小鼠骨髓树突状细胞对白念珠菌吞噬、杀伤作用的研究

目的体外分离培养小鼠骨髓树突状细胞(Dendritic Cell,DC)并与白念珠菌共同孵育,研究不同浓度的DC对白念珠菌的吞噬、杀伤作用,并研究随着共孵育时间的延长DC表型的变化及其吞噬、杀伤白念珠菌能力的变化。方法无菌条件下分离培养C57小鼠骨髓DC;倒置显微镜下观察DC的形态;Cellometer Mini细胞计数仪测定DC生长曲线及细胞直径变化;流式细胞仪检测DC及白念珠菌刺激后DC表面标志物CD11c及其表面分子MHCⅡ、CD40、CD80及CD86的表达;光学显微镜、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪测定DC对白念珠菌的吞噬及杀伤作用。结果体外培养10d小鼠骨髓DC,倒置显微镜观察可见典型DC形态;随着培养时间的延长,细胞逐渐增大,培养第10天时,细胞直径分布最多的为10.2μm;生长曲线显示,DC呈倍数增长,第2~9天为细胞对数生长期,第9天左右增殖曲线达到顶峰。培养第10天,未经白念珠菌刺激的DC表面CD11c分子及CD80分子高水平表达,CD40、CD86及MHCⅡ低表达;经白念珠菌刺激后,DC表面CD11c分子、CD80、CD40、CD86及MHCⅡ均高表达,呈成熟DC表型。激光共聚焦(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)及流式细胞仪(Flow Cytometer,FCM)检测DC对白念珠菌吞噬作用,当DC与白念珠菌的比例为1∶1时,随着共培养时间的延长(30min~1.5h),吞噬率无明显变化(P=0.063);当DC与白念珠菌比例为2∶1、1∶2及1∶4,随着DC细胞所占比例的减小,DC细胞吞噬作用增强,当比例为1∶4时,DC吞噬作用最强,且随着共培养时间的延长(30min~1.5h),吞噬率也明显上升,差异有统计学意义(P=0.003;P=0.002;P=0.002)。显微镜检测DC对白念珠菌杀伤率,可见随着时间的延长,各实验组的杀伤率下降(P=0.000);当DC∶白念珠菌=1∶1时,较2∶1时,杀伤率明显下降,但随着白念珠菌比例在一定范围内的增高(从1∶1到1∶4),杀伤率明显增高,差异有统计学意义(P=0.000)。结论小鼠骨髓细胞体外经GM-CSF诱导可培养DC具有较高的纯度,呈未成熟细胞表型;且每只C57小鼠可获得3×107总数的细胞,可满足一些实验的DC用量。经白念珠菌刺激后DC表型成熟;在一定的比率范围内,DC对白念珠菌有较强的吞噬及杀伤作用,其吞噬作用随着DC与白念珠菌比例的减小而增强。且随着两者作用时间的延长,DC对白念珠菌的吞噬作用逐渐增强而杀伤作用逐渐减弱。     

大鼠骨髓来源未成熟与成熟树突状细胞的对比研究

目的:对比培养大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞与成熟树突状细胞,并从形态学、表型及功能检测等多方面进行对比研究,为后续的实验做出基础研究。方法:大鼠脱臼法处死后取两侧胫骨、股骨,PBS冲洗骨髓腔收集骨髓细胞,经GM-CSF和IL-4刺激培养六天后,对比研究经LPS刺激组与未经LPS刺激培养组细胞状况。结果:①成熟树突状细胞悬浮生长,集落分散,扫描电镜下见其突起数目明显多于未成熟树突状细胞。②成熟树突状细胞高表达表面标记分子CD80、CD86、MHCⅡ,而未成熟树突状细胞均低表达。③成熟树突状细胞培养基上清中IL-12水平高,而未成熟树突状细胞培养基上清中IL-12水平低。④成熟树突状细胞具有强的刺激T细胞增殖能力,而未成熟树突状细胞基本不具有诱导T细胞增殖能力。结论:未成熟状态的树突状细胞具备致耐受原性,可抑制T细胞的应答,而成熟状态的树突状细胞由于获得了免疫刺激潜能从而会对炎性刺激做出反应。     

