金黄色葡萄球菌肠毒素C的原核表达、纯化及活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达金黄色葡萄球菌肠毒素C（SEC）,并对其活性进行检测。方法：以金黄色葡萄球菌基因组为模板扩增SEC基因,经测序正确后插入原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α后温度热诱导重组SEC表达;表达产物经阳离子柱纯化后,用ELISA鉴定其抗原性;通过观测表达产物对鼠脾淋巴细胞的刺激增殖情况,检测其超抗原活性。结果：构建了SEC-pBV220原核表达载体,在大肠杆菌中可快速、高效表达SEC蛋白,表达产物具有超抗原活性。结论：实现了SEC的原核表达。     

金黄色葡萄球菌CHIPS基因克隆及原核表达

趋化抑制蛋白(Chemotaxis Inhibitory Protein ofStaphylococcus aureus,CHIPS)是由金黄色葡萄球菌分泌到菌体外的一种蛋白。在感染早期,它能特异性地与中性粒细胞和单核细胞上的C5a受体(C5aR)和fMLP受体(FPR)结合,从而阻止中性粒细胞和单核细胞对C5a和fMLP的结合作用,导致对病原吞噬作用的延迟。人们可以利用CHIPS对C5a-C5aR的阻止作用来研制治疗由C5a诱发的炎症性疾病的药物。将CHIPS作为免疫原防治疾病也将成为新的研究课题。实验成功构建了CHIPS蛋白的原核表达系统,为CHIPS免疫原性研究及蛋白的其他功能研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌isdb基因的克隆表达及其小鼠免疫试验

为了研究金黄色葡萄球菌表面Isdb蛋白的免疫原性,应用PCR方法扩增出金黄色葡萄球菌Wood46株的isdb 基因并进行序列分析,再将isdb 基因插入到pET32-a(+) 载体上,构建了pET32-a(+)-isdb重组质粒,将重组质粒转化到宿主菌大肠埃希菌BL21中并诱导表达和纯化Isdb蛋白。用纯化的Isdb蛋白免疫小鼠,检测小鼠血清中抗体水平;在二次免疫之后的第2周,用金黄色葡萄球菌Wood46、HLJ23-1株对小鼠攻毒,每组8只小鼠。研究结果发现：isdb基因在不同菌株中高度保守;Isdb蛋     

金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femB的克隆和原核表达

金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

牛乳源金黄色葡萄球菌EsxA蛋白的表达及免疫原性分析

为分析牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EsxA蛋白的免疫原性,构建EsxA-p ET-28a重组表达质粒,重组质粒经诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后重组EsxA蛋白免疫小鼠,用间接ELISA检测免疫小鼠血清中的IgG、IgG1和IgG2a水平;免疫小鼠经S.aureus菌株攻击后,检测小鼠肝、脾、肾组织荷菌数和免疫保护率,观察S.aureus菌株攻击后小鼠肝、脾、肾病理组织学变化。结果表明,成功诱导表达了EsxA重组蛋白,该重组蛋白免疫小鼠后血清抗体效价可达1∶900,与对照相比,重组蛋白免疫后可减少小鼠肝、脾、肾组织的荷菌数,减轻这些脏器的病理损伤,对免疫小鼠保护率达75%。上述结果表明,该重组Esx A蛋白具有良好的免疫原性。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因克隆、表达及活性试验

利用PCR从金黄色葡萄球菌标准株（Staphylococcus aureus, ATCC13565）中克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的基因,序列测定结果与报道完全一致。构建了表达载体pETSEA并获得高效表达,重组蛋白（rSEA）在37℃诱导时以包涵体形式存在,降低温度则出现可溶表达,可溶性rSEA占总rSEA的55%。可溶性rSEA经Ni²⁺亲和层析纯化,达电泳纯。通过同源模建对rSEA对SEA进行结构比较,结果表明尽管rSEA比野生型SEA多了9个氨基酸但其结构并没有明显的变化。单核细胞增殖试验进一步证明了该结论：将rSEA与SEA同外周血单个核细胞共同培养,两者均能有效地促进其增殖。将rSEA与体内激活的脾细胞共培养,则能增强脾细胞的体外抑瘤活性。     

草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌肠毒素A Asp227Ala基因的克隆及表达

目的：金黄色葡萄球菌肠毒素A Asp227ala基因的克隆及表达。方法：利用错配PCR方法,从含有金黄色葡萄球菌肠毒素A（Staphylococcal enterotoxn A,SEA)基因的质粒中扩增出约720bp的DNA片段,将其克隆到表达载体7ZTS中,并转化于JM109（DE3）。结果：重组质粒的测序结果表明,它含有702bp（不包括N端72bp的信号肽编码区）,其核苷酸序列与文献报道完全一致,推导的氨基酸序列显示227位的天冬氨酸已突变为丙氨酸。结论：该基因所表达的蛋白为可溶性蛋白,表达量占总蛋白51.5%。表达的蛋白与天然肠毒素A产生的抗体能发生凝集作用,具有与天然SEA类同的抗原活性。     

