用免疫亲和层析法纯化萝卜 PHGPx 天然蛋白

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 (RsPHGPx) 是一个定位于线粒体的蛋白质 . 为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的 RsPHGPx. 用重组 RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗 RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组 RsPHGPx 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗 RsPHGPx 的抗体 . 将纯化好的抗体偶联到一个 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗 RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱 . 经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案 . 按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质 . 免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗 RsPHGPx 的抗血清特异识别 . 酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的 PHGPx 活性 . 这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的 RsPHGPx 天然蛋白 . 这是首个关于定位于植物细胞器的 PHGPx 蛋白纯化的报道 . 这一结果为准确测定 RsPHGPx 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物 PHGPx 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究 .     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

自1972年Silber等入首先从T_4噬菌体感染的大肠杆菌中分离出RNA连接酶后,人们对分离纯化这种酶的工作进行了很大的改进。目前有些实验室已能制备较纯的T_4RNA连接酶,但方法比较繁琐,通常要经过六个层析牲才能得到较好的结果。甲此寻求一种简单有效的纯化方法是很有意义的。我们将免疫亲和层析用于T_4RNA连接酶的纯化,方法简便,同时所得到的酶测不到RNase的活性,可用于一定序列寡聚核糖核酸的合成。     

免疫亲和层析法纯化苦瓜几丁酶

用扁豆几丁酶免疫家兔,获得抗扁豆几丁酶的抗体,将此抗体与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ偶联,制备免疫亲和吸附剂,用以纯化苦瓜几丁酶．苦瓜叶片的粗提液经过免疫亲和吸附柱后,可获得电泳纯的几丁酶,其分子量为３５ ｋＤ,与用几丁质凝胶为亲和吸附剂的纯化结果一致．表明利用植物几丁酶在结构上的保守性,用免疫亲和法可纯化不同植物的同类几丁酶．与几丁质凝胶亲和柱相比,免疫亲和法纯化植物几丁酶具有快速、亲和柱可重复使用等的优点．利用免疫亲和层析获得的纯化样品,研究了苦瓜几丁酶对真菌的抑制试验,研究结果表明,苦瓜几丁酶能分解棉花枯萎病菌的菌丝体细胞壁制备物,并对其孢子芽管的伸长有一定抑制作用．     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

本文描述了一种新的、简化了的纯化T_4RNA连接酶的方法——免疫亲和层析法.利用这种纯化方法得到的酶,经SDS-凝胶电泳,得到一条主带。将此酶与~(32)pCp及CpGpGpA(或tRNA)一起进行连接反应,未见到RNase杂酶的降解作用。用此方法制备的酶,可用于确定顺序的核酸的合成。     

亲和层析法纯化人绒毛膜促性腺激素

本文介绍了一种应用抗hCG β亚单位单克隆抗体亲和层析提纯hCG的方法。结果表明,该法具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。hCG回收率为96％,免疫学活性17000IU/mg蛋白,生物学活性(小鼠子宫称重法)达到10 000U/mg蛋白以上。     

免疫亲和层析法分离纯化含次黄嘌呤核苷mRNA

采用免疫亲和层析法分离纯化含次黄嘌呤核苷的mRNA(I-mRNA）。将Poly-I与BSA交联,并用Poly-I-BSA交联体免疫家兔,获取抗次黄呤核苷抗血清,斑点印迹法检测到该抗体滴度高、选择性强,将抗次黄嘌呤核苷抗体与蛋白A Sapharose交联,并制备抗体亲和层析柱。将小鼠肺mRNA上样于层析柱,淋洗层析柱后,用洗脱液洗脱I－mRNA,并以斑点印迹法在洗脱液中检测到很强的I－mRNA阳性信号;淋洗液中I－mRNA阳性信号的强度则随淋洗液体积的增加而减弱。以上结果表明,应用本方法可以有效分离得到含次黄嘌呤核苷的mRNA。     

膜渗滤亲和层析法纯化腹水单克隆抗体

用膜渗滤亲和层析法纯化腹水单克隆抗体（McAb）.采用硝酸纤维素膜（NCM）作固相支持物吸附抗原,用负压使小鼠腹水渗滤NCM,在滤过的同时腹水中的McAb不断结合于NCM上吸附的抗原,再将McAb从NCM上解离,从而得到高纯度的McAb.用此法纯化抗白蛋白（Alb）McAb.结果提纯的Alb McAb纯度达PAGE电泳单条带,将此McAb点样NCM用于斑点免疫渗滤法（DIFA）检测Alb,其灵敏度比用腹水点样时高20倍.该法快速简便,可代替亲和层析柱用于纯化McAb.     