香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响

通过研究香菇多糖(Lentinan,LNT)对小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow dendritic cells,BMDCs)功能调节的机制,进一步阐明香菇多糖的免疫活性。本实验将BMDCs分成脂多糖(LPS)阳性对照组、LNT处理组和RPMI1640空白对照组,应用酸性磷酸酶活性检测、流式细胞仪检测技术、吞噬实验、酶联免疫吸附试验检测各组BMDCs表型和功能的各种指标。结果显示,LNT(50μg/mL)处理组BMDCs酸性磷酸酶活性降低;BMDCs吞噬能力比RPMI1640空白对照组明显下降;BMDCs表面MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205的表达增加;BMDCs白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达增加。证明了适宜浓度的LNT可以促进BMDCs表型及功能的成熟。     

小鼠骨髓源树突状细胞体外诱导培养及初步鉴定

用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）和重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,进行形态学变化观察,分析细胞表面分子,刺激T细胞增殖,探讨小鼠骨髓源树突状细胞（BMDC）体外诱导培养并进行初步鉴定。体外培养9d后BMDC可达80%以上,光镜下可见典型的树突状细胞形态。清楚表达成熟期主要表面标志物,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。获得了较高纯度的BMDC,避免了使用传统磁珠分离方法所带来的成本高,操作复杂,产出率低的弊端,为研究BMDC功能以及运用开展下游实验提供材料。     

水包油佐剂对小鼠骨髓来源树突状细胞蛋白表达的影响

目的 探索未成熟的小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)的分离诱导培养方法,并研究水包油佐剂对BMDCs蛋白表达的影响.方法 解剖小鼠获得小鼠骨髓细胞,分析在骨髓细胞诱导培养获得未成熟的BMDCs的过程中,红细胞裂解液(red blood cell ...     

小鼠骨髓源性树突状细胞的体外扩增、鉴定及生物学特性研究

目的:对树突状细胞体外大量扩增及树突状细胞的临床应用提供理论基础.方法:以重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白介素-4(rmIL-4)和重组小鼠肿瘤坏死因子-α(rm TNF-α)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞术分析细胞表面分子,并应用混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞的增殖能力.结果:经体外诱导培养第2天即可见大量细胞集落形成;培养至第9天,DC成熟,具有典型的形态,同时DC可以显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖.结论:体外诱导培养可以获得大量小鼠骨髓来源的DC,可广泛应用于临床实验及实验研究.     

藏红花素对白血病患儿骨髓树突状细胞体外增殖作用的影响

目的：探讨藏红花素（crocin）对白血病患儿骨髓树突状细胞体外增殖作用的影响。方法：采用Ficoll-Hypaque法分离急性白血病患者骨髓液单个核细胞,将本实验分为六组。培养至第9天,在倒置显微镜下观察各组细胞形态,对各组细胞进行计数,并行瑞氏-姬姆萨染液染色,在油镜下观察典型树突状细胞的形态,应用流式细胞仪检测各组细胞免疫表型。结果：结果表明,实验各组均得到一定数量典型的DC,对照组中未见,实验各组细胞数目明显高于对照组,差异有显著统计学意义（P〈0.01）。在加入细胞因子的各组中,以E组即加入藏红花素1.25mg/ml组细胞数最高,而C组细胞数与D组细胞数比较无显著差异（P〉0.05）。培养至第9天,流式细胞仪免疫分析显示C、D、E、F各组CD1a＋、CD83＋、HLA-DR＋细胞比例明显高于A、B两组（P〈0.01）,差异有显著统计学意义,A、B两组之间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。D、F组与C组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。E组与C、D、F组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：藏红花素能促进树突状细胞增殖,其促进树突状细胞增殖的能力明显弱于细胞因子的联合作用。藏红花素协同细胞因子促进树突状细胞的成熟具有浓度依赖性,在藏红花素浓度为1.25mg/ml时作用最强,而浓度过高或过低时均未表现出明显的促进作用。     

补体对枯否细胞吞噬分泌功能的影响

枯否细胞是肝内定居的具有分泌功能的巨噬细胞群,本文综述了十来年中补体对枯否细胞吞噬分泌功能影响的研究成果,提出补体的过度活化可能导致枯否细胞功能失常,进而使内源性感染的可能性增加、介导肝损伤。     

