O-GlcNAcase抗原片段的选择、优化表达和多克隆抗体的制备

为了探讨O-GlcNAc修饰的生物学作用和相关疾病的发病机理,需制备高效、专一的O-GlcNAcase (OGA) 抗体。通过对人源OGA蛋白进行序列分析发现,氨基端1~350 aa片段 (sOGA) 抗原性和亲水性较强,将该片段构建至原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行诱导表达,通过优化IPTG浓度 (0.05 mmol/L) 和诱导时间 (10 h) 获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小 (45 kDa) 和纯度 (95％以上)。以4-MU-O-GlcNAc为荧光底物,检测到sOGA的糖苷酶活性为106 nmol/(min·mg),表明该片段是OGA糖苷酶的活性区域。以此片段作为抗原免疫新西兰大白兔,以CNBr活化Sepharose 4B微珠纯化抗血清制备OGA特异性多克隆抗体。Western blotting和ELISA检测表明,该抗体可以特异识别含有OGA糖苷酶活性区域的多种变体,检测灵敏度为0.11 ng/mL (效价为1∶80 000),可应用于O-GlcNAcase生物功能研究。     

日本蟳高血糖激素基因的克隆与表达分析

通过RACE技术克隆获得日本蟳Charybdis japonica高血糖激素基因（CjCHH）全长cDNA序列;运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析该基因的组织差异性表达;利用原核表达技术获得CjCHH重组蛋白。序列分析表明：CjCHH cDNA全长1754 bp,包含111bp的5’末端非编码区（UTR）,423 bp的开放阅读框（ORF）,以及1236 bp的3’UTR,该基因可编码140个氨基酸。序列比对结果显示：CjCHH的成熟肽序列与其它甲壳动物CHH的一致性为41%~88%。系统进化树显示：CjCHH与其它梭子蟹科的CHH聚在一起,这与日本蟳所处的分类地位一致。组织差异性表达研究显示：CjCHH在检测的10个组织中均有表达,其中眼柄中表达量最高,肠和Y-器次之,其余组织表达量较低。成功构建了CjCHH重组表达质粒pET-CHH,并在大肠杆菌（Escherichia coli）中获得了高效表达,重组蛋白的相对分子量约11 kDa,与预测的相对分子质量大小相一致,表达水平在5 h的IPTG诱导过程中呈现上升趋势。     

柞蚕14-3-3基因的鉴定及表达分析

14-3-3蛋白是一种可以改变其结合蛋白构象的酸性蛋白质.柞蚕14-3-3 cDNA序列全长1 220 bp,包括一个126 bp的5'非编码区和一个350 bp的3'非编码区.该基因的开放读码框长度为744 bp,编码247个氨基酸.序列比对结果表明,柞蚕14-3-3蛋白与家蚕的14-3-3蛋白具有高度同源性.此外对柞蚕14-3-3基因进行了原核表达和重组蛋白纯化.SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,分子量大小约32 kD的重组蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

重金属胁迫下稀有鲫抑制消减杂交文库的筛选与分析

重金属包括镉和铅等污染严重威胁人类健康。为从基因水平研究鱼类应答重金属胁迫的分子机理,本研究利用抑制消减杂交技术构建稀有鲫Gobiocypris rarus对镉处理反应的正、反向抑制消减文库。文库质量检测表明消减效率达210倍,通过对正、反向文库中部分表达序列标签进行序列测定,获得9条表达丰度较高的表达序列标签,平均长度为438 bp。利用快速扩增c DNA末端技术克隆获得核糖体蛋白s18(Rps18)基因的完整编码区,序列长度为525 bp,其中编码区459 bp,编码152个氨基酸,3’非翻译区38 bp,5’非翻译区28 bp。并利用实时荧光定量技术对Rps18基因在铅胁迫下的表达谱进行了研究,结果表明稀有鲫肝组织中Rps18基因的表达量变化较明显。     

海洋链霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023来源多功能几丁质酶的克隆、表达及鉴定(英文)

碳水化合物水解酶家族在自然界碳素循环及农业废弃物中几丁质、纤维素等碳水化合物的生物质转化利用中发挥了重要作用。通过PCR技术从海洋链霉菌Streptomyces olivaceus strain FXJ 7.023的fosmid基因组文库中成功克隆得到1个全长885bp的编码295个氨基酸残基的包含1个19个氨基酸残基的N-末端信号肽的壳聚糖酶完全编码区。系统进化分析表明该基因编码蛋白与已报道的Streptomyces sp.SirexAA-E来源壳聚糖酶csnA同源性为71%,与Streptomyces coelicolor A3(2)来源的csn46A同源性为70%。将该编码区重组入原核表达质粒载体pET32a并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plysS,添加IPTG在18℃条件下振荡诱导该蛋白表达,Ni2+-NTA亲和纯化获得分子量为50.3 kDa融合表达蛋白TrxA-SoCsn。该融合重组蛋白在最适反应条件下对底物胶体壳聚糖和羧甲基纤维素的最大酶活分别为3.673U/mg和1.302U/mg,最适反应温度分别为37℃和50℃,最适反应pH分别为pH5.0和pH6.0。TrxA-SoCsn相关的研究结果表明该酶在农业废弃物生物质转化等方面具有一定的应用潜力。     