应用A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

应用Protein A亲和层析法,从采集的小鼠腹水中纯化出了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体,用SDS-PAGE和ELISA法分别检测了纯化后单克隆抗体的纯度及效价,结果显示,电泳为两条带,分别为免疫球蛋白G(IgG)的重链和轻链,纯化后的单克隆抗体纯度达到电泳纯,应用间接ELISA法测定腹水效价为1×10-7左右,与未纯化前无差异。结果表明,应用A蛋白亲和层析法能够得到纯度较高的单克隆抗体,适用于高纯度单克隆抗体的制备。     

免疫亲和层析法纯化单链尿激酶型纤溶酶原激活剂

尿激酶原 (Ｐｒｏ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ,ｐｒｏ ＵＫ) ,也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｓｃｕ ＰＡ) ,与ｔ ＰＡ一样是第二代溶栓药物。给药时 ,保持无活性的酶原状态 ,只激活被纤维蛋白吸附的纤溶酶原 ,而对游离的纤溶酶原没有作用 ,即只在血栓表面才能活化转变为双链尿激酶 (Ｔｗｏ ｃｈａｉｎｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔｃｕ ＰＡ或ＵＫ) ,因而具有较高的特异性溶血栓作用[1 ] 。尿激酶原…     

单抗在人铁蛋白免疫亲和纯化中的应用

抗人铁蛋白单抗６Ｄ６和Ａ－ｈＦ－Ｃ与肝型铁蛋白和心型铁蛋白的反应性有所不同。６Ｄ６对两种铁蛋白的反应性相似;而Ａ－ｈＦ－Ｃ单抗与肝型铁蛋白的反应性较强。我们将６Ｄ６和Ａ－ｈＦ－Ｃ分别制成了亲和凝胶,用来纯化人肝脏和心脏粗抽提物中的铁蛋白。此法具有操作简便,产率和产品纯度高等优点。     

金属螯合亲和层析法纯化猪红细胞超氧化物歧化酶

本文报道以Sephadex G-200为基质的金属螯合亲和层析法纯化SOD、其比活为4508U/mg蛋白,收率为90.4％,经酸、碱、SDS-PAGE、考马斯亮兰染色均呈一条带,特异性的SOD活性染色呈阳性。分子量为34,000,氨基酸组成测定表明Tyr含量少,Gly含量高,紫外吸收光谱最大吸收在258nm处,园二色谱结果表明SOD空间结构为β—折迭及无规态,含极少量或几乎不含α—螺旋,等电聚焦电泳测定SOD有微不均一性,等电点分别为5.25,5.35和5.65。     

单克隆抗体亲和层析法纯化重组溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶能够特异性杀灭金黄色葡萄球菌且不易产生耐药性, 有望成为治疗葡萄球菌属细菌引发感染的特效药物。为获得高纯度的重组溶葡萄球菌酶以达到药用标准, 本研究构建了一种以重组溶葡萄球菌酶单克隆抗体为配体的亲和层析纯化方法。纯化后的重组溶葡萄球菌酶纯度大于95%, 得率大于90%, 即使重复使用30多次, 纯化效率不变。且经比色法鉴定纯化后的重组溶葡萄球菌酶仍具有良好的活性。该方法步骤简单, 纯化效果好, 为生产高纯度重组溶葡萄球菌酶奠定了基础。     

纯化苯丙氨酸解氨酶的亲和层析法

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶,与植物体内一些重要的次生物质——木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等的合成密切有关,因此在细胞分化、病理生理等研究中可作为生理指标。     

