肠道病毒71型外壳蛋白VP1全长在大肠杆菌中的高效表达及初步活性测定

目的:重组表达肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1全长,用于研制血清学检测试剂和疫苗研发。方法:在获得EV71全长基因并测序正确的基础上,将外壳蛋白VP1全长基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用双抗原夹心检测技术评价重组抗原与27份EV71抗体阳性血清和18份阴性血清的反应情况。结果:重组EV71-VP1蛋白在大肠杆菌中诱导6 h后可获得高效表达,能与27份EV71抗体阳性血清中的21份发生阳性反应,EV71双抗原夹心检测与中和血清测试结果具有很好的一致性(P0.05)。结论:实现了肠道病毒71型外壳蛋白VP1的高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

柯萨奇病毒A16型VP1亚单位疫苗构建

柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16, CVA16)属于小RNA病毒科肠道病毒属,是手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD)的主要病原体之一。近年来发现,CVA16感染的病患可引起脑部、肺部和心脏等的继发感染,甚至还可能引发肺炎、心肌炎和难治性休克等致死性并发症。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit, LTB),可作为特异性抗原的黏膜佐剂,用以增强特异性抗原的血清IgG抗体应答。大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli type-Ⅱheat-labile enterotoxin B subunit, LT2B)具有比LTB更强的佐剂活性。本实验对CVA16VP1与LT2B融合蛋白作为抗原的免疫原性的研究,将初步评价产生的抗体的抗体效价,为进一步研究柯萨奇病毒的新型疫苗奠定基础。本研究构建pET32-CVA16VP1-LT2B融合表达载体,诱导表达CVA16VP1-LT2B蛋白,用于免疫小鼠,采取血清,检测特异性抗体效价。结果表明,本研究成功构建了pET32-CVA16VP1-LT2B融合表达载体,并成功提取到纯化的CVA16VP1-LT2B蛋白,间接ELISA检测出抗体效价为1∶800。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒pPIC9K/VP1,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,甲醇诱导表达。SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为34kD,与天然VP1大小一致。凝胶薄层扫描分析显示:目的蛋白表达量占培养上清总蛋白的60%以上。ELISA实验表明,重组蛋白VP1具有较好的抗原性。使用饱和硫酸铵分级沉淀法初步纯化的表达产物,能够较特异性地与EV71感染者血清中的抗体产生反应,而且与抗柯萨奇病毒A16特异性抗体不产生反应。通过利用表达产物作为抗原,对156份血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的的检测用抗原。     

2013年大连市手足口病病原监测结果分析

目的通过对2013年大连市手足口病（HFMD）的病原进行鉴定,以了解其型别分布。方法采用realtime-PCR方法对754份标本进行肠道病毒（EV）通用引物和肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CVA16）、柯萨奇病毒A组6型（CVA6）型特异性引物检测,对EV通用引物检测结果为阳性,但EV71、CVA16和CVA6检测结果均为阴性的标本采用巢氏PCR进行肠道病毒VP1基因部分序列的扩增、测序和生物信息学分析以鉴定其型别。结果 2013年引起大连市HFMD的主要病原CVA6占44.30%（334/754）、CVA16占19.12%（114/754）、EV71占11.54%（87/754）,另有少数病例由CVA2、4、5、8型,CVB2、4型,ECHO9型及EV的其他型别引起。结论 CVA6取代EV71和CVA16成为2013年大连市HFMD病原的主要流行型别,后续应加强对HFMD病原的监测,全面了解其型别分布及毒株变异情况以更有效地控制疾病流行。     

