牛奶过敏原β-乳球蛋白的重组制备及磁微粒化学发光检测法的建立

运用原核系统表达牛奶β-乳球蛋白(Bos d5)蛋白,建立一种纳米磁微粒化学发光方法用于检测牛奶组分过敏原β-乳球蛋白特异性Ig E抗体的含量。通过优化合成牛奶β-乳球蛋白基因,与质粒重组导入Rosetta原核表达菌株中表达目标蛋白,纯化的重组蛋白采用生物素标记后,在化学发光平台上进行过敏原项目检测。获得纯度﹥85%的22.5 kD重组牛β-乳球蛋白,将生物素化的重组蛋白用于牛奶β-乳球蛋白纳米磁微粒检测试剂盒,检测临床110例血清样本,和Phadia进行方法学比对阳性符合率为88.9%,阴性符合率97.3%,总符合率94.5%,P<0.001,χ^2=84.238,Kappa=0.874,其与Phadia参照试剂盒同样具有良好的检测能力。原核表达系统中获得的重组牛奶过敏组分β-乳球蛋白具有较好的免疫活性,开发的免疫诊断试剂盒具备良好的性能,可用于临床辅助诊断。     

牛β-乳球蛋白基因5′调控成分的分离、克隆及序列分析

西北农林科技大学生物工程研究所石玉强等5位先生利用PCR方法克隆了牛β-乳球蛋白基因5′调控成份(1 449bp),其中包括5′侧翼序列(645bp),第一外显子及第一内含子(804bp)。PCR产物回收纯化后,克隆在pMD18-T Vector的T位点。序列分析表明,该序列与牛β-乳球蛋白A型基因、牛β-乳球蛋白B型基因山羊和绵羊β-乳球蛋白基因的同源性分别为98.55%,99.79%,90.70%,90.09%。这表明此调控成分含有诸多调节因子结合位点或反应元件。其中包括视黄酸反应元件(RARE)、佛波酯反应元件(TRE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,并提…     

食品上的应用

961159 嗜热链球菌对乳酸乳球菌噬菌体抗性机理的表达[英]/Moineau,S.…//Appl. Environ. Microbiol.-1995,61(7).-2461～2466[译自DBA,1995,14(17),95-10388] 鉴定了7.8kb的乳球菌质粒pSRQ700。此质粒编码了可识别并切割3′-GATC-5′序列的限制性     

高效液相色谱法测定乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白及其改性降敏

牛乳过敏是由牛乳中的致敏蛋白引起的一种不良反应,而乳清蛋白是从牛奶中分离的高营养价值的蛋白。本研究中,笔者建立了一种高效液相色谱技术定量检测乳清蛋白中主要致敏蛋白α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的方法;与现行标准(T/TDSTIA 007—2019)相比,本方法采用应用更广泛的Sepax-C8(4. 6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,以0. 1%的三氟乙酸水溶液(A)和0. 1%的三氟乙酸乙腈溶液(B)作为流动相进行梯度洗脱,色谱柱在温度28℃、波长280 nm检测条件下对目标蛋白进行分离检测。定量分析结果表明,致敏蛋白在0. 125～2. 000 mg/m L范围内与蛋白峰面积线性关系良好(R2 0. 99),蛋白平均回收率为92%～96%,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白检出限分别为0. 078和0. 090 mg/m L。该检测方法重复性好,可用于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的定量分析测定。此外,考察了胰蛋白酶对2种致敏蛋白改性的影响,采用智能可视化优化方法预测出酶解最优条件,结果表明在45℃下加入2000 U/g的胰蛋白酶水解30 min后,水解率高达78. 9%,2种致敏蛋白含量占牛乳总蛋白的22. 7%,大大降低了乳制品中的致敏蛋白含量。     

三河牛β-乳球蛋白基因型及其启动子序列特点

[目的]分析三河牛β-乳球蛋白(β-Lg)的基因型,并探索其启动子序列与乳中含量的关系。[方法]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测乳中β-Lg遗传变异体及其相对表达量,并通过PCR扩增,比对不同遗传变异体启动子的序列差异。[结果]三河牛(n=62)乳清中β-Lg有AA、AB和BB共3种基因型,频率依次为0.290、0.403和0.307,A和B两种等位基因频率接近;对37个纯合型β-Lg启动子的部分序列进行PCR扩增(636 bp)和测序,并与普通牛β-Lg基因序列(GenBank登录号：U31361.1)比对,共检测到6个突变位点,其中-430、-362、-216和-204位点基本上是等位基因特异的,且有3个突变点在3种转录因子结合基序中;建立了三河牛乳中β-Lg含量的高效液相色谱测定方法,发现β-Lg含量在AA型中极显著高于AB型(P<0.01),但AA、AB型与BB型之间均无显著差异。[结论]三河牛β-Lg A和B两种等位基因频率接近,其启动子-430、-362、-216和-204位点具有等位基因特异性,并可能影响等位基因表达。     

