小鼠CDC26基因短发夹RNA重组腺病毒载体的构建与表达分析

目的:构建靶向CDC26基因的短发夹RNA(shRNA)重组腺病毒载体,干扰小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中CDC26的表达。方法:设计小鼠靶向CDC26基因的shRNA,插入穿梭质粒pENTRY-EF1a-EGFP-Mir30,通过Gateway系统获得重组腺病毒载体pAd-CDC26-shRNA;线性化后转染HEK293A细胞,进行病毒包装;用包装的重组腺病毒感染MEF,24 h后收集细胞,提取总RNA,逆转录后用荧光定量PCR法检测MEF内CDC26 mRNA的变化,以检测所设计shRNA的敲低效率。结果:构建的重组腺病毒载体pAd-CDC26-shRNA经酶切鉴定后正确;转染HEK293A细胞后8 d,观察到细胞病变及GFP的大量表达,表明重组腺病毒包装成功;感染MEF后,实时荧光定量PCR检测表明,细胞内CDC26 mRNA的水平较对照组敲低了73.14%,腺病毒注射7 d后,注射CDC26 shRNA的小鼠血糖较对照组明显降低。结论:构建了具有较高敲低效果的小鼠CDC26基因shRNA重组腺病毒,并且具有体内活性。     

敲低CTCF腺病毒表达载体的构建及效果检测

目的:获得敲低效果较好的CCCTC结合因子(CTCF)的RNA干扰腺病毒载体,以便于研究其在肿瘤发生发展中的作用。方法:从已发表文献中获得CTCF敲低靶序列,合成2对含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其进行退火磷酸化后,分别克隆到腺病毒包装载体上;将重组质粒转染人胚肾293A细胞,收获腺病毒;将收获的腺病毒分别感染人胚肾HEK293细胞和靶细胞人肺腺癌细胞A549,通过RT-PCR和Western印迹鉴定相关基因的表达变化。结果与结论:RT-PCR和Western印迹鉴定显示构建的表达CTCF短发夹RNA(shRNA)的腺病毒载体能够有效抑制CTCF转录和蛋白水平,为后续CTCF的生物学功能和机制研究奠定了基础。     

针对Oct-4和Survivin基因的双靶向shRNA腺病毒载体的构建及其对肝癌细胞的抑制作用

转录因子Oct-4和Survivin是细胞增殖的关键调控因子,构建针对Oct-4和Survivin基因的双靶向shRNA腺病毒载体Ad5-Dual-shRNA,并研究其对肝癌细胞及移植瘤的生长抑制作用。合成Oct-4和Survivin基因的shRNA序列,插入腺病毒穿梭载体pDC312,含有shRNA的穿梭载体与腺病毒骨架载体pBHGloxdeltaE13Cre共转染HEK293细胞,经Cre/LoxP位点特异性重组获得重组腺病毒Ad5-Dual-shRNA;腺病毒Ad5-Dual-shRNA感染肝癌细胞系EHBH-H1,经Western blotting检测Oct-4和Survivin基因的表达情况,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐染色法(MTT实验)和裸鼠荷瘤实验检测对肿瘤细胞生长的影响。研究结果显示,双靶向重组腺病毒Ad5-Dual-shRNA感染肝癌细胞系EHBH-H1能够有效沉默Oct-4与Survivin基因的表达,并且在MTT实验和裸鼠荷瘤试验中都显示出较单一靶向的shRNA腺病毒载体Ad5-Surv-shRNA、Ad5-Oct4-shRNA具有更为明显的肿瘤细胞生长抑制作用。实验结果表明,特异性双靶向shRNA腺病毒载体Ad5-Dual-shRNA是一种更为高效的靶向肿瘤基因治疗载体。     

shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1LTR相关宿主因子

构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子.方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞.结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子.结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段.     