肠道病毒71型北京分离株VP4基因序列及蛋白抗原性分析

为探讨肠道病毒71型(EV71)VP4基因序列与手足口病(HFMD)不同临床类型之间的关系,分析重组蛋白EV71 VP4的抗原性,并初步探讨其与柯萨奇病毒A16(CA16)重组蛋白VP4是否存在交叉反应性,对2007~2009年从北京患HFMD儿童标本分离到的10株EV71的VP4基因进行克隆测序,运用生物学软件对测序结果进行比较分析,并选择其中1株与1株同期分离的CA16的VP4分别进行原核表达;用表达产物对189份正常体检的成人及来首都儿科研究所就医的非HFMD患儿血清中的IgG进行Western Blot检测,并分析14份确诊为EV71感染和12份CA16感染患者急性期血清中的IgM抗体。分析表明这10株EV71 VP4基因核苷酸同源性为94.20%~100.00%,所推导的氨基酸序列则完全相同,从重症与轻症患儿分离的毒株之间VP4的核苷酸序列未见一致性的差异,基于EV71 VP4基因核苷酸序列的进化树分析表明2007~2009年北京地区所流行的毒株均属于C4亚型;本研究中EV71和CA16的VP4核苷酸序列的同源性为69.60%,所推导的氨基酸序列的同源性为78.60%,在运用Western Blot检测189份血清中的VP4特异性IgG时,EV71 VP4的血清阳性率为38.10%,说明其具有良好的抗原性,CA16 VP4的血清阳性率为58.20%,两者差别具有显著统计学意义(2χ=15.30,P<0.01),提示EV71 VP4与CA16 VP4没有交叉反应性;在用表达的VP4检测已确诊为相应病毒的特异性IgM时,两者皆为阴性,提示感染后机体对VP1和VP4产生不同的反应。     

2008～2009年青岛地区手足口病病原学的调查分析

本研究对2008～2009年青岛地区手足口病的病原学进行调查研究。首先对HFMD病例的咽拭子标本直接进行病毒核酸的提取,然后采用多重荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对总肠道病毒(Enterovirus,EV)、肠道病毒71型(Enterovirus Type 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus Group A 16,CVA16)进行检测,对EV阳性而EV71和CVA16均阴性的标本采用半巢式反转录PCR进行肠道病毒VP1基因部分序列的扩增和序列分析以鉴定其血清型别。结果提示2008～2009年青岛地区手足口病的主要病原为EV71和CVA16,无论轻症和重症病例,EV71的比例都大于CVA16。2008年共获得5个(8株)其它血清型,分别是柯萨奇病毒(Cox-sackievirus,CV)的A5、A6、A10、A12及埃可病毒9(Echovirus 9,E9),血清型分布比较分散、均匀。2009年共获得3个其它血清型(13株),分别是CVA9、CVA12及CVB2,CVA12所占比例较大(11/13),分布比较集中。CVA12成为2009年青岛地区HFMD病原中除EV71和CVA16外,新的较为流行的病原。     

柯萨奇病毒A组10型研究进展

自2008年以来,由多种肠道病毒引起的手足口病已成为严重威胁中国婴幼儿健康的重大公共卫生问题之一。其中,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)是引起手足口病的主要病原体。但2011年以后,中国手足口病的流行趋势发生了变化,柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CVA10)和柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)引起的手足口病呈增多趋势,在部分地区已替代EV71和CVA16成为引起手足口病的主要病原体,已引起越来越多的关注。现就CVA10的病原学、流行病学、实验室诊断、动物模型及疫苗相关研究作一综述。     

柯萨奇病毒A组2型生物化学特性及免疫原性分析

柯萨奇病毒A组2型（Coxsackievirus A2,CV-A2）每年引起的手足口病病例数不断增加,甚至导致死亡病例[1]。因此,急需对CV-A2的生化特性及免疫原性进行分析,顺利研制出CV-A2的手足口病疫苗。通过细菌表达结构蛋白全长或部分片段的GST融合蛋白,纯化CV-A2病毒颗粒;将纯化的病毒颗粒免疫动物后制备兔抗CVA2 VP1-VP4抗体及CV-A2病毒抗血清,通过免疫印染法（Western Blot,WB）、SDS-PAGE电泳法对CsCl密度梯度纯化的CV-A2的空心颗粒（EP）与实心颗粒（FP）的蛋白组分、纯度、多聚蛋白酶剪切进行分析。WB和间接免疫荧光法证明了抗体具有良好的特异性。EP由VP0、VP1、VP3构成,而FP的VP0被剪切,故由VP1-VP4构成。EP和FP比例为33%和67%,密度分别为.29、1.32 g/cm3,纯度分别为94.7%和97.3%。中和试验结果显示,兔抗全病毒抗体具有中和作用,而兔抗CV-A2 VP1-VP4抗体不具有中和作用。本研究建立了CV-A2纯化病毒结构蛋白的分析方法,研究了重组病毒蛋白及病毒颗粒的免疫原性及持久性,对包括CV...     

