磷酸化蛋白质组学研究中磷酸化肽段富集与分离方法研究进展

对磷酸化蛋白质组（phosphoproteome）进行系统深入的研究依赖于高重复性和特异性的磷酸化肽段富集与分离方法。目前发展了多种不同原理的磷酸化肽段富集方法,它们往往具有不同的选择性和特异性,因此,根据不同的研究目的选择最适合的富集方法显得尤为重要。本文综述了基于亲和色谱法（affinity chromatography）、免疫沉淀法（immunoprecipitation）、化学衍生法（chemical derivatization）、色谱法（chromatography）和其他新发展方法的磷酸化肽段富集方法,详细介绍了各自的优缺点及相关的优化与改进策略。此外,还简单介绍了磷酸化肽段富集与预分方法的不同组合的研究进展。     

不同光敏剂孵育时间在白念珠菌光动力抑制效应中的实验研究

目的：通过测定5?氨基酮戊酸（5?ALA）与白念珠菌菌悬液不同孵育时间生成PpIX的水平及5?氨基酮戊酸光动力疗法（5?ALA?PDT）抑菌率,为临床选择最佳孵育时间提供理论依据。方法制备白念珠菌悬液并与ALA避光孵育,设实验组和对照组。采用激光共聚焦显微镜观察PpIX产生情况,MTT法测定ALA光动力治疗对白念珠菌生长的抑制率。结果白念珠菌菌悬液与ALA避光孵育后有荧光物质PpIX产生,孵育30 min到90 min产生的PpIX最多,120 min以后PpIX开始明显减少,对照组无荧光物质出现。结论 ALA?PDT对白念珠菌抑制效应同孵育时间密切相关。这为临床ALA?PDT治疗白念珠菌疾病提供了理论依据。     

磷酸化蛋白质组研究中的富集策略

蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程,调控着包括信号转换、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。因此,对蛋白质磷酸化修饰的分析是蛋白质组研究中的重要内容。但由于磷酸化蛋白的丰度较低,难以用质谱直接检测。为了解决这个问题,改善质谱对磷酸肽的信号响应,需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集。目前主要的富集方法包括免疫沉淀、固相金属离子亲和色谱、金属氧化物/氢氧化物亲和色谱等。     

酪氨酸磷酸化在精子获能中的作用

获能是精子发生顶体反应以及与卵子结合之前所必需的生理过程.研究发现在精子获能过程中伴随有蛋白质的磷酸化特别是酪氨酸的磷酸化.主要对酪氨酸磷酸化蛋白在精子获能过程中的作用及其存在的部位进行归纳总结,为进一步阐明精子获能分子机制奠定基础.     

Phos-tag技术在磷酸化蛋白质组学中的应用

Phos-tag是新研制出的一种对磷酸基团具有特殊亲和力的化合物。由于其对磷酸化蛋白质具有高特异性、高亲和力等特点使其迅速在磷酸化蛋白质的检测、分离和纯化等方面得到广泛的应用。本文综述了Phos-tag的化学性质、原理及其近年来在磷酸化蛋白质组学中的应用,并与传统的磷酸化蛋白质组学研究技术做了比较,对未来磷酸化蛋白质组学的研究技术作了展望。     

氨基功能化整体材料在磷酸化肽快速可控富集中的应用

针对质谱在磷酸化肽分析过程中检测灵敏度低的问题,本文在移液器吸头尖端原位制备了氨基功能化整体材料,并将其应用于磷酸化肽的快速富集.基于该材料所建立的磷酸化肽富集方法操作简便、分析时间短,并且能够有效避免富集过程中材料与溶液分离不完全所导致的样品损失等问题.而在不同组成的上样溶液条件下,氨基功能化整体材料对单磷酸化肽和多磷酸化肽表现出了不同的磷酸化肽富集选择性,因而借助于对上样溶液组成的调控,该材料可以分别实现对磷酸化肽的全富集以及对多磷酸化肽的选择性富集.     

