牦牛BLG基因5'调控成分的克隆及序列分析

目的:克隆牦牛β-乳球蛋白(BLG)基因5'调控成分(3.5kb).方法:利用PCR方法克隆了牦牛BLG基因5'侧翼区,并进行生物信息学分析表明.结论:获得了3.5kb的BLG基因5'调控成分,其中包括5'侧翼区(2 472bp),第一外显子及第一内含子(1 066bp).该序列与牛、绵羊和山羊的同源性分别为98.42%、89.61%和84.41%;平均GC含量为49.3%;存在一个CpG岛;可能存在一个启动子位点,位于起始密码子前-83bp处;AliBaba2.1分析发现该区域有47种潜在的转录因子结合位点,其中包括乳蛋白结合因子(MPBF)、乳腺活化因子(MAF)、糖皮质激素受体(GR)、雌激素受体(ER)、核因子1(NF-1)等结合位点,提示该调控成分可用于构建乳腺特异性表达载体.结果:成功克隆出BLG基因5'侧翼区,为构建转基因牦牛乳腺生物反应器的特异性表达载体奠定基础.     

草原红牛IGF-I基因5′调控区序列的生物信息学分析

胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因为多启动子基因,也是影响动物生长发育和肉用性状的重要候选基因.在克隆草原红牛IGF-I基因5′调控区1 954 bP的基因组序列基础上,利用生物信息学软件,分析了IGF-I 5′调控区的启动子结构;预测出评分在95分以上的转录因子结合位点有71个;分析结果没有发现CpG岛和TATA-box.研究结果为进一步研究IGF-I转录效率以及对草原红牛生长和肉用性状的影响奠定基础.     

人Boule基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的：对精子发生RNA结合蛋白Boule基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法：从基因参考序列数据库获取Boule基因启动子区序列,使用TFSEARCH程序对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。结果：成功获得长度为2kb的人Boule基因启动子区序列。该启动子区Thresholdscore〉90的共有60个转录因子结合位点,涉及sox家族、GATA结合蛋白家族、热休克因子家族、锌指蛋白Kruppel家族、POU家族、runt家族、同源异型框基因家族、TALE类同源结构蛋白家族、转录因子螺旋环螺旋家族、IKAROS家族、FOX家族11个家族的转录因子和3个TATAbox。结论：Boule基因表达的调控是在一定时间或空间上、一种或多种调节蛋白作用的复杂过程。调控Boule基因表达的转录因子绝大部分与胚胎发育、性别决定、个体生长密切相关。     

人Toll样受体9基因启动子区的生物信息学分析

目的:探讨人Toll样受体9(TLR9)基因启动子区序列特征。方法:利用生物信息学技术预测人TLR9基因启动子区域、转录因子结合位点和CpG岛分布。结果:人TLR9基因启动子区有1434个转录因子结合位点,人和小鼠保守区域内存在23个共同的转录因子结合位点,人TLR9基因启动子区包含长572 bp的CpG岛。结论:人TLR9基因启动子区相关生物信息学的研究,提高了针对启动子的研究效率,并为预测基因启动子的功能提供了重要信息。     

草原红牛IGF—I基因5’调控区序列的生物信息学分析

胰岛素样生长因子-I（IGF—I）基因为多启动子基因,也是影响动物生长发育和肉用性状的重要候选基因。在克隆草原红牛IGF-I基因5’调控区1954bP的基因组序列基础上,利用生物信息学软件,分析了IGF—I5’调控区的启动子结构;预测出评分在95分以上的转录因子结合位点有71个;分析结果没有发现CpG岛和TATA—box。研究结果为进一步研究IGF-I转录效率以及对草原红牛生长和肉用性状的影响奠定基础。     

人TCF7L2基因启动子生物信息学分析

[目的]探讨人TCF7L2基因启动子特征。[方法]从UCSC数据库获得人TCF7L2基因5’调控区2 000 bp序列,利用多种在线软件对启动子、转录因子结合位点、Cp G岛、SNP等进行分析。[结果]5’调控区2 000 bp序列正义链上至少存在5个潜在的启动子,其中-242～-192 bp、-853～-803 bp之间可能包含核心启动子。查找到1个TATA盒,存在1个长度为499 bp的Cp G岛。Ali Baba2. 1、PROMO和JASPAR软件分别预测到241、944、1 035(正义链)个转录因子结合位点。利用conreal程序在人和小鼠TCF7L2基因启动子保守区域内预测到207个共同的转录因子结合位点,涉及到66种转录因子。启动子区发现2个SNP位点。[结论]对人TCF7L2基因启动子进行了生物信息学分析,获得了启动子特征。     

