连续3步缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人溶菌酶杂合基因座

目的:构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列在乳腺内特异性高效表达的mWAP-hLYZ杂合基因座,实现人溶菌酶的高效表达。方法:采用连续3步缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂序列,构成能够连续进行3次缺口修复的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法:第一步,从含mWAP基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆8 kb的mWAP基因3’端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从含hLYZ基因的BAC上亚克隆5 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLYZ基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆9kb的mWAP基因5’端完整侧翼序列,并使上述3个片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起。结果:构建了全长约22 kb的mWAP-hLYZ杂合基因座,经PCR扩增、限制性内切酶酶切和序列测定验证,构建的杂合基因座达到原mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)完全被hLYZ基因组序列精确置换的目的。结论:通过连续3步缺口修复构建杂合mWAP-hLYZ基因座乳腺表达载体,为乳腺生物反应器高效表达人溶菌酶提供了可行的思路和方法。     

连续3步缺口修复构建人β肌动蛋白-人凝血因子Ⅶ杂合基因座

目的:为了获得稳定高效表达凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞株,构建一个利用人β肌动蛋白(hACTB)基因座完整的上下游调控序列指导人凝血因子Ⅶ(hFⅦ)基因组序列在人胚胎肾细胞特异性高效表达的hACTB-hFⅦ杂合基因座。方法:采用3步连续缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂,构成能进行3次连续基因抓捕的载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术:第一步,从含hACTB基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆10 kb的hACTB基因3′端完整侧翼序列;第二步,从hFⅦBAC上亚克隆13 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAG)的hFⅦ基因组序列;第三步,从hACTB BAC上亚克隆20kb的hACTB基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成全长约50 kb的hACTB-hFⅦ杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座达到了原来hACTB基因座中hACTB基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ从起始密码子到终止密码子的基因组序列基因组序列精确置换的目的。结论:连续3步缺口修复构建杂合基因座细胞表达载体的技术,将为细胞高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。     

连续三步‘Gap-repair’构建小鼠WAP—人LF杂合基因座

为了构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人乳铁蛋白(hLF)基因组序列在乳腺特异性高效表达的mWAP-hLF杂合基因座,我们采用了连续三步‘Gap-repair'的方法.首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体.然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的gap-repair技术,第一步从含mWAP基因座的细菌人工染色体(mWAP BAC)上亚克隆了8 kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从hLF BAC上亚克隆29 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLF基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆12 kb的mWAP基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个全长约49 kb的mWAP.hLF杂合基因座.经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,我们构建的这个杂合基因座,达到了原来mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hLF基因组序列精确置换的目的.这种连续三步gap-repair构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,将为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法.     

连续3步缺口修复技术构建牛αS1酪蛋白-人溶菌酶杂合基因座

目的:构建一个牛αS1酪蛋白调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基组序列的杂合基座.方法:采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术.将6个无痕连接的同臂插入以 pBR322为载体的骨架中,构成能进行3次连续基抓捕的载体,利用 Red 同重组系统介导的缺口修复技术,分别抓捕牛αS1酪蛋白3'端调控序列(9 kb)、hLYZ 基座序列(5 kb)、牛αS1酪蛋白5'端调控序列(20 kb),使这3个基片段自动无痕地连接在基抓捕载体上,形成牛αS1酪蛋白-hLYZ 杂合基座.结果:实验经过 PCR 扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定,验证了 hLYZ 的基组序列对牛αS1酪蛋白编码基组序列的精确置换.结论:这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法.     

连续3步基因抓捕构建牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座

目的:构建一个利用牛αS1酪蛋白基因座完整的上下游调控序列指导人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因组序列在乳腺特异性高效表达的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。方法:采用连续3步基因抓捕的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行3次基因抓捕的抓捕载体;然后,在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,第一步从含牛αS1酪蛋白基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆9 kb的牛αS1酪蛋白基因3'端侧翼序列到抓捕载体上,第二步从人tPA BAC上亚克隆17 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)的人tPA基因组序列,第三步从牛αS1酪蛋白BAC上亚克隆20 kb的牛αS1酪蛋白基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个长约46kb的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座中,原牛αS1酪蛋白基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被人tPA基因组序列精确置换。结论:连续三步基因抓捕构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了探索性研究。     

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）突变体（2Gly-hGLP-1）与人血清白蛋白（HSA）的融合蛋白。方法：为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸（Ala）定点突变为甘氨酸（Gly）,根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果：融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论：在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。     

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化

将含编码HSA天然信号肽、HSA和新型集成干扰素(NIFN)的融合基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC3.5,转染毕赤酵母GS115,用于分泌表达融合蛋白HSA-NIFN的酵母工程菌。诱导表达后,产物经SDS-PAGE、Western blot和MALDI-TOF-MS分析表明该蛋白分子量为86369Da,且能被抗HSA单抗特异性结合;表达的HSA-NIFN经超滤、Blue亲和层析和CM阳离子交换层析纯化后,HSA-NIFN的纯度大于95%。用细胞病变抑制法测定其比活性为7.75±0.39×106IU/mg。     

