PhoQ基因重组鼠伤寒沙门氏菌株的构建及毒力研究

应用PCR技术从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA中克隆phoQ基因片段,构建原核表达pUC18重组质粒,测定序列(GenBank登录号为DQ787014),并转入鼠伤寒沙门氏菌,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,进行高效表达。对重组菌株、野生菌株进行毒力检测对比实验,通过口腔注入45日龄健康无菌KM小鼠,测定其半数致死量(LD50)。结果发现：重组菌株与野生菌株的毒力存在显著差异,其半致死量分别为3.981×107 cf u/ mL and 5.012×102 cf u/ mL,PhoQ基因重组菌株的毒力远远低于非重组菌株。说明phoQ基因是调节鼠伤寒沙门氏菌致病机制中一个重要的调节因子。     

胃肠炎模型中毒力不同的鼠伤寒沙门氏菌对兔回肠粘膜侵袭的定量

胃肠炎模型中毒力不同的鼠伤寒沙门氏菌对兔回肠粘膜侵袭的定量作者建立了一种不对称的器官培养系统,可以维持刚离体的兔回肠组织结构和功能的完整性达４小时。并第一次体外对刚离体的功能性肠组织进行了侵袭实验的定量研究。作者以７株毒力不同的菌株作为试验菌。先研究...     

疟原虫抗原B表位NKND在鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白中的表达

疟原虫抗原B表位NKND是由本课题组首先报道的一个新的疟疾抗原表位．它是存在于多种不同疟原虫分离株中的保守序列．以减毒沙门氏菌为载体制备口服活疫苗,方法简单,使用方便,其鞭毛蛋白有较强的免疫原性,有利于激发人体的细胞和体液免疫．人工合成8肽的实验中[2]发现NKNDD可增强NKND对相应抗体的亲和力．将人工合成的NKNDD寡核苷酸片段插入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白表达体系中,经Western杂交鉴定,表达出具有多拷贝NKNDD表位的重组鞭毛蛋白．     

疟原虫抗原B表位NKND在鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白中的表达

疟原虫抗原Ｂ表位ＮＫＮＤ是由本课题组首先报道的一个新的疟疾抗原表位,它是存在于多种不同疟原虫分离株中的保守序列,以减毒沙门菌为载体制备口服活疫苗,方法简单,使用方便,其鞭毛蛋白有较强的免疫原性,有利于激发人体的细胞和体液免疫,人工合成８肽的实验中发现ＮＫＮＤＤ可增强ＮＫＮＤ相应抗体的亲和力,将人工合成的ＮＫＮＤＤ寡核苷酸片段插入鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白表达体系中,经Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交鉴定,表达出具有     

用体内激活的启动子调控HCV核心抗原表达可增强重组鼠伤寒沙门氏菌的免疫原性

为提高抗原表达质粒在重组伤寒沙门氏菌中的稳定性以增强重组伤寒沙门氏菌诱导的免疫应答 ,克隆鼠伤寒沙门氏菌pagC基因启动子 ,以其为转录调控元件构建HCV核心抗原表达质粒 ,转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中。体外培养时 ,Mg2 能够剂量依赖性抑制该重组菌表达HCV核心抗原。将该重组菌和组成性表达的重组菌分别口服接种BALB/c小鼠 ,观察质粒的稳定性和小鼠的免疫应答。结果表明 ,体内激活的pagC基因启动子能明显提高质粒在重组鼠伤寒沙门氏菌中的稳定性和增强重组菌诱导的体液和细胞免疫应答 ,这为发展高效免疫、成本低廉的口服丙肝疫苗提供了一个新思路     

表达大肠杆菌LT—B抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

采用无毒的鼠伤寒沙门氏菌sR一1l△Cya,△Crp,△asd菌株作为宿主菌,选择相应的asd+表达载体构建了含大肠杆菌肠毒素B亚基基因(toxB)的重组质粒,并通过两次转化引入宿主菌,构成了平衡致死的重组体。特异性的测定表明,这种无抗药性的杂合菌株能较高水平地表达LT—B抗原,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗的研究基础。     

