芸蔓属查尔酮异构酶基因家族RNA干扰载体的构建

作为类黄酮途径的第二步关键酶,查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)催化四轻基查尔酮成为抽皮素,用于合成各种类黄酮物质,影响多种性状.芸蔓属含有多种重要的油料、蔬菜和观赏植物.本研究从甘蓝型油菜克隆了芸蔓属CHI基因家族的干扰片段BCHII(761 bp),采用NcoI+AatII和BarnHI+XbaI双酶切方案分别将其反义片段和正义片段亚克隆到植物RNA干扰(RNAi)平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成了11674by的RNAi载体pFGC5941M-BCHII(简称pBCHID,多种PCR检测表明2个片段的插入方向正确,重组载体完整,将其转化根癌农杆菌菌株LBA4404以后获得了工程菌株LBA4404-pBCHII-.本研究结果将促进研究CHI与芸蔓属异花授粉、植株色彩、黄籽和抗逆性等性状的关系和开展相关分子育种.     

芸薹属类黄酮3'-羟化酶基因家族RNA干扰载体的构建

目的：构建芸薹属类黄酮3′羟化酶（F3′H）基因家族的RNAi载体。方法：采用PCR克隆了607bp的芸薹属F3’H基因家族的RNAi片段,将其反义片段、正义片段分别采用NcoⅠ＋AatⅡ、BamHⅠ＋XbaⅠ插入到改进型植物RNAi基础载体pF-GC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成11366bp的重组载体pFGC5941M-BF3′HI（简称为pBF3′HI）,复合PCR鉴定后转化根癌农杆菌,获得工程菌株。结果：载体构建成功。结论：构建了RNAi载体pBF3′HI,可用于芸薹属植物花色、种皮色泽、茎叶色彩等性状的机理研究和遗传修饰。     

芸薹属原花青素跨膜转运蛋白TT12、AHA10基因家族RNA干扰载体的构建

拟南芥TT12和AHA10基因分别编码MATE类型和H+泵类型的跨膜转运蛋白,介导原花青素单体向液泡的转运,对种皮色素的积累起重要作用。甘蓝型油菜是重要的油料作物,但缺乏黄籽基因型,现有黄籽材料表型不稳定,黄籽性状的分子机理不清,缺乏相关的分子育种。克隆了芸薹属TT12和AHA10基因家族的RNA干扰载体片段BTT12I和BA-HA10I,以基于pFGC5941而改造的植物RNA干扰基础载体pFGC5941M为骨架,构建了相应的RNAi载体pFGC5941M-BTT12I(简称pBTT12I)和pFGC5941M-BAHA10I(简称pBAHA10I),通过分子鉴定后转化农杆菌,获得工程菌株,有利于通过基因沉默技术研究TT12和AHA10基因在芸薹属种皮色素跨膜转运中的作用和机理,探索黄籽性状的分子育种。     

小麦淀粉合酶基因III片段的克隆及反义和RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出淀粉合酶III基因（starch synthase III, SSIII）部分cDNA片段(509bp) (GenBank No. EF466009),同源性比较结果显示,它与GenBank 上已报道的SSIII基因有高度同源性。以pWM101质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSIII基因的反义表达载体pWM101SSIII;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了SSIII基因的RNAi干扰载体pFGC5941SSIII,这些载体的构建为研究此基因的功能打下了很好的基础。     

小麦淀粉合酶基因Ⅲ片段的克隆及反义和RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出淀粉合酶Ⅲ基因(starch synthase Ⅲ,SSⅢ)部分cDNA片段(509bp) (GenBank No.EF466009),同源性比较结果显示,它与GenBank 上已报道的SSⅢ基因有高度同源性.以pWM101质粒为基础,构建了由35S启动子调控的SSⅢ基因的反义表达载体pWM101SSⅢA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了SSⅢ基因的RNAi干扰载体pFGC5941SSⅢsa,这些载体的构建为研究此基因的功能打下了很好的基础.     

