HSP70)的ORF序列(GenBank登录号:GU945199),该片段的序列长度为1905bp。生物信息学分析表明,该序列共编码634个氨基酸,预测蛋白的等电点和分子量大小分别为5.62kD和69.5kD。具有HSP70的保守性结构特征,与天蚕(Antheraea yamamai)、家蚕(Bombyx mor)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、棉铃虫(Heliothis viriplaca)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、烟草夜蛾(Manduca sexta1)、膜翅目寄生蜂(Cotesia rubecula)的同源性分别为95.7%、78.5%、76.1%、77.3%、76.6%、74.7%、65.9%。根据它们的一级结构构建了系统进化树,进一步确立了它们之间的亲缘关系。     

猪UCP3基因部分编码区序列分析及其单核苷酸多态与胴体、肉质性状的遗传效应

以猪解耦联蛋白基因 3(UCP3)作为控制猪胴体与肉质性状主基因的候选基因。利用直接测序法对 4个品种猪骨骼肌中UCP3基因的部分编码区序列 (第 4外显子部分及第 5、6、7外显子全部片段 )进行比较分析 ,发现3个cSNP位点 ,其中ORF中第 84 2碱基的突变可导致相应编码氨基酸序列的改变 :甲硫氨酸→苏氨酸 ,选取此位点作为猪UCP3基因的多态位点。用PCR SSCP检测方法在 3个品种猪中进行该cSNP位点多态性片段的基因型分型 ,结果显示在 3个猪群中表现出 3种基因型 (AA、AB、BB) ,χ2 独立性检验结果表明 3种基因型在各品种间分布不一致 ,梅山猪同大白、长白猪分别比较差异极显著 (P <0 0 1) ;对大白×梅山资源家系F2 代 139头个体进行了该多态片段的基因型鉴定 ,并对其基因型与所检测个体相应的胴体、肉质性状采用GLM分析进行遗传效应研究 ,结果表明 :该基因对一些胴体、肉质性状有显著性影响 ,并且该基因以加性效应为主 (如 ,眼肌高度、背最长肌色值、系水力的加性效应都达显著水平 )。因此 ,推测UCP3基因可能是影响猪胴体及肉质性状的主效基因或与主效基因紧密连锁的标记基因 ,并且能够在分子标记辅助选择中用于对猪胴体、肉质性状的遗传改良及固定     

Three Novel SNPs in the Coding Region of the Bovine MC3R Gene and Their Associations with Growth Traits

The involvement of melanocortin-3 receptor (MC3R) is well recognized in the regulation of feeding efficiency, body weight, and energy homeostasis. The objective of this study was to investigate the associations between MC3R gene polymorphisms and growth traits. Three novel SNPs (c.24C→T, c.220T→A, c.734G→C) and five haplotypes were identified in 234 Xiangxi cattle. The associations between MC3R gene polymorphisms and growth traits indicated that the individuals with TT and AT genotypes maintained higher body weight than those with the AA genotype at the c.220T→A locus (P < 0.05). The animals with GG and CG genotypes had higher heart girth and body weight than those with the CC genotype at c.734G→C (P < 0.05). The animals with H3H3 and H2H3 haplotype combinations had higher body weight than those with other haplotype combinations (P < 0.05). The results suggest that these SNPs in the MC3R gene might be useful genetic markers for marker-assisted selection and cattle breeding.     

Expression of Heat Shock Protein 70 Gene and Its Correlation with Inflammatory Markers in Essential Hypertension

Objectives

Hypertension is characterized by systemic high blood pressure and is the most common and important risk factor for the development of cardiovascular diseases. Studies have shown that the circulating levels of certain inflammatory markers such as tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), interlukin-6 (IL-6), c-reactive protein (CRP), and tumor suppressor protein-53 (p53) are upregulated and are independently associated with essential hypertension. However, mechanism of increase in the levels of HSP70 protein is not clear. No such studies are reported in the blood circulation of patients with essential hypertension. In the present study, we investigated the expression of circulating HSP70 at mRNA and protein levels and its relationship with other inflammatory markers in patients with essential hypertension.