表达大肠杆菌LT-B/ST融合抗原的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

编码LT-B/ST融合抗原的基因插入pYA248载体中,构建了重组质粒pXZL66。该重组质粒转入无毒鼠伤寒沙门氏菌SR-11,ΔCya,Δcrp,Δasd菌株X4072。此无抗药性的杂合菌株X4072(pXZL66)表达的LT-B/ST融合抗原具有LT和ST抗原性而没有生物毒性,可望成为预防ETEC腹泻和相应的沙门氏菌病双价口服活疫苗候选株。     

恶性疟原虫74肽抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌的表达和家兔免疫应答

利用减毒鼠伤寒沙门氏菌来表达外源抗原并制备口服活菌苗,是疫苗研究的一个新的突破。作者已在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261以β—半乳糖苷酶(GZ)融合蛋白的形式表达了人工合成的恶性疟原虫74肽基因HGFC。现报道用活菌SL3261(pWRC)(C组)、SL3261(pWR450-1)(R组)分别免疫新西兰家兔,研究其在家兔体内免疫应答的结果。     

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门氏菌asd基因的克隆及序列分析

以鼠伤寒沙门氏茵标准株基因组DNA作为模板,用PCR的方法扩增鼠伤寒沙门氏菌的asd基因并克隆入质粒pUCl9,并对其进行测序,序列与献报道一致。同时将质粒pYA248上的链球菌asd基因进行了置换,观察了分别含有链球菌asd基因与鼠伤寒沙门氏菌asd基因的质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4072中的生长情况,结果表明含有鼠伤寒沙门氏菌的asd基因的高拷贝质粒pUCl9的菌株生长情况更好。为完善染色体／质粒平衡致死系统,构建减毒鼠伤寒沙门氏活菌疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门氏菌c-di-GMP结合蛋白YcgR的表达、纯化及活性鉴定

【背景】在鼠伤寒沙门氏菌中,c-di-GMP结合蛋白YcgR通过与鞭毛运动蛋白的相互作用,抑制鞭毛运动速度,使细菌由浮游生长向生物膜产生及侵染宿主的静止状态转变。然而,目前关于该蛋白的结构、功能以及与c-di-GMP结合后调控细菌运动状态的分子机制还不清楚。【目的】通过原核表达,获得高纯度的YcgR蛋白,并对其二级结构稳定性以及c-di-GMP结合活性进行表征,为进一步确定YcgR的结构以及阐明c-di-GMP如何通过结合YcgR而减缓细菌运动速度的分子机制奠定基础。【方法】通过构建重组大肠肝菌对YcgR进行原核表达;通过Ni-NTA镍离子亲和层析柱和体积排阻色谱两步纯化获得高纯度的YcgR蛋白;预测YcgR蛋白质结构,利用圆二色光谱仪(CD)测定其二级结构;通过等温滴定量热法(ITC)和热转移技术(Protein thermal shift)研究YcgR与c-di-GMP的结合活性。【结果】菌落PCR和质粒测序结果表明,表达YcgR的重组大肠杆菌构建成功;SDS-PAGE和体积排阻色谱显示YcgR的分子量大约为28 kD,在溶液中以二聚体的形式存在;通过预测和对比,发现YcgR的结构与同源蛋白PP4396高度相似,都有一个响应c-di-GMP的PilZ结构域,且CD结果显示YcgR具有稳定的二级结构;ITC和Thermal Shift结果表明,YcgR与c-di-GMP有较强的结合活性,其Kd值为50 nmol/L。【结论】首次实现了鼠伤寒沙门氏菌YcgR蛋白的原核表达及纯化,表征了其c-di-GMP结合活性,为进一步研究YcgR蛋白与细菌信号分子c-di-GMP调控鞭毛运动的分子机制奠定基础,并为鼠伤寒沙门氏菌抗感染药物的研发和治疗提供新的策略。     