2014年安徽省柯萨奇病毒A组16型分离株VP1基因特征研究

研究2014年安徽省手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)患儿中分离的柯萨奇病毒A组16型(Coxsachivirus A 16,CVA16)毒株VP1区基因特征。收集安徽省2014年1月至11月期间413份HFMD患儿咽拭子标本接种敏感细胞分离肠道病毒,用荧光定量RT-PCR鉴定细胞培养物,对CVA16阳性培养物进行毒株VP1区RT-PCR扩增及核苷酸序列测定和基因特征分析,并与国内外参考序列构建基因亲缘性关系树。共分离鉴定出肠道病毒阳性培养物97份,其中CVA16病毒分离株17株,人肠道病毒71型(Human enterovirus 71,HEV71)分离株76株,其它肠道病毒分离株4株,总体病毒分离率为23.49%(97/413)。CVA16基因亲缘性关系分析显示:安徽省2014分离的17株CVA16毒株都属于B1基因型B1b一个分支,它们之间在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分布为分别为95.30%~100%和98.70%~100%,但在B1b分支内形成几个传播链。17株CVA16毒株VP1区核苷酸序列与国内云南、湖南、广东、西藏和江苏地区病毒分离株同源性较高,亲缘性关系近,其中与湖南2013年和广东深圳2014年CVA16病毒分离株同源性最高,为96.40%~99.70%。2014年安徽省分离的CVA16病毒分离株属于B1基因型B1b亚型,为优势流行株;在B1b分支内形成多个小的病毒传播链共同流行。     

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒—人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型。优化多重反应体系中针对5’UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度。结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA。该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查。     

鹅细小病毒长春分离株主要结构蛋白(VP2-VP3)基因的原核表达

根据国外巳发表的鹅细小病毒（GPV）A株基因组核苷酸序列,设计并合成了一对用于GPV主要结构蛋白（VP2-VP3）基因表达的引物。利用合成的引物,扩增并鉴定了GPV中国长春株（GPV CC株）的VP2-VP3基因。将扩增的目的的基因插入到原核表达载体pET28(a)的多克隆位点,构建了表达GPV,VP2-VP3基因的原核载体pEGVP1。重组表达载体质粒转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到大小分别为75000和58000的表达蛋白带。Western blot分析表明,表达产物具有很好的特异性。     

Genomic surveillance of coxsackievirus A10 reveals genetic features and recent appearance of genogroup D in Shanghai,China, 2016-2020

Coxsackievirus A10 (CVA10) is one of the major causative agents of hand, foot and mouth disease (HFMD). To investigate the epidemiological characteristics as well as genetic features of CVA10 currently circulating in Shanghai, China, we collected a total of 9,952 sporadic HFMD cases from January 2016 to December 2020. In the past five years, CVA10 was the fourth prevalent causatives associated with HFMD in Shanghai and the overall positive rate was 2.78%. The annual distribution experienced significant fluctuations over the past five years. In addition to entire VP1 sequencing, complete genome sequencing and recombination analysis of CVA10 isolates in Shanghai were further performed. A total of 64 near complete genomes and 11 entire VP1 sequences in this study combined with reference sequences publicly available were integrated into phylogenetic analysis. The CVA10 sequences in this study mainly belonged to genogroup C and presented 91%-100% nucleotide identity with other Chinese isolates based on VP1 region. For the first time, our study reported the appearance of CVA10 genogroup D in Chinese mainland, which had led to large-scale outbreaks in Europe previously. The recombination analysis showed the recombination break point located between 5,100 nt and 6,700 nt, which suggesting intertypic recombination with CVA16 genogroup D. To conclusion, CVA10 genogroup C was the predominant genogroup in Shanghai during 2016-2020. CVA10 recombinant genogroup D was firstly reported in circulating in Chinese mainland. Continuous surveillance is needed to better understand the evolution relationships and transmission pathways of CVA10 to help to guide disease control and prevention.     