甘蓝型油菜Fad2与Fae1基因双干扰RNAi载体的构建

将来源于甘蓝型油菜XY15的Fad2与Fae1基因编码区,长度分别为349bp和426bp的两个保守序列片段连接成807bp的大片段。然后分别以正反向插入到pFGC5941干扰载体查耳酮合成酶内含子的两端,构建成RNAi载体。以期在菜籽中转录后能有效抑制Fad2与Fae1两个基因的表达。所构建的RNAi载体最终序列全长3kb,经限制性内切酶消化、PCR扩增验证和序列测定,证明目标序列与GenBank数据库中的碱基序列一致,并且为正反向插入到pFGC5941载体上。通过农杆菌介导的油菜转化,已获得油菜抗性再生植株144个。     

分蘖洋葱查尔酮异构酶基因的克隆及表达载体的构建

旨在得到分蘖洋葱查尔酮异构酶基因,探明该基因的功能。克隆查尔酮异构酶基因并构建了其超表达和干扰载体,以期得到用于研究查尔酮异构酶基因功能的表达载体。从分蘖洋葱叶片中克隆得到查尔酮异构酶基因cDNA全长743 bp,GenBank登录号为KJ489062。结果显示,该基因633 bp的开放读码框编码210个氨基酸的多肽序列。将PCR扩增克隆得到的分蘖洋葱查尔酮异构酶基因片段连接到干扰载体pCAMBIA1 301和超表达载体SOL2095中,成功构建了35S启动子控制的植物表达双元载体pCAMBIA1301-CHI和SOL2095-CHI。     

携带大片段BIBAC克隆在不同农杆菌中的遗传稳定性研究

大片段克隆在农杆菌中的稳定性是利用可转化大片段载体进行农杆菌介导遗传转化的关键问题.选用插入片段分子质量分别为150kb和50kb的BIBAC克隆,测定了在3种农杆菌AGL-1,EHA105和LBA4404中的遗传稳定性.从第1、3、5次继代培养的农杆菌中抽提的质粒及酶切结果显示,由于农杆菌背景质粒的干扰,难以判断质粒的降解与否.将农杆菌质粒再转化到大肠杆菌宿主中,发现来自农杆菌AGL-1和EHA105的质粒出现了明显的降解,片段变小,而来自农杆菌LBA4404的质粒没有变化.结果表明,大片段BIBAC质粒在不同农杆菌菌株中的稳定性不同,在农杆菌LBA4404中比较稳定,适合用于遗传转化.     

红花查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析

实验通过下载已报道查尔酮异构酶基因序列,设计简并引物,利用RACE克隆红花查尔酮异构酶基因全长,克隆了两个红花查尔酮异构酶基因,分别命名为CtCHI1和CtCHI2,NCBI登录号分别为MF996507和MF996508。用在线软件对序列进行分析,并用MEGA进行进化树分析,CtCHI1全长967 bp,CtCHI2全长997bp,属查尔酮异构酶家族基因。定量PCR分析红花查尔酮异构酶基因表达得出,CtCHI1在花中且在时期2表达量较高,而在叶、茎及根中不表达,CtCHI2仅在茎中有少量表达。实验还发现,MeJA显著促进CtCHI1基因的表达,而对CtCHI2无调控作用,推测CtCHI1参与红花花中类黄酮的生物合成。实验成功克隆了两个查尔酮异构酶基因并对其进行表达分析,为红花类黄酮的生物合成及调控机理研究奠定基础。     

喜盐鸢尾花色形成关键基因的克隆及表达分析

喜盐鸢尾(Iris halophila Pall.)及其变种蓝花喜盐鸢尾(I.halophila Pall.var.sogdiana(Bung)Grubov)因耐盐碱及其多种花色而具有盐碱地园艺开发价值。本文根据喜盐鸢尾内轮花被转录组测序结果,利用基因特异性引物从这2种植物中分别克隆了编码查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、类黄酮-3',5'-羟基化酶类(F3'5'H-like)等基因的部分片段,并对它们在内轮花被中的表达水平进行实时定量PCR分析。序列分析结果确认在喜盐鸢尾中所克隆的CHS(311 bp)、CHI(457 bp)、F3'5'H-like(496 bp)3个基因(部分)未见文献报道与NCBI等数据库记录。其中F3'5'H-like基因与经典的属于细胞色素P450CYP75A亚家族的F3'5'H不同,而与万带兰的F3'5'H-like同属于CYP76AB亚家族,为一类新的蓝花相关基因。实时定量PCR表达分析结果表明,与黄花的喜盐鸢尾相比,蓝花喜盐鸢尾中CHS与F3'5'H-like显著上调表达,可能是其花色不同于喜盐鸢尾的主要原因。     

