大肠杆菌表达的人IL-6复性条件研究

采用稀释法复性,筛选重组人白细胞介素-6(rhIL-6)包涵体蛋白的复性条件。结果显示,复性液的浓度、pH值、复性时间和复性蛋白浓度,对重组人白细胞介素-6复性效果有很大影响。在复性液为2mol/L尿素、pH8.5、复性时间为24h和复性蛋白浓度50μg/ml条件下,重组人白细胞介素-6包涵体蛋白的复性效果最佳。     

人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。     

人蛋白质二硫键异构酶Cdna基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人胚胎肝组织中分离纯化出总RNA,在总RNA中提取mRNA,经逆转录得到cDNA第一条链,并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物．进行PCR合成人蛋白质二硫键异构酶(Proteim disulfide isomerase,PDI)cDNA基因,将所得cDNA克隆到质粒pUCl8上,转化大肠杆菌DH5a细胞,进行诱导表达筛选和活性筛选。将筛选的基因克隆到载体pBV220上,在大肠杆菌细胞中表达,产物以溶解形式在胞浆中表达。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析分离,产物的纯度与活性分别为90％、1100u／g。     

pBV220/hIL-4优化表达及其包涵体复性研究

旨在对人白细胞介素-4(hIL-4)上、下游序列进行优化设计,提高在原核系统中的表达量,并对表达的包涵体进行复性研究提高复性率.利用BioSun的RNA二级结构预测模块辅助设计hIL-4起始密码子(AuG)上、下游的序列,使局部二级结构的自由能满足高表达要求;根据pBV220栽体和原核系统的特点优化引物序列提高hIL-4原核表达量.优化hIL-4包涵体复性条件和方法,提高复性率和生物活性.结果显示,成功构建了pBV220/hIL-4高效表达栽体,原核表达的重组人IL-4占细茵总蛋白的35%以上,明显高于优化前表达量;经过复性研究hIL-4包涵体复性率可达到15%以上,生物活性鉴定发现,纯化的hhIL-4蛋白的比活等同或高于国外同类产品.影响原核表达的条件较多,对表达序列的优化设计可以大大提高蛋白的表达量.针对人IL-4基因序列的优化设计提高了人IL-4基因的表达,复性方法的改良提高了复性率和生物活性.     

人白细胞介素18在大肠杆菌中的表达,纯化和复性

用ＲＴ－ＰＣＲ从ＰＨＡ刺激的人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中扩增出人白细胞介素１８（ＩＬ－１８）的ｃＤＮＡ,克隆到表达载体ｐＪＷ２中,经热诱导后在大脾性杆菌中得到高效表达。表达的重组ＩＬ－１８占菌体总局旧白质的２０％,表达的蛋白南分子量约为１８ＫＤ,与预期分子量相符。产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声破碎、洗涤后以８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００柱纯化后,纯度可达９０％以     

大肠杆菌表达的重组hIL-4的分离纯化

对大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 4进行了分离纯化。人 IL- 4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包含体形式存在 ,经过超声破菌、包含体抽提、洗涤处理 ,可使包含体纯度达 70 %以上 ,用 6mol/L盐酸胍变性溶解包含体沉淀后上清直接稀释复性 ,再经浓缩、透析、离子交换色谱一系列纯化步骤终产物纯度达 95 %以上 ,回收率 1 0 %以上 ,比活性达 2 .5× 1 0 6U/mg     

人血小板因子4在大肠杆菌中的高效表达及活性研究

为了提高人血小板因子 4(humanplateletfactor 4,hPF4)的表达 ,在PT7 7 hPF4表达质粒的基础上 ,采用PCR定位突变技术 ,改造人血小板因子 4(hPF4)cDNA基因片段 ,去除cDNA 3′端非翻译区AT富含序列 ,改用大肠杆菌强串联终止密码子TAATAA ,成功构建了高效表达质粒pBV2 2 0 hPF4。摇瓶发酵重组人血小板因子 4的产量达 1 60mg L较原表达质粒PT7 7 hPF4表达量提高了近 80倍。经包涵体的洗涤、变性、复性后 ,采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验测定复性后rhPF4的生物学活性 ,结果显示 :rhPF4具有抑制血管生成活性。     

人Hepcidin融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

为了在大肠杆菌中表达生产hepcidin,根据大肠杆菌密码子偏好性,化学合成了人hepcidin的基因序列,并构建了hepcidin的融合表达载体pET -hpc。pET- hpc在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中表达的hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N端带有 6个组氨酸。通过优化诱导表达条件,该融合蛋白表达水平显著提高,占总蛋白的 2 5 . 2 %。表达的包涵体经 1 %TritonX 1 0 0洗涤后溶于8mol L尿素,在变性条件下采用金属螯合层析进行纯化,所得融合蛋白纯度大于 95 %。     

重组人白细胞介素-6的纯化

重组人白细胞介素－６（ｒｈＩＬ－６）在工程菌ｐＢＶ２２０／ｒｈＩＬ－６／ＤＨ５ａ中以包涵体形式高效表达。ｒｈＩＬ－６经过工程菌体破碎、包涵体分离及抽提、复性、色谱分离后得到高度纯化。纯化产物纯度９５％,具有良好的生物学活性     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的克隆与表达