表达禽流感病毒特异性siRNA分子减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

为了寻找一种新的短干扰RNA(short interfering RNA,si RNA)片段的表达和递送系统,并进行评价,根据禽流感病毒核苷酸序列,设计了3条分别针对A型禽流感病毒核衣壳蛋白、聚合酶A和H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性si RNA分子,人工合成相应DNA片段,退火后形成双链,与阴性对照片段分别连接到构建的pSIREN-ASD ZsGreen载体鼠源U6启动子下游,测序鉴定证实获得了阳性质粒,分别命名为PAZ-NP、PAZ-PA、PAZ-HA和PAZ-NC,1ng的质粒可以完全抑制50个PFU的禽流感病毒在MDCK细胞上的复制,细胞不产生任何病变,细胞上清的血凝效价为20,而对照组细胞在病毒感染36~48h后细胞变圆、死亡、脱落,其细胞上清的血凝效价可达24。将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到重组沙门氏菌X4550(PAZ-NP)、X4550(PAZ-PA)、X4550(PAZ-HA)和X4550(PAZ-NC)。对4日龄雏鸡口服1×109菌落形成单位(CFU)的重组菌后第1d、7d、15d用105ELD50的H5亚型AIV进行攻毒,最后一次攻毒后观察15d,实验结束时采泄殖腔棉拭子对存活鸡进行病毒分离。结果表明,表达不同的si RNA分子对雏鸡有一定的保护力,保护率为27%~50%不等,存活鸡泄殖腔棉拭子未分离到病毒,说明重组减毒沙门氏菌携带质粒在体内产生的si RNA能够对机体产生一定保护力。     

伤寒沙门氏菌口服活菌苗Ty21a Vi抗原阳性突变株的组建及特性

<正>伤寒至今仍然是发展中国家的主要卫生问题,尤其在学令儿童中的发病率很高,据估计,全世界每年伤寒病例超过3000万,死亡病例约50万。灭活全菌体菌苗大约已经使用75年,尽管几个现场结果表明该菌苗有效,但因其产生不良反应的频率较高使之作为一种公共卫生措施使用而受到限制。 Germanier和Frer叙述了称之为Ty21a的伤寒沙门氏突变株,它缺乏UDP-葡萄糖-4表异构酶,当口服免疫人群时,Ty21a株显示出良好的可耐受性,该菌苗现场效果表明对人群提供了良好的保护水平(67～95%),口服肠溶衣制剂3次剂量投服后至少可提供为期4年的保护作用。 近年已对纯化Vi抗原的效力进行了两个现场考核。Vi抗原是一种α-1、4-2-脱氧-2-N-乙基半乳糖胺糖醛酸的同聚物,这种酸性多糖荚膜在伤寒病人的临床分离物中即使不是全部世是大部分的分离物中表达出来。通常Vi是一种毒力因     

鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株的构建及其耐药性

[背景]鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种重要的人兽共患病原菌,其多重耐药性问题日益严重,双组分系统可调控鼠伤寒沙门氏菌的耐药性。[目的]通过构建鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株及回补株探究BaeSR双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响。[方法]在BaeSR双组分系统和AcrB外排泵双缺失株（CRΔbaeSRΔacrB）的基础上构建baeR过表达株（CRpbaeRΔbaeSRΔacrB）及baeR回补株（CRcbaeRΔbaeSRΔacrB）,测定双缺失株、回补株和过表达株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并对其生长特性、生物膜形成能力及运动性进行分析。采用转录组学技术筛选与耐药相关的差异表达基因,RT-qPCR验证耐药相关基因。[结果]构建了鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株和baeR回补株。与双缺失株相比,过表达株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、乙酰甲喹、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林和氨苄西林的MIC分别升高2-256倍,对大观霉素、安普霉素的MIC下降了50%;与双缺失株相比,回补株对头孢他啶...     