一个新的二色补血草金属硫蛋白基因LbMT2的克隆及其表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个新的金属硫蛋白基因LbMT2全长cDNA序列。该基因全长518 bp, 其中5′非翻译区(UTR)64 bp, 3′非翻译区205 bp, 开放阅读框(ORF)249 bp, 编码由82个氨基酸组成的蛋白质, 编码蛋白的分子量为8.1 kDa, 理论等电点(pI)为4.72。利用实时定量PCR方法研究了二色补血草在CuSO4、CdCl2、NaCl、低温和PEG胁迫下不同时间该基因的表达模式。结果表明, CuSO4、CdCl2、NaCl和低温处理均能诱导LbMT2基因在二色补血草的根和叶中的表达, 而PEG处理则抑制了LbMT2在根和叶中的表达。构建LbMT2基因的原核表达载体pGEX-LbMT2, 通过IPTG诱导在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中融合表达, SDS-PAGE 电泳获得35 kDa 的蛋白条带, 大小与预期相符。     

银鲫apelin基因的克隆、组织表达谱和摄食关系的初步研究

apelin是一种参与哺乳动物和鱼类摄食调控的重要神经肽。为了更好地研究apelin在银鲫(Carassius auratus gibelio)上的摄食调控作用,本试验采用RACE技术首次获得了银鲫apelin的cDNA全长序列,并通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了apelin基因在各组织的表达情况以及餐前餐后和禁食对其表达量的影响。结果显示银鲫apelin全长cDNA序列长度为1082 bp,其中5’非编码区(5’-UTR)的长度为114 bp,3’非编码区(3’-UTR)的长度为734 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)的长度为234 bp。银鲫apelin基因的ORF区编码77个氨基酸,前22个氨基酸为信号肽。apelin基因在银鲫21个组织中普遍表达,特别是在下丘脑中表达量最高。在餐前餐后的试验中,银鲫下丘脑apelin基因在餐后表达量显著下降(p<0.05);在禁食试验中,禁食组下丘脑apelin基因的表达量在第5天显著升高(p<0.05),第7天极显著升高(p<0.01),复投喂后,apelin基因的表达量在第9天、第11天、第14天极显著降低(p<0.01)。综上所述,apelin基因可能是银鲫的诱食因子,在其摄食调控起到一定的作用。     

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术首次从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT1(GenBank登录号为FJ848871).研究结果表明:GhCCoAOMT1基因cDNA全长960 bp,具有一个753 bp的开放阅读框,5'非编码区为9 bp,3'非编码区为198 bp,编码250个氨基酸,预测分子量约为28.306 kDa,等电点为5.39.利用PCR方法克隆了GhCCoAOMT1基因的基因组序列,长度为1 311 bp,包含5个外显子和4个内含子.氨基酸同源性分析发现,GhCCoAOMT1与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高.半定量RT-PCR检测表明,GhCCoAOMT1基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高,其次表达量依次为根>花瓣>子叶>10 d纤维>雄蕊>胚珠>叶.     

草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的克隆及异源表达

【目的】克隆草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA,证实其编码的蛋白具有漆酶活性,最终建立草菇漆酶基因的异源表达及纯化体系。【方法】利用RACE技术克隆全长cDNA序列,并利用生物信息学技术进行序列分析,在此基础上,去除全长cDNA的编码信号肽的序列并在3'端添加His-tag碱基序列,把修饰后的cDNA片段克隆到表达载体pPIC9K上,并转化到毕赤酵母GS115中进行表达,对重组蛋白利用Ni柱进行分离纯化并以ABTS底物法检测重组蛋白的漆酶活性。【结果】vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA的长度分别为1599 bp和1554 bp,且分别含有19和15个外显子;其编码的蛋白的理论分子量分别是57.3 kDa和56.3 kDa,理论等电点分别为4.73和5.62,且都属于分泌型的胞外蛋白;表达出的重组蛋白RBvvlac1和RBvvlac6,其分子量大小约为70 kDa,说明存在翻译后修饰;含有150 mmol/L咪唑的缓冲液对RBvvlac1和RBvvlac6发酵液进行洗脱所得到的蛋白溶液具有最高漆酶活性(333.17 U/L和227.63 U/L)。【结论】草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6能够编码有活性的漆酶蛋白,本研究建立的异源表达及纯化体系适用于草菇或其它漆酶基因的异源表达与纯化。     

嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus热稳定几丁质酶的克隆表达及活性研究

研究通过RT-PCR和Tail-PCR技术从嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus中克隆了一个几丁质酶同源基因。该基因全长1,253bp,包含一个由1,197个碱基构成的开放阅读框,编码398个氨基酸。序列比对分析表明,该基因编码蛋白属于糖苷水解酶18家族的几丁质酶。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体,并转化毕赤酵母。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,达到0.433g/L,酶活力为28.96U/mg,同时对表达的几丁质酶进行了纯化,SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为43.9kDa。该几丁质酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH值为8.0,70℃处理30min仍有45%的相对酶活,具有较好的热稳定性及工业应用价值。     

多发性骨髓瘤细胞株ARH-77L1逆转录酶基因的克隆及体外表达研究

通过菌落原位分子杂交,从多发性骨髓瘤细胞株ARH-77 cDNA文库获得L1逆转录酶基因5’端序列．随后使用3’RACE技术,获得L1逆转录酶基因3’端序列及poly(A)尾．生物信息学分析表明：该L1逆转录酶DNA序列有一长552bp开放性阅读框,编码184个氨基酸残基的多肽链,其相对分子质量约为21kDa．同时将编码L1逆转录酶保守区的开放性阅读框DNA片段与原核表达载体pQE30连接,得到重组原核表达质粒,利用大肠杆菌表达并获得L1逆转录酶融合蛋白．     

核糖体结合位点序列对大肠杆菌中HBcAg重组质粒表达的影响

用Bal-31外切酶调整乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因非编码区长度并克隆到质粒pKK 223-3中,获得了不同水平地表达HBcAg的重组质粒pKL系统。该系统所表达的HBcAg蛋白分子量为21000D。DNA序列分析发现高、中、低表达水平的3个重组质粒的SD序列到HBcAg基因的ATG之间的距离分别为12bp、13bp和19bp,高、低表达质粒的mRNA核糖体结合位点序列的二级结构分析显示,二者的自由能相差约3倍,且低表达质粒的mRNA的SD序列中的3个碱基及AUG中的3个碱基都参与配对,而高表达质粒只有SD序列中的2个碱基参与配对,表明SD序列到ATG的距离及mRNA的二级结构均在HBcAg的表达调控中起重要作用。     

综述: 植物蛋白O-GlcNAc糖基化及生物学功能

蛋白质的O-GlcNAc糖基化现象发现迄今已有30多年历史．动物中,O-GlcNAc糖基化在调控细胞信号转导、基因转录、表观遗传和新陈代谢等方面发挥重要作用．而植物中,O-GlcNAc糖基化在近几年才得到关注并进行初步研究．本文对植物中O-GlcNAc修饰的糖供体合成途径、O-GlcNAc修饰关键酶、O-GlcNAc修饰蛋白的检测及功能等方面的研究工作进行归纳总结,发现O-GlcNAc糖基化在植物的生长发育、激素网络调控、信号转导、植物病毒侵染等过程均发挥重要作用,为进一步研究植物中O-GlcNAc糖基化的生物学功能提供参考．     

黑曲霉木聚糖酶Xyn43A基因的克隆和生物信息学分析

[目的]克隆黑曲霉木聚糖酶(Xyn43A)基因,进一步对其进行生物信息学分析。[方法]利用3'RACE与5'RACE技术,克隆Xyn43A全长cDNA序列,扩增Xyn43A的DNA序列,并进行序列分析。[结果]cDNA全长1152bp(不含Poly(A)),包含一个957bp开放阅读框,编码信号肽19个氨基酸,成熟肽299个氨基酸,5'与3'非编码区分别为113bp、82bp。预测该蛋白相对分子量为33.47kDa,等电点为4.55。该序列含一个长度为86bp的内含子。Xyn43A为亲水性稳定蛋白,有4个N-糖基化位点,26个磷酸化位点。与GH43族木聚糖酶亲缘性较近,具有GH43族糖基水解酶典型的5叶片螺旋桨结构。[结论]克隆了一个新的木聚糖酶基因,属于GH43族糖基水解酶。     