藏红花素对白血病患儿骨髓树突状细胞体外增殖作用的影响

目的:探讨藏红花素(crocin)对白血病患儿骨髓树突状细胞体外增殖作用的影响。方法:采用Ficoll-Hypaque法分离急性白血病患者骨髓液单个核细胞,将本实验分为六组。培养至第9天,在倒置显微镜下观察各组细胞形态,对各组细胞进行计数,并行瑞氏-姬姆萨染液染色,在油镜下观察典型树突状细胞的形态,应用流式细胞仪检测各组细胞免疫表型。结果:结果表明,实验各组均得到一定数量典型的DC,对照组中未见,实验各组细胞数目明显高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。在加入细胞因子的各组中,以E组即加入藏红花素1.25mg/ml组细胞数最高,而C组细胞数与D组细胞数比较无显著差异(P>0.05)。培养至第9天,流式细胞仪免疫分析显示C、D、E、F各组CD1a+、CD83+、HLA-DR+细胞比例明显高于A、B两组(P<0.01),差异有显著统计学意义,A、B两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。D、F组与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。E组与C、D、F组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:藏红花素能促进树突状细胞增殖,其促进树突状细胞增殖的能力明显弱于细胞因子的联合作用。藏红花素协同细胞因子促进树突状细胞的成熟具有浓度依赖性,在藏红花素浓度为1.25mg/ml时作用最强,而浓度过高或过低时均未表现出明显的促进作用。     

树突状细胞和抗原负载树突状细胞在肿瘤模型鼠体内的分布和形态学观察

目的:研究体外培养的小鼠树突状细胞(dentritic cells,DCs)和抗原负载树突状细胞在肿瘤模型鼠体内的分布和形态,为肿瘤的生物学治疗提供形态学基础.方法:分离和培养DC,制备B16黑色素瘤细胞抗原,进行共培养,即为抗原负载的DC,Brdu标记DC和抗原负载的DC,建立B16黑色素瘤小鼠模型,于瘤周围皮下注射Brdu标记的DC和抗原负载的DC.应用光镜、免疫组化方法和透射电镜观察DC和抗原负载DC在肿瘤模型鼠体内的分布和形态.结果:免疫组化染色显示Brdu标记的抗原负载DC与DC比较,体积较大.实验组Brdu标记的DC和抗原负载DC分布的数密度和面密度,分别与对照组比较,有显著差异(P＜0.01).电镜下抗原负载DC细胞与DC比较体积较大,核有切迹,细胞表面的突起较粗大弯曲,形态较成熟.结论:抗原负载DC比DC更易集聚于肿瘤组织周围,推测抗原负载DC比Dc可能诱导抗肿瘤效应更强.     

人骨髓基质细胞体外分离及定向培养内皮细胞

用Ficoll(比重1.077 g/ml)从正常成人骨髓中分离骨髓基质细胞(BMSCs),DMEM-HG 培养基内含20?S、GM-CSF(100 u/ml)、VEGF(10 ng/ml)、FGF(5 ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mmol/ L)、肝素(90 u/ml),以及抗生素液进行定向培养和扩增其中的内皮细胞(ECs),Ⅷ因子相关抗原的免疫组化法和透射电镜观察(TEM)鉴定其细胞的性质。结果5.0×105个BMSCs在体外经定向ECs 培养和扩增8代后,获得了6.0×109个ECs,扩增了约1.2×104倍。70%-80%的细胞对Ⅷ因子相关抗原免疫组化呈阳性反应;光镜下细胞呈典型的“鹅卵石”样;TEM下可观察到胞浆内有Weible- palade小体,证实为内皮细胞。实验表明,BMSCs在体外分离和定向培养的ECs,经扩增后可能是心血管组织工程所需种子细胞的又一个重要来源。     