磷酸化修饰在病理性心肌肥大中的作用

心肌肥大与高水平神经-体液因子、血流动力学超负荷、心肌细胞的损伤有关,如果病因持续存在或未及时消除,最终将演变为慢性心力衰竭。在病理性心肌肥大的发生发展过程中,磷酸化修饰可以精确地调节和改善丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、钙调磷酸酶(calcineurin,CAN)、钙调素依赖性蛋白酶Ⅱ(calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)、单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(adenosine 5-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路以及细胞自噬的稳定性和活性。本文分别总结了磷酸化修饰在病理性心肌肥大中的作用机制以及治疗或预防心肌肥大的潜在靶点,探索病理性心肌肥大中基于质谱的磷酸化蛋白质组学进展,为未来心脏病学转化研究提供参考。     

植物体内蛋白质磷酸化及其在信息传递中的作用

本文概述了蛋白质磷酸化作用及其在细胞信息传递中的作用以及目前植物体内发现的蛋白激酶类以及经受磷酸化作用的蛋白质和酶类。     

金属氧化物在磷酸化蛋白质组学研究中的应用

磷酸化肽段的高效富集是磷酸化蛋白质组学中的重要任务,通过综述纳米金属氧化物在磷酸化蛋白组学中的应用,了解磷酸化蛋白组学研究中常用的磷酸化肽段富集材料和方法.该文介绍纳米金属氧化物、核壳结构纳米磁性材料以及金属离子在磷酸化蛋白组学中的富集效果.纳米金属氧化物材料由于其特殊理化性质在富集磷酸化肽段研究中具有特异性强、选择性好特点,在磷酸化蛋白组学研究中得到了广泛应用.虽然纳米金属氧化物在磷酸化蛋白组学的研究中仍然处于起步阶段,可重复性和全面富集仍面临挑战,但是在未来的亚细胞蛋白组学和功能蛋白组学研究中,纳米金属氧化物及其衍生物仍然会起着重要作用.     

微管相关蛋白tau在动物死亡后被快速去磷酸化

tau蛋白是神经细胞中主要的微管相关蛋白, 它的异常过度磷酸化被认为是阿尔茨海默病 (AD) 致病过程中的关键因素. 由于法律、社会、家庭等诸多因素使得获取的人脑组织标本常常在死亡后2~3 h以上,因此了解死亡不同时间后tau蛋白磷酸化的改变,对研究tau蛋白的功能及在AD致病过程中作用显得十分重要. 用位点特异的、磷酸化依赖的抗tau蛋白抗体检测正常大鼠脑中tau蛋白磷酸化程度及死亡后其磷酸化的变化情况,再用非同位素的点印迹技术测定鼠脑中tau蛋白激酶、磷酸酶在不同温度下的活性. 结果发现,正常鼠脑中tau蛋白除了Ser262,Ser409,Ser422外,在Thr181,Ser199,Ser202,Thr205,Thr212,Ser214,Thr217,Ser396和Ser404存在不同程度的磷酸化,并且在死亡后3 h,出现tau的多位点的去磷酸化及tau蛋白迁移加快,6 h后更为明显,但tau蛋白水平即使在大鼠死亡后6 h,仍未见有明显的改变. 用点印迹测定蛋白激酶和磷酸酶活性结果显示,tau蛋白激酶、磷酸酶活性均有温度依赖性降低,在25℃时激酶活性降低远大于磷酸酶活性的降低,tau蛋白在死亡后的快速去磷酸化与相对高的磷酸酶作用有关.     

罗哌卡因复合舒芬太尼在潜伏期分娩镇痛中的应用效果

目的:探讨罗哌卡因复合舒芬太尼在潜伏期分娩镇痛中的应用效果。方法:择取2015年1月~2016年1月我院收治的产妇102例,随机分为A、B、C组,各组34例,A组产妇宫口开至1 cm时采取罗哌卡因复合舒芬太尼硬膜外自控分娩镇痛,B组产妇宫口开至3 cm时采取罗哌卡因复合舒芬太尼硬膜外自控分娩镇痛,C组产妇未采取分娩镇痛,比较两组第一产程潜伏期、活跃期及第二产程持续时间及宫缩时视觉模拟评分(VAS)评分,比较各组产妇出血量、新生儿体质量及胎儿娩出后1 min、5 min Apgar评分,记录各组治疗30 d后不良反应。结果:A组、B组第一产程潜伏期持续时间明显较C组延长,活跃期持续时间较C组明显缩短,差异有统计学意义(P0.05);A组产妇宫颈口开至2 cm和cm时VAS评分低于B组和C组,差异有统计学意义(P0.05);A组、B组产妇在活跃期、第二产程时VAS评分低于C组,差异有统计学意义(P0.05);各组产妇出血量、新生儿体质量、Apgar评分比较均无统计学意义(P0.05);C组抑郁症发生率均高于较A组和B组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:从产妇潜伏期开始应用罗哌卡因复合舒芬太尼进行分娩镇痛的效果较好,具有良好的应用价值。     