嗜热毛壳菌纤维素酶（CBHⅡ）cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum CT2是一种土壤腐生菌,可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RACE-PCR获得嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）的编码基因(cbh2)。DNA序列分析表明cbh2的开放阅读框由1428个碱基组成,编码476个氨基酸。推断的氨基酸序列包含一个典型真菌纤维素酶的糖结合域（CBD）、催化域（CD）以及二者之间富含脯氨酸和羟基氨基酸的连接桥。根据氨基酸序列推算该酶分子量为53kD,属于糖苷水解酶第六家族,具有该家族催化保守区的典型特征。PCR扩增cbh2的成熟蛋白编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶蛋白的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.2 mg/mL。经硫酸铵沉淀、DEAESepharose Fast flow阴离子层析等步骤纯化了该重组表达蛋白。SDS-PAGE得到重组蛋白分子量为67kD,与从嗜热毛壳菌中纯化的该酶分子量一致。该重组纤维二糖水解酶作用的最适合温度50℃,最适pH4.0,在70℃的半衰期为30min,具有较好的热稳定性。     

PEG-重组酵母尿酸酶结合物的基本特性研究

重组Candida utilis尿酸酶由含PET-Uricase表达质粒的重组E.coli JM109(DE3)经乳糖诱导表达,菌体破碎后依次经过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析可以获得纯度95%的重组尿酸酶。还原性SDS-PAGE和HPLC测得其亚基表观分子量和天然分子量分别约为33 kDa和130 kDa。获得的纯酶与20 kDa (mPEG)2 -Lys-NHS在特定的条件下反应合成PEG-重组酵母尿酸酶结合物,考察了重组酵母尿酸酶PEG化前后的基本性质,结果显示PEG化尿酸酶的最适pH为7.5,较修饰前下降了1个pH单位,酸碱稳定范围与修饰前类似,都在pH 6-10范围内稳定;修饰前后最适温度均为40℃,重组酵母尿酸酶的热稳定性和抗蛋白酶水解能力较PEG修饰前有较大提高;PEG化尿酸酶可保留修饰前酶活力的87.5%;在最适条件下,PEG-尿酸酶结合物的Km为3.57×10-5 mol/L,而修饰前测得的Km为3.91×10-5 mol/L。研究结果为深入探讨PEG化尿酸酶的结构与功能奠定了基础。     

球孢白僵菌热休克蛋白基因Bbhsp70的cDNA及上游序列克隆与分析

运用SMART RACE RT-PCR技术与DNA步移技术,首次从球孢白僵菌中克隆出完整的热休克蛋白基因Bbhsp70编码区序列及上游序列。该基因cDNA全长2405bp,5′端非翻译区171bp,3′端非翻译区263bp,开放阅读框(ORF)1971bp,编码656个氨基酸。成熟蛋白理论分子量为71.3kDa,理论等电点为4.92。上游序列长度3559bp,其中有305bp序列与cDNA序列重叠。分析表明,上游序列中没有明显的TATA-盒和CAAT-盒,但含有CCAAT-bindingfactor、GC-box等重要的转录因子结合位点,以及热激应答元件(HSE)和GATA元件等启动子顺式调控元件。     

油菜BnMKK4全长基因的克隆及表达分析

从‘陇油6号’油菜中克隆得到了一个新的BnMKK4基因的cDNA,全长1317bp,其中包括993bp的开放阅读框,159bp的5’非翻译区（5^1UTR）,165bp的3。非翻译区（3’UTR）。与拟南芥AtMKK4有很高的同源性,因此命名为BnMKK4（GenBank登录号JF268686）。该基因编码330个氨基酸的蛋白质,分子量36．5kDa,等电点为9．01。实时荧光定量PCR结果显示该基因表达受低温胁迫和盐胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫和盐胁迫的过程中发挥作用。     

牡丹PsCS基因的克隆及序列分析

以牡丹品种‘赵粉’(Paeonia suffruticosa L.cv.‘Zhao Fen’)为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹柠檬酸合成醇(citrate synthase,CS)基因cDNA全长,命名为PsCS,GenBank登录号为HQ449568.其cDNA全长1 564 bp,包含75 bp的5’非编码区、73 bp的3 '非编码区和一个长度为1 416 bp编码471个氨基酸的开放阅读框.序列比对和系统进化分析表明,PsCS与葡萄的亲缘关系最近,相似性达89.4％以上.     

链霉菌Streptom yces olivaceusFXJ7.023多功能葡糖淀粉酶SoGA的克隆、表达及鉴定

根据海洋来源链霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因组测序结果设计特异引物,通过PCR扩增获得1条全长为1 788 bp的糖苷水解酶15家族蛋白新成员完全编码区DNA片段,该片段编码1个595个氨基酸残基、分子量为66.2 k D的预测蛋白。利用基因工程技术将该片段重组入原核表达质粒p ET32a并转化宿主菌BL21(DE3)ply Ss,IPTG诱导融合蛋白表达,表达的包涵体融合蛋白经纯化、复性后利用DNS法测定其在不同温度、p H条件下催化不同底物产生还原糖的活性。结果表明,该酶能够水解纤维素、淀粉等多种底物产生还原糖活性,且对不同底物表现不同的最适p H和最适反应温度。