表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体并鉴定.方法:采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-SEA.将鉴定正确的pCA13-SEA与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-SEA.Ad-SEA在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度.结果:经PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,SEA基因成功克隆到溶瘤腺病毒载体中,可实现SEA基因的表达.结论:成功构建了表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体,为进一步研究该病毒对膀胱肿瘤靶向治疗的作用奠定了基础.     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

核转录因子TR3小干扰RNA载体的构建及其效果鉴定

目的：构建核孤儿受体TR3的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并进行沉默效果测定。方法：根据TR3 mRNA序列和载体psiSTRIKE的粘性末端,设计合成TR3的干扰RNA序列,退火后克隆至psiSTRIKE,经测序鉴定后用阳离子脂质体将重组子和TR3高表达载体TR3-pcDNA共转染至HEK293细胞中,以Western blotting检测干扰后HEK293细胞内TR3表达的变化。结果：Western blotting检测结果证实构建的TR3 siRNA表达重组载体可显著抑制HEK293细胞内TR3的高表达。结论：构建了核孤儿受体TR3 siRNA真核表达载体。     

RNA干扰USE1基因慢病毒载体的构建及鉴定

旨在构建泛素结合酶USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,并在细胞中检测该基因的抑制表达水平,以期寻找Uba6-USE1特异性泛素化通路对应的下游底物并研究其功能。选取并合成靶向USE1基因的特异性shRNA序列,将其克隆至pLL3.7慢病毒抑制表达载体上,构建抑制USE1基因表达的重组慢病毒质粒并鉴定。将鉴定成功的重组质粒与psPAX2、VSVG慢病毒包装载体共转染至HEK-293细胞,收集病毒上清,测定病毒滴度并确定最佳感染稀释倍数,通过qPCR和Western Blot方法检测病毒感染HEK-293细胞后对USE1基因的抑制程度,获得能有效抑制USE1基因的慢病毒上清。结果显示,成功构建3种靶向USE1基因的RNA干扰慢病毒载体,获得滴度符合要求的3种慢病毒包装上清液,感染HEK-293细胞后发现,第2、3号shRNA序列均有明显抑制表达USE1基因效果,基因表达抑制率约50%(*P0.05)。利用RNA干扰技术成功构建了特异性抑制泛素结合酶USE1基因表达的慢病毒载体,并经mRNA和蛋白水平检验得到2种能够显著抑制USE1表达的慢病毒上清及其shRNA序列。     

MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定

目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果成功构建了MKRN1的siR-NA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性。结论构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具。     

汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达

本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。     

SOCS3基因重组腺病毒的构建及其在猪脂肪细胞中的表达

本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的重组腺病毒表达载体,获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经测序验证后,重组的穿梭质粒用PmeI酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得的重组质粒pAd-SOCS3,经PacI线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增,纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确,病毒滴度为1.2×109PFU/mL;感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒,感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。     

携带siSPK1重组腺病毒的构建及其对N2a细胞凋亡的影响

应用AdMax腺病毒载体系统构建携带siSPK1基因的重组腺病毒,进一步研究SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。设计可形成小发夹结构的SPK1-siRNA模板cDNA序列,克隆至质粒pDC316-siRNA,构建SPK1-siRNA穿梭质粒pDC316-SPK1,经鉴定正确后,将pDC316-SPK1与辅助包装质粒（pBHG loxΔE1,3 Cre）共转染至HEK293细胞,包装纯化并扩增重组腺病毒颗粒,终点稀释法测定病毒滴度;病毒感染N2a细胞,Western blot法检测SPK1蛋白的表达;Hoechst33258染色检测SPK1基因对N2a细胞凋亡的影响。酶切后PCR分析、测序鉴定表明,pDC316-SPK1构建成功,病毒纯化后滴度为2.50E＋10 PFU/mL;重组病毒可在蛋白水平抑制SPK1的表达;SPK1基因抑制后,N2a细胞凋亡增加（P〈0.001）。上述结果表明,含有SPK1-siRNA的重组腺病毒构建成功,且具有抑制SPK1蛋白表达的功能,该基因沉默后,N2a细胞凋亡增加。     