纳米二氧化钛对生菜的生长效应分析

为了阐明纳米二氧化钛颗粒(TiO₂NPs)对生菜(Lactuca sativa)生长的影响，采用自行设计的水培装置探究不同浓度TiO₂NPs (300~1 200 mg/L)下，生菜生长和生理生化指标的变化。结果表明，300 mg/L TiO₂NPs能促进生菜幼苗的根长、茎长、叶表面积、鲜重和干重；随着TiO₂ NPs浓度增大，生菜的生长指标呈现下降趋势，但仍优于对照组。生菜体内的抗氧化酶(SOD、POD)在低TiO₂ NPs浓度(300 mg/L)时，活性明显下降；随着TiO₂ NPs浓度增大，这两种抗氧化酶活性逐渐增强。因此，生菜对TiO₂NPs胁迫具有浓度依赖性，表现为“低促高抑”，且能够通过抗氧化酶系统来减轻TiO₂NPs伤害。     

猪源大肠杆菌(ETEC、STEC、AEEC)毒力基因及其与O抗原型的关系

[目的]揭示从我国部分地区仔猪腹泻或水肿病病猪体内分离到的300个大肠杆菌分离株所属病原型(pathotype)、毒力基因及其与O血清型的关系.[方法]O血清型采用常规的凝集试验进行测定,毒力基因采用PCR方法检测.[结果]通过对这300个分离株的O血清型及其毒素、紧密素和黏附素基因进行鉴定,结果显示除50株未定型、17株自凝外,测定出233个分离株的血清型,这些分离株覆盖了45个血清型,其中以0149、0107、0139、093和091为主,共133株,占定型菌株的57.1%;拥有est Ⅰ、estⅡ、elt、stx2e和eae A基因的菌株分别为102(34.0%)、190(63.3%)、81(27.0%)、57(19.0%)和54(18.0%)株;分离株中有51株K88基因阳性(其中菌毛表达率为100%),75株F18基因阳性(其中菌毛表达率为50.7%),在K88菌株中,0149血清型与est Ⅰ或estⅡ elt密切相关,在F18菌株中,0107血清型与est Ⅰ或estⅡ、0139血清型与stx2e紧密相关.依其毒力特征可将这些分离株分为以下6种类型:ETEC、STEC、AEEC、ETEC/STEC、AEEC/ETEC和AEEC/ETEC/STEC,分别拥有190、24、36、32、17和1个菌株,占分离株的63.3%、8.0%、12.0%、10.7%、5.7%和0.3%.通过分析这些分离株的O血清型、毒素类型和黏附素型之间的相关性:猪源ETEC以0149、0107、093和098等血清型为主,0149:K88菌株主要与estⅡ或estⅡ elt肠毒素相关,0107:F18菌株主要与estⅡ相关,093和098血清型菌株主要与estⅡ肠毒素相关;STEC菌株以0139:F18血清型为主,拥有stx2e;AEEC菌株拥有紧密素,无明显优势血清型;ETEC/STEC菌株以0107:F18和0116:F18血清型为主,主要与est Ⅰ stx2e或estⅡ stx2e密切相关,ETEC/AEEC菌株以091和0107血清型为主,全部拥有肠毒素est Ⅰ和紧密素基因.[结论]我国至少存在6种病原型的猪肠道致病性大肠杆菌,其中ETEC为我国部分地区猪大肠杆菌病的主要病原,同时其病原型日益复杂.     