金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在大肠杆菌中的高效表达

这篇文章报道了金黄色葡萄球菌核酸酶A的克隆和在温控启动子P_RP_L调控下在E．Coli中的高效表达。SDS—PAGE分析表明,核酸酶A的含量可占E．Coli细胞总蛋白含量的60%。经有效的增溶和复性处理后,重组酶具有与天然酶相同的活力;N-末端氨基酸分析的结果指出,fMet在转译后被加工去除;对重组SNaseA在构象上的同一性也通过Phenyl—Su—perose疏水柱层析进行了分析。     

人FBXO31蛋白的原核表达及抗体制备

FBXO31位于人染色人体16q24.3,是一个乳腺癌候选抑癌基因。为了获得抗FBXO31的多克隆抗体,构建了FBXO31基因的原核表达质粒pET-28a-FBXO31。将原核表达质粒pET-28a-FBXO31转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,IPTG诱导表达融合蛋白。融合蛋白主要以包涵体形式存在,常规方法纯化包涵体。将纯化的pET-28a-FBXO31融合蛋白用于免疫新西兰大白兔获得抗血清,用pET-28a-FBXO31对抗血清进行分离纯化,得到抗FBXO31多克隆抗体。用Western印迹和免疫沉淀对其进行初步鉴定。获得了兔抗人FBXO31的多克隆抗体,为进一步研究FBXO31的生物功能提供了有用的工具。     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖（obesity,OB）基因的生理和病理意义,利用逆转录-聚合酶链式．反应（RT-PCR）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总RNA中扩增出肥胖基因编码区序列（cDNA）．定向亚克隆pUC19质粒,克隆的OBcDNA不含信号肽序列并加入了新的起始密码子ATG,序列分析表明,与日本报道的人OBcDNA相比,多出一个谷氨酸密码子CAG．将OBcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建了重组OB基因表达质粒pBV220-OB．SDS-PAGE证实pBV220-OB在大肠杆菌中可表达分子量为16.7KD的特异蛋白带．     

细粒棘球蚴AgB8/2基因的原核表达及免疫学鉴定

旨在克隆细粒棘球蚴 AgB8/2基因,优化原核表达体系,鉴定纯化蛋白并初步确定其诊断价值.采用 RT-PCR扩增 AgB8/2基因 cDNA,构建原核表达载体pET-AgB8/2并在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达,优化表达条件.纯化的AgB8/2融合蛋白经 Western blot鉴定正确后,采用斑点免疫金渗滤法初步验证其血清学诊断价值.结果显示,克隆的 AgB8/2基因包含了 273 bp的完整ORF,序列分析表明与其它已报道的AgB8/2 cDNA序列的同源性在 99%～100%之间.优化的表达条件为,当菌液 OD600值为0.6时,加入终浓度为0.05 mmol/L的 IPTG,37℃,振荡培养5 h.纯化的蛋白经 Western blot鉴定为目的蛋白.克隆的 AgB8/2基因高度保守,原核表达载体pET-AgB8/2构建正确并高效表达可溶性融合蛋白,可作为特异性抗原应用于斑点免疫金渗滤法检测血清抗体.     

猪瘟病毒NS3基因克隆、原核表达及间接ELISA方法初步建立

采用PCR方法从携带猪瘟病毒兔化弱毒(Hog cholera lapinized virus,HCLV)全长基因组cDNA的质粒pPOHCLV中扩增到长度为2000bp左右NS3基因序列,并将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建成重组原核表达载体pETNS3。将pETNS3在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行优化表达,SDS-PAGE分析重组蛋白NS3主要以包涵体形式表达,分子大小约95kD。Western Blotting分析表明重组蛋白NS3具有免疫原性。采用Ni+亲和层析方法纯化得到重组蛋白NS3(90%)。以纯化的重组蛋白NS3为抗原初步建立了检测CSFVNS3抗体的间接ELISA方法,检测221份不同猪群和年龄猪的血清样品。检测结果与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果进行对比,阳性符合率为83.33%,阴性符合率为89.38%,总符合率为86.43%。30份存在差异的血清样品用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)进行检测,结果显示IFA检测结果与NS3间接ELISA和IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒符合率分别为56.67%和43.33%。     

洋葱黄矮病毒检测试剂盒的研制

根据已报道的洋葱黄矮病毒(OYDV)序列设计引物,扩增洋葱黄矮病毒(OYDV)六安分离物外壳蛋白(CP)基因.序列同源性分析结果表明,与目前已报道的OYDV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为84.0%～95.8%,相应推测的氨基酸序列同源性为86.8%～97.6%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清,Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀初步IgG,然后用Protein A-Red Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,IgG与甘油1: 1混合获得效价1: 4 800的一抗.将一抗、羊抗兔二抗和4-硝基苯基磷酸二钠组成OYDV检测试剂盒,可用于田间OYDV病样检测.     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