体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为 5-羟色胺敏感性神经元

体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为具有神经元表型和部分功能的细胞。在对Woodbury化学诱导法作改良的基础上,加用全反式视黄酸对骨髓间充质干细胞作预诱导。诱导3h后,细胞开始表现神经元的形态特征,细胞折光性增强,形成收缩的双极或多极胞体和细长突起。细胞可以维持神经元样存活72h以上。诱导5h后,对免疫染色的细胞用DAPI进行复染,(92.4±6.9)%的细胞表达神经元特异性烯醇化酶。诱导24h后,(93.9±5.2)%的细胞表达成熟神经元的标志物神经丝M H。在给予5-羟色胺刺激时可以产生与神经元相似的胞内钙离子峰,且免疫组化证实5-羟色胺1A受体在干细胞上表达微弱,但在分化后的神经元中表达较强。实验不仅从形态、细胞标志物而且从功能上证实诱导后的细胞为5-羟色胺敏感性神经元。     

HSV-1感染大鼠骨髓间充质干细胞及形成潜伏感染的初步研究

在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察单纯疱疹病毒1型感染骨髓间充质干细胞情况.分离并鉴定BMSCs;HSV-1感染BMSCs,观察细胞病变(CPE);建立BMSCs的HSV-1潜伏感染模型.提取总DNA,PCR法扩增BMSCs内的HSV-1特异性片段,检测HSV-1感染BMSCs及潜伏感染.结果显示骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高、形成钙结节,表现出成骨细胞特性.HSV-1感染BMSCs,出现典型的CPE,PCR法证实BMSCs内存在HSV-1的特异性片段.HSV-1潜伏感染的BMSCs,未出现明显的CPE,细胞传至7代,仍可测到HSV-1的基因片段,表明BMSCs有可能形成HSV-1的潜伏感染.大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞.HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞并有形成潜伏感染的趋势.     

诱导体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

选用Wistar大鼠分离骨髓间充质干细胞作体外培养及鉴定其表达抗原CD44、CDw90;采用10μmol／L 5-氮胞苷诱导第1代的骨髓间充质干细胞,于诱导后2、4周进行免疫细胞化学反应检测α-横纹肌肌动蛋白、肌钙蛋白T。证实体外培养的第1代骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷诱导可分化为心肌样细胞,为指导体外诱导的心肌细胞应用于。临床提供一定的理论依据和技术手段。     

小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养方法的比较研究

目的探讨最佳体外诱导培养小鼠成熟树突状细胞（dendritic cells,DC）的方法。方法分离、纯化6周龄C57BL／6小鼠骨髓单核细胞,以含10％胎牛血清、20ng／ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）和10ng／ml重组小鼠白细胞介素-4（IL-4）的RPMI-1640培养基培养7d,然后将细胞分成对照未刺激组、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激组和TNF-α＋脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）刺激组。继续培养48h后,观察各组细胞形态,检测IL-12、IL-6浓度及细胞表面标志CD11c、CD80、CD86和MHC II。结果培养9d后,两刺激组培养的细胞经相差显微镜观察有DC生长。TNF—α刺激组细胞培养上清液中IL-6、IL-12含量显著高于对照组（P〈0．01）,但显著低于TNF—α＋LPS刺激组（P〈0．05）。3组均高表达CD11c,各组间无显著差异;而CD80、CD86和MHC II表达阳性率TNF-α刺激组显著高于对照组（P〈0．01）,TNF-α＋LPS刺激组显著高于单纯TNF—α刺激组（P〈0．05）。结论联合使用TNF-α与LPS刺激可使DC成熟度提高,分泌IL-6、IL-12增加。     

Glutathione Induces Neuronal Differentiation in Rat Bone Marrow Stromal Cells

It has been reported that rat bone marrow stromal cells (BMSCs) are differentiated into neuronal cells by administration of 2-mercaptoethanol [Woodbury et al (2000) J Neurosci Res 61:364–370]. In this study, we examined the effects of various sulfhydryl (SH) compounds on the differentiation of BMSCs obtained from rat femurs. Neuronal differentiation was detected morphologically and immunocytochemically. It was found that the cells treated with reduced glutathione (GSH) apparently differentiated into neurons, showing extensive processes, and expressing neuron-specific enolase and microtubule-associated protein 2. Glutathione monoethyl ester (GEE), which increased the cellular GSH content, showed no effect on the expression of neuronal markers. It is concluded that the neural differentiation of BMSCs occurs by the administration of GSH. It was suggested that extracellular and not intracellular GSH have effects on the induction of the neuronal differentiation of BMSCs.     