人CXCL9重组腺病毒的制备及其表达产物生物活性检测

目的构建携带人CXCL9基因的重组腺病毒,分析其表达产物的生物学活性。方法采用PCR法从pBLAST2-hCXCL9质粒上扩增出hCXCL9基因,再将其克隆至pENTR11载体上,构建pENTR11-hCXCL9质粒,通过同源重组将hCXCL9基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后在293A细胞内进行包装、扩增后得到携带hCX-CL9基因的重组腺病毒。用包装好的病毒感染Hela细胞,分析目的基因的表达及其生物学活性。结果成功地将hCXCL9基因片段克隆至重组腺病毒载体上,并经293A细胞包装出病毒颗粒。该病毒感染Hela细胞后,可在培养上清液中检测到显著表达的hCXCL9。通过趋化活性分析发现,该表达产物对T淋巴细胞具有明显的趋化活性。结论成功构建了hCXCL9重组腺病毒,并可在体外高效表达具有生物活性的目的产物。     

Preparation of isotopically labelled recombinant β-defensin for NMR studies

Apoptosis is a major problem in animal cell cultures during production of biopharmaceuticals, such as recombinant proteins or viral vectors. A 293 cell line constitutively expressing vMIA (viral mitochondria-localized inhibitor of apoptosis) was constructed and examined on production of a model recombinant protein, green fluorescent protein (GFP) in the adenovirus-293 expression system, and on production of a model infectious adenoviral vector. vMIA-293 cells were more resistant than the parental 293 cells to apoptosis induced by either oxidative stress, or by adenovirus infection. The yield of GFP produced in vMIA-293 cell cultures was consistently higher (140%) compared to that in the parental cells. vMIA reduced production of adenovirus infectious particles, which was not due to a decline of adenovirus replication, since adenoviral DNA replication rate in vMIA-293 cells was higher than that in the parental cells.In conclusion, introduction of the vMIA gene into the 293 cell line is a promising strategy to improve recombinant protein production in the adenovirus-293 expression system.     

MKK6重组腺病毒的构建与制备

构建腺病毒穿梭载体pAd RSV ,并将p3 8MAPK (mitogen activatedproteinkinase)的上游激酶MKK6(mitogen activatedproteinkinasekinase 6)及其持续激活和无活性的突变体基因亚克隆到该穿梭载体 .通过与腺病毒DNA(pJM17)在能够表达E1的HEK 2 93细胞同源重组生成了能够表达MKK6信号分子的重组腺病毒 .PCR结果表明 ,这些重组腺病毒DNA的插入片段大小是正确的 .而且 ,通过感染COS 7细胞 ,用免疫激酶活性测定证实这些重组的腺病毒能够表达具有功能的蛋白质 .     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P1—2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy—1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv—p12x3c和pAdcmy—p12x3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24～48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行。PCR和RT—PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

shRNA慢病毒表达载体对肝癌细胞HepG2中CXCR7表达的影响

目的:探讨趋化因子受体7(Chemokine receptor7,CXCR7)的短发夹RNA(a small hairpin Ribonucleic acid,shRNA)慢病毒表达载体对人肝癌细胞HepG2中CXCR7表达的影响.方法:合成4个针对CXCR7靶基因序列的shRNA,分别与Age Ⅰ和EcoRl酶切后的pGCSIL-RFP载体连接,构建CXCR7的shRNA慢病毒表达载体pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA;构建含有CXCR7互补DNA(complementary DNA,cDNA)的真核过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-CXCR7,与pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA共转染HEK293T细胞,筛选具有显著敲减作用的CXCR7-shRNA;将具有显著敲减作用的pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA与慢病毒包装质粒共转染人胚肾细胞(Human embryonic kidney cells,HEK293T)产生慢病毒颗粒LV-CXCR7-shRNA,并将纯化的慢病毒颗粒感染人肝癌HepG2细胞,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)分别检测CXCR7信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的沉默效果.结果:聚合酶链反应(Polymerasechain reaction,PCR)鉴定及测序结果表明成功构建4个CXCR7的shRNA慢病毒表达载体,并筛选出具有显著敲减作用的pGCSIL-RFP-CXCR7-shRNA2;包装含有CXCR7一shRNA2的慢病毒颗粒LV-CXCR7-shRNA2(病毒滴度为3x 109TU/ml),感染HepG2细胞,CXCR7mRNA和蛋白的表达水平下调.结论:成功构建靶向CXCR7基因的shRNA慢病毒表达载体,可有效抑制人肝癌HepG2细胞CXCR7 mRNA和蛋白的表达.