过量表达苹果酸酶对E.coli FMJ39厌氧混合酸发酵的影响

为了考察苹果酸酶对厌氧混合酸发酵影响,从E.coli DH5α中PCR扩增苹果酸酶（NAD+-dependent, E.C1.1.1.38）基因sfcA,插入质粒pTrc99a构建了表达质粒pTrc99a-sfcA,有氧和厌氧的条件下,IPTG诱导在E.coli FMJ39（ldh,pfl）中均获得大量表达,从而构建和加强了一条在厌氧混合酸发酵中微弱的代谢途径。厌氧发酵结果表明,过量表达苹果酸酶会影响混合酸发酵中甲酸、乙酸、丁二酸途径。重组FMJ39甲酸和乙酸的量分别比FMJ39提高了17.58%和15.27%,丁二酸的量降低了26.87%,柠檬酸的量变化不大。证实即使pfl基因缺陷,高浓度的L-Thr和L-Ser也会诱导Tdc 操纵元把丙酮酸转化为甲酸和乙酸。实验结果为进一步改造和利用FMJ39奠定了基础。     

超声波对高电位氧化还原水灭菌效果影响的实验研究

观察超声波对高电位氧化还原水的微生物杀灭作用的影响。采用悬液法分别对高电位氧化还原水、超声波以及两者协同对微生物的杀灭效果进行检测。单独使用超声波处理10 min,对大肠杆菌的杀灭率为89.9%;单独使用高电位氧化还原水作用15 s,对大肠杆菌杀灭率为97.8%;超声波与高电位氧化还原水协同作用15 s,杀灭率为100%。单独使用超声波处理10 min、单独使用高电位氧化还原水作用1.5 min,可以将悬液内的HBsAg阳性血清的抗原性完全破坏,二者协同作用仅需30 s即可达到完全破坏。超声波对高电位氧化还原水的微生物杀灭具有明显的增效作用。     

温度对中国林蛙卵孵化和孵出热耐受性的影响

为了解中国林蛙(Rana chensinensis)卵的孵化率、发育起点温度、发育有效积温、孵化后蝌蚪的成活率和蝌蚪的热耐受性,将当天产出的中国林蛙卵采集回实验室,分别置于5个不同温度(10℃、15℃、20℃、25℃和30℃)下孵化,观察和测量记录卵的孵化率、孵化3d后蝌蚪的成活率、全长及每个温度下卵的发育历期。利用温度梯度装置观察记录孵化10d后蝌蚪的最适温度、逃避温度和致死温度。光照周期设为14L∶10D,湿度设为85%。结果表明,温度对中国林蛙卵的孵化率影响显著;孵化3d后蝌蚪的成活率随着温度的升高而降低,30℃下孵化的蝌蚪在2d之内全部死亡;温度对中国林蛙卵孵化3d后蝌蚪全长的影响极显著,蝌蚪的全长随着温度的升高而增加;应用直线回归法和直接最优化法计算中国林蛙卵的发育起点温度和有效积温,分别为0.51℃、65.29日度和0.38℃、65.52日度,直接最优化法优于直线回归法。经过4个不同温度(10℃、15℃、20℃和25℃)孵化10d后蝌蚪的最适温度分别为(13.2±1.6)℃、(15.7±1.9)℃、(17.3±2.1)℃和(19.5±2.3)℃;逃避温度分别为(28.8±1.4)℃、(30.2±1.6)℃、(31.6±1.3)℃和(33.1±1.8)℃;致死温度分别为(32.9±1.7)℃、(33.8±1.5)℃、(35.2±1.2)℃和(36.7±0.9)℃。经过不同温度孵化10d后蝌蚪的最适温度、逃避温度和致死温度都存在显著差异。     

Effect of ColV plasmids on the hydrophobicity of Escherichia coli

Abstract The hydrophobicity of E. coli strains carrying or lacking the colicin V ( ColV ) plasmids, ColV , I-K94 or ColV -K30 was assayed. ColV ⁺ derivatives of strain 1829, produced by conjugation or transformation, were more hydrophobic than either the original 1829 parental strain or a Col ^- derivative formed by curing 1829 ColV -K30 of its plasmid by an SDS/high temperature growth technique. Transfer of ColV into other E. coli strains also led to increased hydrophobicity. This effect of ColV plasmids was observed for organisms grown at 37°C; ColV ⁺ and ColV^- strains did not differ in hydrophobicity of grown at 21°C. This finding and other studies suggest that sex pili may be involved in the increased hydrophobicity.     