决明查尔酮合成酶全长cDNA的克隆及其原核表达载体的构建

从决明子叶中提取查尔酮合成酶(Chalcone synthase)总RNA,经过RT-PCR获得查尔酮合成酶cDNA,纯化后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌Top10,获得了查尔酮合成酶全长基因序列.序列测定表明,查尔酮合成酶全长核苷酸长度为1 173 bp,编码390个氨基酸.与GenBank中已发表序列EU430077进行比较,核苷酸同源性为100%.将该基因片段克隆到原核表达栽体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)/Chalcone synthase,所获重组质粒经过双酶切、PCR和序列测定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为查尔酮合成酶的进一步表达奠定了基础.     

NtSKP1基因的反义载体构建及转基因烟草的产生

根据枯斑三生烟SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计一对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,扩增目的基因(约473bp)片段。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL的内含子右侧,再经NotⅠ酶切回收约3443bp的目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段反向序列的植物表达载体pART27-skp1a,其转录产物能减弱目的基因的表达。将pART27-skp1a质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

四价抗马铃薯病毒植物表达载体构建及其对烟草的转化

该研究为了培育兼抗4种病毒的马铃薯品种,采用RT-PCR技术对PVX、PVS、PVY和PLRV的外壳蛋白(CP)基因进行克隆与分析,获得了大小分别为670、800、700、600 bp的CP基因序列,将获得的CP基因序列与NCBI中已报道的序列进行比对分析,其同源性都在96%以上。根据所克隆的CP基因对靶标片段进行筛选,获得了大小约300 bp的靶标片段PVX-rh、PVS-rh、PVY-rh和PLRV-rh,同时利用Overlap-PCR技术将4种病毒的靶标片段进行拼接,得到了长度约为1 200 bp的融合片段XSYV-rh,与预期目标片段XSYV-yxz的相似性达100%。利用DNA重组技术将融合片段XSYV-rh克隆到p GM-T载体上构建成克隆载体p GM-T-XSYVrh,用SpeⅠ和SacⅠ对克隆载体p GM-T-XSYV-rh和植物表达载体p ART27进行同步双酶切,用T4 DNA连接酶将XSYV-rh片段连接到载体p ART27上,成功构建了同时含4种病毒CP基因片段的植物表达载体p ART27-XSYV-rh。采用直接转化法将植物表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,并利用农杆菌介导法对烟草品种T12试管苗进行遗传转化,转化后的烟草植株经PCR检测,有40株转化植株可扩增出目的条带,表明XSYVrh融合基因已成功转入烟草基因组中。     

油菜BnCr4基因RNAi载体构建及植株转化

该实验构建了含甘蓝型油菜黄化相关基因BnCr4特异片段反向重复结构的RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Cr4,通过根癌农杆菌介导转化油菜,获得47株抗Basta的抗性再生油菜植株,其中10株经PCR鉴定为阳性转基因植株.随机选取3株经鉴定的转基因阳性油菜植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示,相对于非转基因的野生型油菜,3株转基因植株中BnCr4基因的表达量分别降低了78.5%、8.5%、11.8%,表明该干扰载体转入油菜能特异引起植株BnCr4基因表达量下降.     