表达霍乱CT-B和LPS-O抗原的鼠伤寒菌苗株的构建

编码霍乱CT—B和LPSO抗原的基因与载体质粒pYA248重组后,转入△cya△crp △ asd减毒鼠伤寒疫苗株x4072,构建成无药物抗性、带双价抗原的工程菌株x4072(pMG306)。该菌株能分泌表达特异的霍乱CTB抗原,并且在菌体表面同时表达霍乱和鼠伤寒的。抗原。小鼠腹腔免疫和攻击试验表明该菌苗株对霍乱毒株的攻击具有良好的保护作用。本研究为新型霍乱／鼠伤寒双价口服活疫苗的构建打下了基础。     

表达霍乱CT-B和LPS-O抗原的鼠伤寒菌苗株的构建

将编码霍乱ＣＴ－Ｂ和ＬＰＳ－Ｏ抗原的基因与载体质粒ｐＹＡ２４８重组后,转入△ｃｙａ△ｃｒｐ△ａｓｄ减毒鼠伤寒疫苗株ｘ４０７２构建成无药物抗性,带双价抗原的工程菌株ｘ４０７２（ｐＭＧ３０６）。该菌株能分泌表达特异的霍乱ＣＴ－Ｂ抗原,并且在菌体表面同时表达霍乱和鼠伤寒的Ｏ抗原。小鼠腹腔免疫和攻击试验表明该菌株对霍乱毒株的攻击具有良好的保护作用。本研究为新型献计霍乱／鼠伤寒双价口服活疫苗的构建打下了基础     

表达幽门螺杆菌黏附素保守区的减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

为构建表达幽门螺杆菌（Hp）黏附素保守区（AB）的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗,采用缺失腺苷酸环化酶基因（Δcya）、环腺苷酸受体蛋白基因（Δcrp）以及天冬氨酸β-半醛脱氢酶基因（Δasd）的鼠伤寒沙门菌（X4072）作为宿主,将编码AB的基因插入Asd⁺的组成型表达载体pYA248,通过两次转化引入宿主菌,构建了表达AB基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌X4072（pYA248-AB）,采用桥联法ELISA测定X4072（pYA248-AB）培养上清液和裂解上清液中AB的抗原性,参照Meacock叙述的方法及重组菌生长曲线的测定来确定重组菌株的稳定性,通过C57BL/6小鼠口服测定半致死量来确定重组菌的安全性。成功构建了表达AB的减毒鼠伤寒沙门菌重组菌株S.typhimurium X4072(pYA248-AB),桥联法ELISA测定表明重组菌X4072（pYA248-AB）培养上清中AB的含量高于菌体裂解液,重组菌pYA248-AB在没有选择压力的情况下培养100代,随机挑选的重组菌全部都能生长,且在ELISA测定AB抗原时均显阳性。重组菌的生长曲线测定表明,X4072（pYA248）和X4072（pYA248-AB）的生长状态基本一致;口服重组菌株X4072(pYA248-AB)1.0×10¹⁰cfu.30d后,C57BL/6存活率仍为100%。成功构建了表达AB的无抗性的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗X4072（pYA248-AB）,体外实验表明重组质粒是稳定的,动物实验证明重组菌株是安全的;为防治幽门螺杆菌感染提供了口服活菌疫苗候选株。     

菌株死活及抗原量对减毒沙门氏菌疫苗载体的影响

菌株死活及抗原量对减毒沙门氏菌疫苗载体的影响众所周知，口服灭活的伤寒疫苗对伤寒感染没有任何保护，而口服灭活的沙门氏菌疫苗载体对其所表达的外源蛋白免疫效果是否有影响还未知，作者进行了如下验证试验。质粒ｐＪＣ２１７可表达大肠杆菌热不稳定肠毒素一个亚单位Ｌ...