鸡传染性贫血病毒VP2基因的表达及其免疫活性分析

利用特异性引物从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到VP2基因,BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理,纯化后,克隆至BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理的表达载体pET-28a中,构建了原核表达质粒pET-28-VP2。将pET-28-VP2转化至感受态E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约31kDa的目的蛋白以可溶性形式表达于上清中。Western blot分析发现,表达产物与鸡传染性贫血的阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白免疫小鼠后制得的多抗可以与全病毒发生反应,证明其具有免疫原性,为进一步研究VP2蛋白的功能及开展CIAV疫苗及诊断试剂的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒非结构蛋白VP5的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR技术,从传染性法氏囊病病毒（IBDV）Gx,Gt毒株中分别扩增出VP5基因,将其克隆到表达载体pET30a、pET28a中。经PCR、酶切和序列分析鉴定获得重组质粒命名为pET28a-GtVP5、pET30a-GxVP5。将pET30a-GxVP5、pET28a-GtVP5分别转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下均成功表达约24 kDa的Gx-VP5及23kDa的Gt-VP5融合蛋白,并都以包涵体形式存在。将Gx-VP5纯化后的蛋白免疫8周龄BALB/c雌鼠,ELISA分析表明制备的抗血清效价在1:25600以上,Western blot分析VP5表达产物能与抗6×His mAb及抗IBDV多克隆抗血清发生反应,具有良好的免疫反应特异性。     

A型口蹄疫病毒VP0基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA.并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP0基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP0并亚克隆入pMD18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体pET32a用BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒pET32-VP0.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP0并用SDS-PAGE进行检测.表达产物用镍亲和树脂进行了纯化.结果证明,口蹄疫病毒VP0蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料.     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PLA2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了westernblot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。     

The Development and Application of the Two Real-Time RT-PCR Assays to Detect the Pathogen of HFMD

Large-scale Hand, Foot, and Mouth Disease (HFMD) outbreaks have frequently occurred in China since 2008, affecting more than one million children and causing several hundred children deaths every year. The pathogens of HFMD are mainly human enteroviruses (HEVs). Among them, human enterovirus 71 (HEV71) and coxsackievirus A16 (CVA16) are the most common pathogens of HFMD. However, other HEVs could also cause HFMD. To rapidly detect HEV71 and CVA16, and ensure detection of all HEVs causing HFMD, two real-time hybridization probe-based RT-PCR assays were developed in this study. One is a multiplex real-time RT-PCR assay, which was developed to detect and differentiate HEV71 specifically from CVA16 directly from clinical specimens within 1–2 h, and the other is a broad-spectrum real-time RT-PCR assay, which targeted almost all HEVs. The experiments confirmed that the two assays have high sensitivity and specificity, and the sensitivity was up to 0.1 TCID₅₀/ml for detection of HEVs, HEV71, and CVA16, respectively. A total of 213 clinical specimens were simultaneously detected by three kinds of assays, including the two real-time RT-PCR assays, direct conventional RT-PCR assay, and virus isolation assay on human rhabdomyosarcoma cells (RD cells). The total positive rate of both HEV71 and CVA16 was 69.48% with real-time RT-PCR assay, 47.42% with RT-PCR assay, and 34.58% with virus isolation assay. One HFMD clinical specimen was positive for HEV, but negative for HEV71 or CVA16, which was identified as Echovirus 11 (Echo11) by virus isolation, RT-PCR, and sequencing for the VP1 gene. The two real-time RT-PCR assays had been applied in 31 provincial HFMD labs to detect the pathogens of HFMD, which has contributed to the rapid identification of the pathogens in the early stages of HFMD outbreaks, and helped to clarify the etiologic agents of HFMD in China.     

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。