用逆转录套式PCR检测临床标本中的腮腺炎病毒RNA

流行性腮腺炎是儿童常见呼吸道传染病,并发症多为睾丸炎、无菌脑炎等。个别患者甚至因严重的脑炎并发症而死亡［１］。故有必要对患者进行早期病原诊断,以利于早期治疗。腮腺炎病毒ＲＮＡ中小疏水蛋白（ＳＨ）基因作为高变区在不同毒株的分子特性鉴别中比其它基因片段更...     

定量多聚酶链反应法在丙型肝炎研究中的应用

丙型肝炎病毒核酸检测是诊断ＨＣＶ感染敏感,特异的手段,常规多聚酶链反应只能定性不能定量检测丙型肝炎病毒血症水平。近来发展的定量ＰＣＲ法已用于丙型肝炎抗病毒治疗及发病机制的研究,增进了对丙型肝炎的认识。     

RNA病毒RNA聚合酶的研究进展

自然界仅有ＲＮＡ病毒以ＲＮＡ作为基因载体。依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶在这种病毒的增殖复制期起到了非常重要的作用。它一方面以病毒ＲＮＡ为模板复制子代病毒的基因,另一方面也将病毒增殖期间需要的蛋白质和酶类的基因转录成为ｍＲＮＡ,也就是说它担负了复制酶和转...     

RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶的结构与功能

RNA病毒一般传播迅速,给人类和自然造成巨大危害和威胁.许多RNA病毒的结构蛋白在基础研究和应用方面已日趋完善.相比之下,就非结构蛋白(NS)所做的研究较少,存在许多未知问题.在这些非结构蛋白中,病毒自身编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)对病毒的复制起关键作用.对RdRP的研究不仅使对病毒RNA复制的机制更精细明了,且有可能提供新的抗病毒靶标和诊断试剂.本文对RdRP特别是动物RNA病毒RdRP的结果与功能作一综述.     

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。     

HBV─C基因探针的制备及应用

应用ＰＣＲ技术扩增出ＨＢＶＤＮＡＣ基因片段并与ｐＡＴ１５３质粒重组,转化到Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩ中,经体内扩增,提纯,用光生物素标记,制备了Ｃ基因的重组质粒探针。该探针检测灵敏度在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹中达１ｐｇ,在点印迹中为５ｐｇ。用此探针以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方式配合ＰＣＲ技术检测乙肝病人血清中的ＨＢＶＤＮＡ,在５３例ＰＣＲ产物电泳检测阴性的样品中,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交又检出１８例阳性。     

猴D型反转录病毒巢式PCR检测方法的建立

目的建立SRV-1巢式PCR检测方法并进行初步应用。方法针对SRV-1env基因的保守区序列,设计特异性引物,以感染SRV-1 Raji细胞提取出的含有前病毒DNA的基因组DNA为模板,进行巢式PCR反应。扩增产物测序后与GenBank报道的序列进行同源比对。将DNA样本进行10倍梯度稀释,以检测巢式PCR反应的灵敏度。使用该方法对正常Raji细胞以及感染SIV、STLV的外周血淋巴细胞DNA样本进行扩增,检测该方法的特异性。用建立的巢式PCR方法检测40份储存猴血标本。结果使用巢式PCR扩增出的特异片段经测序分析,结果证实与GenBank报道的序列一致。所建立的巢式PCR检测法检测限度可达1.5×10-3ng/μL,而且方法特异。用此方法检测40份猴血标本,未检测到阳性标本。结论初步建立SRV-1的巢式PCR检测方法,该方法灵敏、特异,为SRV-1的检测提供了一个快速、有效的手段。     

上海部分地区戊型肝炎病毒(HEV)基因型的分析

为了解戊型肝炎病毒(HEV)在上海部分地区流行的基因型,采用RT-nPCR的方法检验35例急性散发性戊型肝炎患者中HEV RNA,并对阳性产物进行克隆测序,然后对其基因型进行分析.结果显示在35例急性散发性戊型肝炎患者中PCR阳性为9例,测序证实8例为HEV的基因序列;其中1例为HEV 1型,7例为HEV 4型.提示在上海部分地区的急性散发性戊型肝炎中以HEV 4型感染为主.     

肽核酸在病毒检测与治疗中的应用 *

肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)是以多肽骨架取代糖磷酸主链的寡核苷酸类似物,又称第三代反义核酸。PNA的电中性多肽骨架结构,使其保留类似糖磷酸链寡核苷酸高靶标亲和力的同时,比糖磷酸主链具有更强的酶稳定性和热稳定性,已成为当今寡核苷酸类似物研究的热点。一方面,PNA对病毒的复制与突变水平具有的快速、有效和准确的检测性能,对疾病的进一步治疗具有重要意义;另一方面,基于PNA的序列特异性和剂量依赖性,能在基因水平上对病毒的生命周期进行特异性的调控,从而能更有效地实现抑制病毒在宿主细胞中生存和复制的目的。结合近十年来的文献,综述了PNA应用于不同病毒的检测及病毒性疾病治疗的最新进展和作用机制,以期为PNA的临床产品研发提供新的思路。     

上海部分地区戊型肝炎病毒（HEV）基因型的分析

为了解戊型肝炎病毒 (HEV)在上海部分地区流行的基因型 ,采用RT nPCR的方法检验 35例急性散发性戊型肝炎患者中HEVRNA ,并对阳性产物进行克隆测序 ,然后对其基因型进行分析。结果显示在 35例急性散发性戊型肝炎患者中PCR阳性为 9例 ,测序证实 8例为HEV的基因序列 ;其中 1例为HEV 1型 ,7例为HEV 4型。提示在上海部分地区的急性散发性戊型肝炎中以HEV 4型感染为主     

PCR制备地高辛素标记的探针检测轮状病毒核酸

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术,制备了轮状病毒第９基因部分片段的地高辛标记的ｃＤＮＡ探针。ＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交表明该探针具有轮状病毒Ａ组的特异性,可检出１０ｐｇＨＲＶ－ＲＮＡ。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交,两种方法的结果一致;同时将斑点杂交法与ＰＡＧＥ法的结果进行了比较。实验结果表明用ＰＣＲ技术直接制备地高辛索标记的ｃＤＮＡ探针具有方便、快速、标记率高、特异性强的特点,具有一定的应用前景。     

庚型肝炎病毒5‘端非编码区cDNA的序列分析

为了解国CBV-C/HCV株的基因序列与国外分离株的同源性状况,对我国GBV-C/HCV的5’端非编码区（5’NCR）。cDNA进行了序列测定。参考国外发表的序列资料,在相对保守的5’NCR设计两对HGV特异性引物。采用热变性法提取云南省一个静脉吸毒者血浆中的GBV－C／HGVRNA逆转录为cDNA后进行巢式聚合酶链反应（PCR）扩增,获得238bp的片段。PCR产物纯化后直接经双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。与国外分离株比较,同源性为86.36％～90.9t％,微分区域变异较大。结果表明,所扩增片段属于GBV－C／HGV基因,所测序列可为引物设计据供依据。对核酸变异性分析有一定意义。