生长激素释放激素和人血清白蛋白融合蛋白的克隆表达

目的:通过与人血清白蛋白(HSA)融合,延长生长激素释放激素(GHRH)在体内的半衰期。方法:根据毕赤酵母偏爱密码子重新设计GHRH的核酸序列,并通过化学合成和重叠PCR法将GHRH的N端与HSA的C端通过一个11肽的接头连接,获得GHRH和HSA融合的全长基因序列。构建pPIC9-HSA-GHRH表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:克隆了HSA-GHRH融合基因,构建了pPIC9-HSA-GHRH融合表达载体;电击转化后通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌;经分离纯化后,对表达产物的生物学活性分析显示其在体内有促进生长的作用。结论:与人血清白蛋白的融合有效地提高了GHRH的表达水平,并延长了GHRH的半衰期。     

氨甲喋呤-人血清白蛋白-单抗79结合物的制备及其体外细胞毒作用

 本研究采用间接连接法,应用异型双功能连接剂SPDP,形成以酰胺键和二硫键连接的氮甲喋吟-人血清白蛋白-单抗79(MTX-HSA-McAb79)结合物。其中McAb79与HSA克分子比有效地控制在1:1～2,且结合物的纯度及产率均较高,有一定的制备价值。 对靶细胞Nalm-6的体外细胞毒试验结果表明:MTX-HSA-McAb 79的杀伤活性显著强于MTX-HSA-nIgG,但较游离MTX的杀伤活性为弱。且MTX-HSA-McAb 79的杀伤作用依赖于McAb 79与靶抗原CALLA的抗原抗体反应。     

水稻抗白叶枯病基因Xa4位点跨叠BAC克隆群的构建

水稻白叶枯病抗性基因Xa4已被定位于第11染色体长臂末端的分子标记VG181和L1044之间,并与抗性基因同源序列片段RS13共分离。利用这3个标记筛选IRBB56的BAC文库,共得到128个阳性BAC克隆,其中RS13获得18个阳性克隆,这18个克隆中有4个和6个我隆分别同时为G181和L1044的阳性克隆,选其中的12克隆进行分析,构建了一个从G181到L1044区间的BAC跨叠克隆,全长420kb,并且56M22、106P13和104B153个BAC克隆可覆盖整个跨叠克隆群。这一研究结果为进一步分离Xa4基因打下基础。     

A Probasin‐MerCreMer BAC allows inducible recombination in the mouse prostate

Tissue‐specific transgene expression in the prostate epithelium has previously been achieved using short prostate‐specific promoters, rendering transgenic mouse lines susceptible to integration site‐dependent effects. Here we demonstrate the applicability of bacterial artificial chromosome (BAC) technology to transgene expression in the prostate epithelium. We present mouse lines expressing an inducible Cre protein (MerCreMer) under the control of regulatory elements of the probasin gene on a BAC. These mouse lines show high organ specificity, high transgene expression in anterior, dorsal and lateral prostate lobes, no background Cre recombination using a reporter strain and adjustable amounts of Cre‐induced recombination upon tamoxifen induction. Together with two recently reported transgenic lines expressing the Cre‐ERT2 protein from small prostate‐specific promoters, these mouse lines will be useful in research focused on prostate‐specific disorders such as benign hyperplasia or cancer. genesis 47:757–764, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.     

利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除

目的:探索通过细菌人工染色体(BAC)同源重组系统构建条件基因敲除载体的高效率方法,提高条件基因敲除小鼠(Flox小鼠)的构建效率。方法:利用作者自己构建的噬菌体重组酶系统,通过BAC同源重组进行条件型基因敲除载体构建工作。首先通过亚克隆构建了一系列载体含有同源臂的靶向质粒,线性化后,打靶片段经电穿孔法转入大肠杆菌内,与相应的BAC同源重组,再经过三步同源重组和一步位点特异性重组,构建小鼠条件型基因敲除载体。结果:高效率构建了小鼠基因的最终条件基因敲除载体。结论:通过BAC同源重组高效构建条件基因敲除载体,为条件基因敲除载体的构建提供了全新思路,并为FLox小鼠的建立,及相应基因在发育、生理、致病机制等方面的功能研究奠定了基础。     

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.     

Human herpesvirus 6A U27 plays an essential role for the virus propagation

Human herpesvirus 6A (HHV-6A) is a member of the genus Roseolovirus and the subfamily Betaherpesvirinae. It is similar to and human cytomegalovirus (HCMV). HHV-6A encodes a 41 kDa nuclear phosphoprotein, U27, which acts as a processivity factor in the replication of the viral DNA. HHV-6A U27 has 43% amino acid sequence homology with HCMV UL44, which is important for DNA replication. A previous study on HHV-6A U27 revealed that it greatly increases the in vitro DNA synthesis activity of HHV-6A DNA polymerase. However, the role of U27 during the HHV-6A virus replication process remains unclear. In this study, we constructed a U27-deficient HHV-6A mutant (HHV-6ABACU27mut) with a frameshift insertion at the U27 gene using an HHV-6A bacterial artificial chromosome (BAC) system. Viral reconstitution from the mutant BAC DNA was not detected, in contrast to the wild type and the revertant from the U27 mutant. This suggests that U27 plays a critical role in the life cycle of HHV-6A.