目的:构建人IL-10原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法:应用RT-PCR技术从ConA诱导的单核细胞中扩增出IL-10成熟肽cDNA片段,将其克隆到PGEM-T后载体测序,双酶切回收目的片段构建IL-10原核表达载体PET28a-IL10。PET28a-IL10转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后对其表达产物进行SDS-Page和Western Blot分析。结果:SDS-Page电泳显示IL-10在大肠杆菌中得到了表达,分子量为21000,Western Blot分析显示表达产物可于IL-10多抗特异反应。结论:IL-10在大肠杆菌中成功表达,具有免疫原性。为其进一步生物学研究奠定了基础。     

羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、表达产物纯化及生物活性

 Neurturin (NTN)是新近发现的一种神经营养因子 ,是 GDNF家族的成员之一 .将 5′端引入了羟胺切割位点的 h NTN基因克隆到硫氧还蛋白融合表达载体 p Thio His A,在宿主菌 BL2 1中获得了稳定、高效表达 ,表达产物以包涵体形式存在 .在变性条件下经羟胺切割、柱层析纯化后复性 ,获得纯度达 90 %以上的 rh NTN.经鸡胚背根神经节 (DRG)培养法测定具有生物学活性 .     

Production of human prolyl 4-hydroxylase in Escherichia coli

Prolyl 4-hydroxylase (P4H) catalyzes the post-translational hydroxylation of proline residues in collagen strands. The enzyme is an alpha2beta2 tetramer in which the alpha subunits contain the catalytic active sites and the beta subunits (protein disulfide isomerase) maintain the alpha subunits in a soluble and active conformation. Heterologous production of the native alpha2beta2 tetramer is challenging and had not been reported previously in a prokaryotic system. Here, we describe the production of active human P4H tetramer in Escherichia coli from a single bicistronic vector. P4H production requires the relatively oxidizing cytosol of Origami B(DE3) cells. Induction of the wild-type alpha(I) cDNA in these cells leads to the production of a truncated alpha subunit (residues 235-534), which assembles with the beta subunit. This truncated P4H is an active enzyme, but has a high Km value for long substrates. Replacing the Met235 codon with one for leucine removes an alternative start codon and enables production of full-length alpha subunit and assembly of the native alpha2beta2 tetramer in E. coli cells to yield 2 mg of purified P4H per liter of culture (0.2 mg/g of cell paste). We also report a direct, automated assay of proline hydroxylation using high-performance liquid chromatography. We anticipate that these advances will facilitate structure-function analyses of P4H.     

人白细胞介素11 cDNA的克隆、融合表达及活性测定

取人胎肺做原代培养细胞,ＰＭＡ诱导后,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,扩增出去了Ｎ端信号肽序列的ＩＬ１１ｃＤＮＡ,经序列分析表明,该序列与文献报道序列高度同源,仅３个核苷酸有变化,氨基酸序列一致。将此ＩＬ－１１ｃＤＮＡ克隆人硫氧还蛋白基因融合表达载体ｐＴＲＸＦＵＳ的ｔｒｘＡ基因３‘末端,利用其３’端的蛋白肠激酶切点。构建符合读码框的融合基因。该融合蛋白在大肠杆菌中表达量法２０％以上。用ＩＬ－６依赖细胞株７Ｔ     

共表达TrxA和DsbC对富含二硫键的异源蛋白在大肠杆菌中表达的影响

以复制子为p15A的质粒pACU184为基础 ,构建了 3种表达硫氧还蛋白 (TrxA)或 和二硫键异构酶 (DsbC)的表达质粒 .经IPTG诱导 ,克隆的DsbC和TrxA都以可溶的形式高表达 .分别将构建的 3种表达质粒与复制子为colE1并克隆有人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶融合基因 (C6 UK)的表达质粒共转化大肠杆菌XL1 blue ,在 30℃用IPTG诱导表达 .SDS PAGE显示 ,共表达TrxA或DsbC都能导致C6 UK融合蛋白的部分可溶性表达 ,而且同时共表达TrxA和DsbC 2种分子时 ,C6 UK完全以可溶形式表达 ,但表达量降低 .分别用溶圈法和ELISA检测了各种共表达时可溶表达产物的生物活性 .结果显示 ,只有共表达DsbC时才能检测到明显的C6 UK融合蛋白的双功能     

用质粒pUC18在大肠杆菌中表达人蛋白质二硫键异构酶

 用质粒ｐＵＣ１８在大肠杆菌中表达人蛋白质二硫键异构酶高音,王志珍（中国科学院生物物理研究所,生物大分子国家重点实验室,北京１００１０１）蛋白质二硫键异构酶（ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ,ＰＤＩ）催化蛋白质分子内天然二硫键的形成,...     

人白细胞介素11融合蛋白切割位点的改变及成熟蛋白的纯化

将 h IL- 1 1 c DNA克隆入硫氧还蛋白基因融合表达载体 p TRXFUS的 trx A基因 3′末端 ,构建符合读码框的融合基因 ,并在两基因间改变原有的肠激酶切割位点 ,引入蛋白质的羟胺切割位点序列 ,该融合蛋白在大肠杆菌中表达量达 2 0 %以上 .经羟胺切割 ,柱层析等纯化步骤后 ,得到纯度98%以上的成熟 h IL - 1 1 .用 IL- 6依赖细胞株 7TDI及 MTT法测定生物学活性 ,比活达 8× 1 0 6 IU/mg.并对纯品进行了 Western blot,N端 1 5个氨基酸测序及 h IL- 1 1氨基酸组成等分析和鉴定