Myogenic Differentiation Potential of Mesenchymal Stem Cells Derived from Fetal Bovine Bone Marrow

The myogenic potential of bovine fetal MSC (bfMSC) derived from bone marrow (BM) remains unknown; despite its potential application for the study of myogenesis and its implications for livestock production. In the present study, three protocols for in vitro myogenic differentiation of bfMSC based on the use of DNA methyltransferase inhibitor 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza), myoblast-secreted factor Galectin-1 (Gal-1), and myoblast culture medium SkGM-2 BulletKit were used. Plastic-adherent bfMSC were isolated from fetal BM collected from abattoir-derived fetuses. Post-thaw viability analyses detected 85.6% bfMSC negative for propidium iodine (PI). Levels of muscle regulatory factors (MRF) MYF5, MYF6, MYOD, and DES mRNA were higher (P?MYOD mRNA (Days 7 to 21) and up-regulation of MYF6 (Day 7), MYF5, and DES mRNA (Day 21). Gal-1 and SkGM-2 BulletKit induced sequential down-regulation of early MRF (MYF5) and up-regulation of intermediate (MYOD) and late MRF (DES) mRNA. Moreover, DES and MYF5 were immunodetected in differentiated bfMSC. In conclusion, protocols evaluated in bfMSC induced progress into myogenic differentiation until certain extent evidenced by changes in MRF gene expression.     

骨髓间充质干细胞分化为胰岛细胞治疗糖尿病

糖尿病已成为严重危害人类健康的疾病之一。目前,移植胰岛治疗糖尿病已初见疗效,但由于胰岛来源匮乏和免疫排斥反应而受阻。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)取材方便,容易进行体外分离、培养和纯化,且具有跨越分化潜能。若将自体BMMSCs诱导分化为胰岛细胞,可望解决细胞来源和免疫排除问题,实现糖尿病的自体细胞治疗。现对体外诱导BMMSCs分化为胰岛细胞治疗糖尿病的研究进展进行综述,并指出了存在问题和今后的研究方向。     

矿化液和地塞米松增强大鼠原代骨髓基质细胞NF-kB受体活化剂配体的表达

NF-KB受体活化剂配体（receptor activator for NF-KB ligand,RANKL）是调节破骨细胞生成的重要因子,它可在骨髓基质细胞中表达。矿化液（含10书mol／L地塞米松、10mmol／LB．甘油磷酸钠、50ug／ml L-抗坏血酸）能够诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化,为探讨矿化液及其主要成分地塞米松对大鼠原代骨髓基质细胞表达RANKL的影响,采用矿化液培养原代大鼠骨髓基质细胞48h,通过免疫荧光染色观察RANKL的表达变化。结果显示矿化液和地塞米松在短期内均能增强鼠骨髓基质细胞RANKL的表达,提示地塞米松促进破骨细胞形成的分子机制可能与骨髓基质细胞RANKL表达的改变密切相关。     

阿司匹林对体外培养骨髓基质细胞成骨性分化的影响

目的：探讨阿司匹林对骨髓基质细胞成骨性分化的影响。方法：培养SD大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）,传代3次后进行成骨诱导分化,诱导培养基中加入不同浓度阿司匹林（0.5、1、2、5、10mmol/L）,同时设立对照组。采用cck-8法分析细胞增殖情况。比较阿司匹林组与对照组在细胞碱性磷酸酶（ALP）活性、骨钙素（OC）分泌量、钙结节染色等方面的成骨性差异。结果：阿司匹林无促进细胞增殖活性,而高浓度阿司匹林能够强烈抑制细胞增殖。0.5、1、2mmol/L浓度阿司匹林可促进BMSCs的成骨性分化,中低浓度组碱性磷酸酶含量、骨钙素分泌量在不同阶段显著高于对照组。14天茜素红染色可见中低浓度组钙结节数量高于对照组。结论：中低浓度阿司匹林作用于骨髓基质细胞可促进其成骨细胞特性表达,这表明阿司匹林有促进骨代谢合成的作用。