牦牛OB基因的克隆及原核表达

肥胖基因(obese gene,OB gene)表达产物瘦蛋白(leption)具有调节体重、影响动物生长和繁殖率等一系列生物学功能。通过牦牛脂肪组织总RNA的提取,利用RT-PCR克隆出牦牛OB基因的成熟肽cDNA,构建OB基因的原核表达载体OB-pET32a(+),在大肠杆菌表达系统使融合蛋白表达,通过SDS-PAGE检测所表达的融合蛋白。结果表明,克隆的OB基因成熟肽片段为456 bp包含EcoR I和BamH I两个酶切位点,与普通牛、瘤牛该基因的相似性达98.6%。原核表达产物为包涵体形态,大小为31 kD,符合预期结果,为OB基因的高效表达系统的构建奠定基础。     

人源CT55蛋白原核表达及单克隆抗体的制备

为制备Cancer testis 55(CT55)单克隆抗体,需构建带有人源CT55片段的原核表达质粒,把该质粒转化Rosetta感受态进行原核表达并得到目的蛋白,蛋白质被纯化后免疫6周雌性BALB/c小鼠。按传统的单克隆抗体的制备方法,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(sp2/0)进行融合,经ELISA方法筛选及两次连续亚克隆,共获得多株能稳定分泌抗CT55蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,如3D8B7B12、4C8E1C9、3D8C10G9等。ELISA及Western blot(WB)分析结果表明,筛选的细胞株均能产生单克隆抗体,且该抗体均分别能与原核表达及真核表达的CT55蛋白发生特异性结合。单克隆抗体可用于免疫荧光试验,且与P53发生互作的荧光主要位于细胞核边缘。结果表明,成功制备了针对人源CT55蛋白的单克隆抗体。CT55蛋白单克隆抗体的制备为今后肝癌、胃癌、结肠癌等癌症的快速的病原学诊断以及CT55蛋白的结构和功能研究奠定了物质基础。     

文昌鱼BRA蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

Brachyury编码的转录调控因子BRA参与脊索动物脊索的分化形成,文昌鱼是最早具有真正脊索的后生动物类群,因此开展文昌鱼Brachyury基因功能研究,将有助于揭示脊索的起源与进化。文昌鱼具有2个Brachyury基因:Bra1和Bra2,二者编码的蛋白序列相似度高达93%,缺少有效区分二者的特异抗原表位,转录组数据分析表明Bra2表达量显著高于Bra1,进一步对BRA2蛋白序列特征分析发现其N端拥有丰富的潜在抗原决定簇,因此本研究选择了Bra2 N端696 bp基因序列所编码的蛋白片段作为制备抗体的抗原蛋白。将该段基因序列克隆重组入p ET28a原核表达质粒,经诱导表达获分子量约31 ku的可溶性重组蛋白。通过Ni2+亲和层析柱纯化,得到1.3 g/L高纯度抗原蛋白,用3只ICR小鼠(Mus musculus)经4轮重组蛋白免疫[剂量50μg/(只·次)]后获得最高效价(1︰256 000)的多克隆抗体。Western印迹结果显示,本研究制备的鼠抗文昌鱼BRA多克隆抗体不仅可特异识别重组抗原蛋白,也可高效识别文昌鱼胚胎总蛋白中的BRA1和BRA2,为后续深入研究文昌鱼BRA在脊索发育调控中的作用提供了有力的分子工具。     

人类多效生长因子(Pleiotrophin)的全基因合成、原核表达与纯化

PTN作为重要的细胞因子,存在于多种生物体内,参与多种生物学过程,具有刺激细胞增殖、分化、粘附、迁移等多种功能。根据PTN的基因序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,人工合成ptn基因,构建pMAL-his-sumo-ptn重组表达载体,将重组表达载体转化到E.coli(Rosetta)中并进行优化表达。融合蛋白在0.4 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导3 h表达量最高。收集菌体、纯化、酶切、SDS-PAGE可检测到分子量为18 kD左右的重组蛋白。     

人CD24分子成熟多肽的原核表达及抗体制备

目的: 为获得抗人CD24分子成熟多肽核心蛋白(hCD24N)的多克隆抗体。方法: 制备CD24表达阳性的人肿瘤细胞cDNA,采用PCR法扩增hCD24N的编码基因,构建pGEX-KGV-hCD24N原核表达质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达;经GST亲和柱层析、SDS-PAGE和Western blotting制备并鉴定纯化的GST-StraptagII-hCD24N融合蛋白;免疫新西兰大白兔制备抗血清并用rProtein A亲和柱层析纯化多克隆IgG抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性,同时采用细胞免疫荧光检测技术对抗体的特异性和应用可行性作进一步评价。结果: 实现了hCD24N基因的克隆以及在原核细胞中的可溶性重组融合表达,得到了纯化后的目的融合蛋白,并以其为免疫原获得了效价高于1:100 000的抗hCD24N多克隆抗体,Western blotting及细胞免疫荧光检测证明该抗体与当前市售的抗人CD24抗体具有相似的免疫反应特异性,并且能够与CD24阳性人肿瘤细胞表达并加工的高度糖基化CD24天然分子发生特异性抗原-抗体反应。结论: 抗hCD24N多克隆抗体的成功制备为进一步以CD24分子为靶点的肿瘤生物学基础研究以及相关癌症的诊断试剂开发奠定基础。