Production and characterization of Escherichia coli enterohemolysin and its effects on the structure of erythrocyte membranes

Hemolysins are cell-damaging protein toxins produced by pathogenic bacteria, which are usually released into the extracellular medium. Escherichia coli enterohemolysin is an intracellular toxin produced during the log phase of growth, with a maximal intracellular accumulation in the late log phase. In the present study, we have employed electron microscopy and SDS-PAGE to assess the effects of enterohemolysin on erythocyte membranes from different species. The erythrocyte cell damage began immediately after exposure to enterohemolysin with chemically detectable changes in cell membrane permeability, and the formation of surface lesions which increased rapidly in size. This process resulted in complete cell destruction. Ring-shaped structures with a diameter of 10nm were observed by electron microscopy after treatment of horse erythrocyte membranes with enterohemolysin. The ring structures were found clustered and irregularly distributed on the surface of the membranes. Following incubation of the toxin with horse erythrocyte ghosts and detergent-solubilization, the enterohemolysin was isolated from the cytoplasm in its membrane-bound form by sucrose density gradient. SDS-PAGE and silver staining of deoxycholate-solubilized target membranes revealed heterogeneous forms of the toxin. By using SDS-PAGE and gel filtration, the molecular weight of the toxin was estimated to be 35 kDa. With respect to species specificity, horse erythrocytes showed the highest sensitivity to the enterohemolysin, followed by human and guinea pig erythrocytes. The hemolytic sensitivity correlated with the toxin binding capacity of erythrocyte membranes of different animal species. The degree of hemolysis was unaffected by temperature in the range of 4 degrees C-37 degrees C and was optimal at pH 9.0. In contrast to pore-forming cytolysins, the hemolytic activity of enterohemolysin was enhanced continuously in the presence of increasing concentrations of dextran 4 and dextran 8 within the range of 5 to 30 mM. Trypsin sensitivity of membrane-bound enterohemolysin indicates that the cell surface is the most likely target site for this toxin. Additionally, the fact that proteinase and phosphatase inhibitors failed to inhibit lysis suggests that enterohemolysin alters and disrupts cell membranes by a detergent-like mechanism.     

Response dynamics of 26-, 34-, 39-, 54-, and 80-kDa proteases in induced cultures of recombinant Escherichia coli

Several researchers have demonstrated that the presence of a heterologous protein in recombinant Escherichia coli elicits a response similar to the heat-shock response, which includes enhanced protease expression. The present work detects, quantifies, and characterizes intracellular protease activity in E. coli that are "shocked" by the induction of a recombinant protein, CAT, which is an endogenous protein in some E. coli strains. A novel, sodium dodecyl sulfate gelatin poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-GPAGE) method is used to detect, quantify, and characterize the presence of these proteases. A hypothesis is proposed which links the amplified protease activity to a temporary depletion of specific amino acid pools, and a stringent-like stress response. (c) 1993 John Wiley & Sons, Inc.     

脆弱类杆菌与大肠杆菌混合感染的小鼠皮下脓肿模型的定量研究

本文用临床上厌氧菌感染中最常见的B.f(脆弱类杆菌)与兼性菌中最常见的E.c(大肠杆菌)作混合感染致病协同性研究的模式菌株,从定量角度建立小鼠皮下脓肿的感染模型。结果表明,单独在昆明小鼠皮下接种B.f 10~7(CFu/m)后1/10发生脓肿,10~8与10~9菌量分别有3/10及6/10发生脓肿。B.f的CP(荚膜多糖)提取物125μg、250μg、500μg,其脓肿形成率分别为1/10、2/10和4/10。单独注射E.c10~6～10~7菌量时,无脓肿及死亡发生。10~8时3/10小鼠死亡,脓肿不典型。引起感染的菌量阈值B.f为10~7,E.c为10~8。B.f致病特征为引起脓肿,E.c为引起死亡。混合感染两种菌浓度均在10~7时,5/10发生脓肿,2/10发生死亡。在感染灶中两种菌浓度总数分别保持在≥10~7。B.f与E.c混合感染时有明显的协同致死与协同致脓肿效应。