纯化小麦α-淀粉酶的亲和层析法

纯化α-淀粉酶有多种方法。Mac Gregor等以及Kruger和Tkachuk分别应用羧甲基纤锥素离子交换层析与丙酮分部、糖元沉淀和离子交换层析,各自从大麦及春小麦分离了α-淀粉酶。Tkachuk又发展了以α-环化糊精为配基的α-淀粉酶分离纯化的亲和层析法。由于亲和层析法简便、快速、高效,因而获得了广泛的应用。我们以β-环化糊精(β-Cyclodextrin)为配基,分离纯化了小麦α-淀粉酶。现介绍如下。     

蛋白A亲和层析法纯化单克隆抗体工艺的优化

治疗性单克隆抗体药物已成为生物医药领域市场最主要的产品类别。蛋白A亲和层析作为第一步捕获抗体蛋白最为有效的手段仍然在现有单克隆抗体纯化平台中占据主导地位。在本研究中,首先开发了一种基于低p H处理抗体细胞回收液的新型细胞液回收技术,该技术能有效去除宿主相关污染物(非组蛋白宿主杂质蛋白、组蛋白、DNA、蛋白聚合物等),同时保证较高的抗体回收率。通过该技术有效预处理后,蛋白A纯化效率可提高10倍左右,并且有效避免了抗体洗脱液中和后浊度的上升,大大减轻了后续蛋白纯化的压力。同时我们也对酸性处理中各种宿主杂质去除机制进行了研究。然后,预处理的洗脱液再经一步Capto adhere色谱纯化,非组蛋白宿主杂质蛋白降低至5 ppm、DNA小于1 ppb、组蛋白降低至检测限以下、蛋白聚合物小于0.01%。总过程抗体蛋白收率87%。该两步法抗体纯化技术可有效集成至当前主流抗体纯化平台,具有良好的大规模应用价值。     

亲和层析法纯化霍乱毒素及其B亚单位

利用GM1偶联活化的Sephadex G50或扰CT IgG偶联活化的Sepharose 4B,我们已成功地建立了两种亲和层析纯化CT和CT-B的方法,获得了纯化产品。受体亲和柱对CT-B和CT的分离效率分别为71.6％或48.3％,抗体亲和柱分别为50％或51.7％。纯化产物经SDSPAGE、PAGE分析表明均达到亲和层析电泳纯级。GM1-ELISA、CHO细胞测毒加间接免疫荧光检测、家兔肠段结扎试验和家兔免疫保护试验结果提示纯化产物具有良好的生物学活性。这种有效而简单的方法可推广应用于CT或CT相关毒素的纯化。     

纯化,测定植物中细胞分裂素的免疫亲和层析法和酶联免疫法

近年来微量的植物激素的定量分析方法有很大发展,Weiler将放射免疫技术引入细胞分裂素的测定,许多研究者对植物激素的免疫测定做了改进。细胞分裂素的酶联免疫吸附分析(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、不需要昂贵设备、无放射性污染等优点,日益为各实验室采用。如何简化植物样品的纯化步骤,提高检测的选择性和灵敏度仍然是细胞分裂素免疫测定的限制因素。本     

用亲和层析法制备免疫纯的抗乙型肝炎抗原的抗体

用于检测乙型肝炎抗原(HB Ag)的诊断血清,一般是用初步提纯的HB Ag免疫动物所得到的免疫血清经正常人血清在液相吸收处理后制成。这种诊断血清只能用于灵敏度较低的检测方法,如琼脂扩散、对流电泳等。对灵敏度较高的检测方法如反向被动血     

亲和层析法分离纯化猪肺血管紧张素转换酶

亲和胶合成实验以双环氧化合物1,4-丁二醇-2-缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether)为活化体及连接臂,在硼氢化钠(NaBH)存在的碱性条件下,将载体Sepharose CL―4B与雷诺普利(lisinopril)共价连接在一起,成功合成亲和层析胶,并利用亲和层析胶对猪肺血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme, ACE）进行分离提纯.猪肺组织匀浆经1.6～2.6 mol/L硫酸铵分级沉淀、透析平衡、亲和柱分离等步骤,从200 g猪肺中提纯得到0.79 mg ACE蛋白,酶活力回收11.9％,比活力38.8 U/mg.与层析前的酶液比较,亲和层析一步提纯可达264倍;与肺匀浆液比较提纯达808倍.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见,提纯的猪肺ACE为一条带,分子质量约为180 ku.