鸳鸯茉莉查尔酮异构酶基因(CHI)cDNA的克隆与生物信息学分析

采用RT-PCR与RACE技术克隆了鸳鸯茉莉(Brunfelsia acuminata)花瓣中查尔酮异构酶基因(CHI)的全长cDNA,GenBank登录号为JN887637。该基因全长1051 bp,含有1个792 bp的开放阅读框,编码263个氨基酸,为不稳定蛋白。对保守区功能区的分析,推导CHI蛋白具有查尔酮超级家族的保守结构域,二级结构预测显示其主要以α螺旋和β折叠为主。氨基酸同源性分析表明,鸳鸯茉莉CHI蛋白与矮牵牛(Petunia hybrida)、金花茶(Camellia nitidissima)、甜樱桃(Prunus avium)、芍药(Paeonia lactiflora)、牡丹(P.suffruticosa)、菊花(Chrysanthemum morifolium)等植物的同源性分别达到90%、89%、84%、85%、84%、80%。因此,CHI基因可能与鸳鸯茉莉的花色形成有关。     

查尔酮异构酶基因的克隆序列分析及在大肠杆菌中的表达

从矮牵牛(Petunia hybrida Vilm.)花瓣的cDNA中克隆了查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)的基因chi-a,进行了序列分析。结果表明,chi-a基因全长726 bp,编码241个氨基酸。并在大肠杆菌中表达了chi-a基因,对来源于不同植物种的CHI进行了同源性比较分析。     

昆虫病原菌(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI克隆及生物信息学分析

本研究旨在对昆虫病原菌玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI进行克隆、测序及相关生物信息学分析.序列分析结果显示:IfCHI基因编码区全长为1152bp,编码383个氨基酸,理论等电点(pI)D为9.72,属不稳定水溶性蛋白,其二级结构为混合型,蛋白质溶剂可及性主要分为三类,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,同源序列分析及多重序列比对分析存在明显的差异.该昆虫病原菌玫烟色棒束孢IfCHI编码基因的成功克隆及生物信息学分析,为进一步研究病原菌CHI基因的遗传特性和表达机制以及为寻找更多的查尔酮类化合物提供了理论基础.     

融合酶表达载体的构建及出现问题的初探

目的:将限制性内切酶FokⅠ催化区域基因(631bp)和PI-SceⅠ识别区域的基因(546bp)连接到一起,克隆入载体质粒pET28a+中,为表达新的限制性内切酶融合酶做准备。方法:分别以啤酒酵母和海床黄杆菌作模板,PCR扩增PI-SceⅠ和FokⅠ基因片段,再将它们克隆入载体质粒pET28a+,然后对整合质粒进行双酶切检测。结果:整合过程中,无论是PI-SceⅠ还是FokⅠ基因片段,都能单独成功插入载体,但当插入第二段基因片段时,酶切结果显示大约600bp的基因片段缺失了。结论:缺失可能因为两段连在一起的新基因在转化过程中对宿主细胞有毒性,宿主细胞对其进行了剪切;也可能这两段基因会形成某种高级结构而导致其不能很好的连接,产生缺失现象。     

银杏CONSTANS基因植物表达载体构建

目的:构建银杏CONSTANS基因的表达载体.方法:PCR扩增CO基因得到1.2kb左右的片段,用BamH Ⅰ+HindⅢ酶切纯化,通过T4 DNA连接酶连接到植物表达载体pCAMBIA 1304上,并转化到农杆菌LBA4404,然后进行菌落PCR及酶切鉴定.结果:载体构建成功.结论:构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa,可用于GbCO基因的转基因功能研究.     

水蕨(Ceratopteris thalictroides)查尔酮合成酶基因的克隆和表达

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是植物类黄酮化合物合成的关键酶,有关蕨类植物CHS基因的序列及功能信息尚不完善。本研究采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆获得了模式蕨类植物——水蕨(Ceratopteris thalictroides)CtCHS基因(GenBank登录号:JX027616.1),其cDNA序列全长为1616 bp,具有3个外显子和2个内含子,开放阅读框(ORF)为1215 bp,编码404个氨基酸。进化树分析表明,CtCHS与问荆(Equisetum arvense)、松叶蕨(Psilotum nudum)和3种薄囊蕨的查尔酮合成酶基因聚为一枝,说明这些蕨类植物亲缘关系较近且为单系起源。通过构建原核表达体系成功获得CtCHS蛋白的多克隆抗体并用于免疫印迹分析,结果表明CtCHS基因的表达明显受紫外光(UV)诱导。CtCHS基因的克隆与表达分析为进一步研究水蕨类黄酮化合物的合成及其调控机制提供了依据。