Materials and Methods

We recruited 132 patients with essential hypertension and 132 normal controls from similar socio-economic-geographical background. The expression of HSP70 at mRNA levels was determined by Real Time PCR and at protein levels by indirect Elisa and Western Blot techniques.

Results

We found a significantly higher expression of HSP70 gene expression (approximately 6.45 fold, P < 0.0001) in hypertensive patients as compared to healthy controls. A significant difference (P < 0.0001) in the protein expression of HSP70 was also observed in plasma of patients as compared to that of controls.

Conclusion

Higher expression of HSP70 is positively correlated with inflammatory markers in patients with essential hypertension and this correlation could play an important role in essential hypertension.     

Polymorphisms of Flanking Region of the ASB15 Gene and Their Associations with Performance Traits in Chicken

Research on the identity of genes and their relationship with traits of economic importance in chickens could assist in the selection of poultry. In this study, an F₂ resource population of Gushi chickens crossed with Anka broilers was used to detect single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the flanking region of the ASB15 gene by DNA sequencing and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). One SNP of ?1271 C>T in 5′ flanking region of the chicken ASB15 gene and two SNPs of the 10618 A>G and 10716 G>A in 3′ flanking region were identified. Furthermore, the 10618 A>G and 10716 G>A in 3′ flanking region were in complete linkage. Association analysis results showed that ?1271 C>T was not associated with performance traits, while the 10618 A>G and 10716 G>A were significantly associated with BW2, 4, 6, 8, 10, 12, SL12, CD8, CW4, 8, 12, BSL4, 8, 12, and SEW, EW, WW, BMW, LW, CW, SFT. Our results suggest that the ASB15 gene profoundly affects chicken performance traits.     

加热调控的溶瘤腺病毒载体构建及其特征研究

溶瘤腺病毒作为近年来新兴的肿瘤基因治疗策略,因具有“细胞溶解”和“旁观者效应”而备受关注．构建了受热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体Ad-HSP70p-E1A,观察该病毒与热疗联合应用对肺癌细胞生长的抑制作用和带动治疗基因在肺癌细胞中表达的效果．体外实验结果表明,Ad-HSP70p-E1A在肺癌细胞株A549内能较好地实现自身复制,并产生一定的溶瘤作用,在联合热疗后,Ad-HSP70p-E1A的自身复制能力和溶瘤效果分别增强了2～10倍和5倍以上．此外,Ad-HSP70p-E1A还可通过反式提供E1A蛋白而使10 moi用量的复制缺陷型腺病毒AdGFP、Ad-CMV-hGMCSF和Ad-CMV-mIL12的表达提升76.64倍、5倍和7倍．     

Gene-Based Mapping and Pathway Analysis of Metabolic Traits in Dairy Cows

The metabolic adaptation of dairy cows during the transition period has been studied intensively in the last decades. However, until now, only few studies have paid attention to the genetic aspects of this process. Here, we present the results of a gene-based mapping and pathway analysis with the measurements of three key metabolites, (1) non-esterified fatty acids (NEFA), (2) beta-hydroxybutyrate (BHBA) and (3) glucose, characterizing the metabolic adaptability of dairy cows before and after calving. In contrast to the conventional single-marker approach, we identify 99 significant and biologically sensible genes associated with at least one of the considered phenotypes and thus giving evidence for a genetic basis of the metabolic adaptability. Moreover, our results strongly suggest three pathways involved in the metabolism of steroids and lipids are potential candidates for the adaptive regulation of dairy cows in their early lactation. From our perspective, a closer investigation of our findings will lead to a step forward in understanding the variability in the metabolic adaptability of dairy cows in their early lactation.     

Multifaceted Role of Heat Shock Protein 70 in Neurons

Heat shock protein 70 (Hsp70) plays important roles in neural protection from stress by assisting cellular protein folding. In this review we discuss the current understanding of inducible and constitutive Hsp70 in maintaining and protecting neuronal synaptic function under normal and stressed conditions.