甲基CpG结合蛋白对基因转录的调控

甲基CpG结合蛋白（MeCPs)有5个成员（MeCP1、MeCP2、ＭBD1、ＭＢＤ３和ＭＢＤ４）,通过特异结合于甲基化ＣpG位点（mCpG)而抑制基因表达,目前研究较清楚的是ＭeCP1、ＭeCP2和ＭＢＤ１。ＭeCP１可与至少１２个对称的mCpG结合,ＭeCP2和ＭＢＤ１均与单一的mCpG位点结合。ＭeCP1和ＭeCP2可干扰非甲基化敏感的转录因子Ｓp1与启动子区的结合,也可与组蛋白脱乙酰酶（ＨＤＡＣ）形成复合物,影响局部组蛋白乙酰化状态,ＨＤＡＣ抑制剂ＴＳＡ可解除ＭＢＤ１对报告基因的抑制,提示ＭＢＤ１对基因的抑制与脱乙酰化有关。     

鹅卵清蛋白基因5'端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鹅输卵管基因组中扩增出1．2kb的鹅清蛋白基因5’端调控区,将其亚克隆入phD18-T载体的多克隆位点(标记为pOV),经酶切和测序鉴定：扩增产物只有3个碱基发生了突变,其TATA框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异,表明鹅清蛋白基因5’端调控区可作为启动外源基因表达的调控序列。为构建其启动外源基因的质粒表达载体奠定了研究基础。     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体(FXR)基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,-1651~ 200、-1496~ 200区域的启动子活性无明显区别,-847~ 200区域的启动子活性最高,-544~ 200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在-847~-544范围内.     

油菜APETALA3基因5′调控序列的克隆及分析

利用单引物PCR方法获得了甘蓝型油菜APETALA3重复基因拷贝BnAP3-3和BnAP3-4的5' 调控序列.分析结果表明,两段调控区序列一致性为80.43%,大多数的保守功能元件如TATA盒和CAAT盒没有明显差异,都含有一些应对环境胁迫及诱导的元件,如MYB1AT、GATABOX和DOFCOREZM等.少数顺式作用元件存在较大差异,其中CGACGOSAMY3、CArG box、CARGCW8GAT及CAREOSREP1为BnAP3-3的5'调控序列所特有,而BnAP3-4的5'调控序列则含有GT1CONSENSUS.半定量RT-PCR显示,BnAP3-3表达量远高于BnAP3-4,可能与二者调控区某些功能元件序列差异有关.     

羊FSHR基因5′端转录启动调控区生物学特性

文章对小尾寒羊、滩羊和澳洲绵羊等繁殖性状不同的3种绵羊与排卵有关的FSHR基因5′端转录启动调控区进行了克隆和分析,通过对FSHR基因的15个转录调控元件序列进行比较,结果表明,羊不同品种FSHR基因的转录调控元件序列之间没有差异。这说明绵羊的品种与FSHR基因5′端转录启动调控区的相关性不强,排除了因转录调控元件突变而影响转录调节能力的可能性。      

小鼠Lrp5基因5′端调控区域的功能

为研究小鼠低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)基因5′端调控序列的功能,PCR扩增小鼠Lrp5基因翻译起始位点上游3041bp(-2909bp~+132bp)DNA序列.PCR产物定向克隆到pGL3-basic载体上,重组质粒命名为pGL3-2909.以pGL3-2909质粒为模板,以不同的引物扩增出不同长短的DNA片段,分别定向克隆到含小鼠Lrp5基因基本启动子并含有荧光素酶报道基因的pGL3-103载体上,构建了12种荧光素酶报告基因表达体系:pGL3-267,pGL3-513,pGL3-535,pGL3-560,pGL3-575,pGL3-623,pGL3-645,pGL3-719,pGL3-770,pGL3-1032,pGL3-1330,pGL3-1619.以pRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7细胞,48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性,pGL3-575(-2909bp~-2334bp)活性是pGL3-513(-2909bp~-2396bp)的20%,pGL3-535(-2909bp~-2374bp)的活性是pGL3-513的44%,pGL3-575的活性是pGL3-560(-2909bp~-2349bp)的48%,均有显著性差异.结果表明,在-2396bp与-2374bp之间的22bp区域内以及-2349bp与-2334bp之间的15bp区域内存在负调控元件.软件分析表明,此区域含有IK2,LYF1及MZF1调控元件.     

牛ASCL2基因生物信息学分析

在人与小鼠中,A SCL2基因是一个母源表达的印记基因,在早期胚胎和胎盘发育中起重要作用。牛A SCL2基因的印记状态和印记的分子机理还没有被研究。本研究采用生物信息学方法对牛A SCL2基因分子进化、启动子和CpG岛区域以及蛋白的高级结构进行分析和预测,为进一步揭示该基因生物学功能和其分子调控机理奠定基础。对21种哺乳动物A SCL2基因的mRNA序列进化分析表明：这21种哺乳动物间的遗传距离小于0.536,且牛与猪遗传距离最小,为0.106,与基因进化树分析结果一致。CpG岛在线软件预测显示,在牛中,该基因上游5 k序列中有三个CpG岛。启动子在线软件预测和转录因子分析相结合显示,启动子最可能位于该基因5'端上游4725~4775 bp处CpG岛区域内,此区域包括大量潜在转录因子结合位点,并在4734 bp处存在一个TATA框。蛋白质在线软件分析表明,A SCL2基因编码一种螺旋-环-螺旋形转录因子,有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲3种二级结构。     

肝细胞癌中FHIT基因启动子甲基化状态分析及其与临床病理特征之间的关系研究

目的:分析肝细胞癌组织中FHIT基因启动子甲基化状态及其与FHIT基因表达和肝细胞癌临床病理特征的关系。方法:运用甲基化特异性PCR(MSP)方法分析肝细胞癌组织和癌旁正常肝脏组织中FHIT基因启动子甲基化状况;应用RT-PCT和Western免疫印迹方法检测FHIT基因mRNA和蛋白的表达情况;统计学分析FHIT基因启动子甲基化与肝细胞癌临床病理特征的关系。结果:MSP分析结果表明肝细胞癌组织中FHIT基因甲基化率(60.8%)显著高于癌旁正常组织中FHIT基因甲基化(16.2%;x2=31.071,P=0.000)。同时我们还发现:发生完全或者部分甲基化的肝细胞癌组织或者癌旁正常肝组织中FHIT基因mRNA和蛋白表达水平显著降低。FHIT基因启动子甲基化和肝细胞癌患者的临床分期和肝外转移情况密切相关(P=0.006和0.049),而与其他临床病理特征无相关性(P>0.05)。结论:FHIT基因甲基化是导致FHIT基因在肝细胞癌中失活的一个重要因素,与肝细胞癌的发生密切相关,有望成为肝细胞癌早期诊断的分子检测标志物和分子治疗新靶点。     

人SCF基因5′旁侧-1190～- 853 AT富集区功能研究

 已有的报告基因和EMSA实验研究表明 ,人干细胞生长因子 (SCF)基因 5′旁侧AT富集区- 1 1 90～ - 853在HeLa和MCF 7细胞中均能增强下游基因转录 ,可能为一个核基质结合区(MAR) ,对人SCF基因的转录发挥调控作用 .为进一步研究该AT富集区的功能 ,将人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区分别克隆入SV40或CMV启动子前后紧接着CAT报告基因 ,瞬时转染Jurkat,HepG2和 3T3细胞 ,检测CAT报告基因的瞬时表达活性 .结果表明 :人SCF基因 5′旁侧- 1 1 90～ - 853AT富集区在Jurkat和HepG2细胞中 ,对分别由SV40和CMV启动子引导的CAT基因表达均有抑制作用 ;但在 3T3细胞中对SV40启动子的转录活性表现出增强作用 ,对CMV启动子的转录活性无明显影响 .这些结果提示 ,人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区转录调控具有组织细胞特异性 ,在不同的细胞中可能发挥转录增强或抑制作用