黄毛楤木皂甙的分离鉴定

从黄毛楤木(Aralia decaisneana Hance)根皮分得3种皂甙(Ad-Ⅰ、Ad-Ⅱ、Ad-Ⅲ)和1种由 Ad-Ⅲ水解得到的次级甙(Ad-Ⅳ),经光谱(IR、FAB-MS、~1H-NMR、~(13)C-NMR)和化学分析(酸、碱水解法),分别鉴定为楤木皂甙 A、3-O-[α-L-阿拉伯呋哺糖-(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖醛酸]-齐墩果酸甙、3-O-[β-D-半乳吡喃糖-(1→4)-β-D-半乳吡喃糖-(1→3)-β-D-葡萄吡喃糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-葡萄吡喃糖甙、3-O-[-β-D-半乳吡喃糖-(1→4)-β-D-半乳吡喃糖-(1→3)-β-D-葡萄吡喃糖醛酸]-齐墩果酸甙。前两种皂甙系首次从该植物分得,后两种为新化合物。     

甲亢患者β2-微球蛋白与血脂水平相关性研究

目的:探讨甲亢患者β2-微球蛋白含量与血脂水平的相关性。方法:以甲状腺功能亢进症患者40例作为观察组,另选择同期在我院进行体检的健康人群40例为对照组,分别于治疗前和治疗后检测患者血清和尿β2-微球蛋白、血外周血载脂蛋白、血脂,并进行血清和尿β2-微球蛋白与血脂的相关性分析。结果:治疗前甲亢组血清和尿β2-微球蛋白均高于对照组(P<0.01);TC、TG、HDL-C、LDL-C和APOB均低于对照组(P<0.01);治疗后,血清和尿β2-微球蛋白与治疗前相比均有所下降(P<0.01),TC、TG、HDL-C、LDL-C和APOB与脂类前相比均有所升高(P<0.01);血清和尿β2-微球蛋白与TC、TG、HDL-C、LDL-C和APOB均呈负相关。结论:甲亢患者血清和尿β2-微球蛋白与血脂关系密切,可作为评价患者脂质代谢状态和病情变化的重要指标。     

甲亢患者β2-微球蛋白与血脂水平相关性研究

目的：探讨甲亢患者β2-微球蛋白含量与血脂水平的相关性。方法：以甲状腺功能亢进症患者40例作为观察组,另选择同期在我院进行体检的健康人群40例为对照组,分别于治疗前和治疗后检测患者血清和尿β2-微球蛋白、血外周血载脂蛋白、血脂,并进行血清和尿β2-微球蛋白与血脂的相关性分析。结果：治疗前甲亢组血清和尿β2-微球蛋白均高于对照组（P〈0．01）;TC、TG、HDL-C、LDL-C和APOB均低于对照组（P〈0．01）;治疗后,血清和尿β2-微球蛋白与治疗前相比均有所下降（P〈0．01）,TC、TG、HDL—C、LDL-C和APOB与脂类前相比均有所升高（P〈0．01）;血清和尿β2-微球蛋白与TC、TG、HDL-C、LDL-C和APOB均呈负相关。结论：甲亢患者血清和尿β2-微球蛋白与血脂关系密切,可作为评价患者脂质代谢状态和病情变化的重要指标。     

基因工程

961610 合成蒽醌类物质的岛青霉和常现青霉的转化[英]/Huang,K.…//Curr,Genet.-1995,28(6).-580～584[译自DBA,1996,15(1),96-00016] 分别用pSV50质粒和pBT6质粒(带有抗苯菌灵的β-微管蛋白基因)及pAN7-1质粒和pDH25质粒(带有由构巢曲霉(Aspergillus nidulans)序列控制的细菌潮霉素磷酸转移酶基因)转化岛青霉(Penicil-     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及其调控外源基因表达的研究

目的制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列,并验证其指导外源基因表达的能力.方法用PCR法从奶牛染色体上分5段扩增出了全长8.2Kb的牛β-乳球蛋白基因,包括1.8Kb的5′侧翼区、1.7Kb的3′侧翼区及4.7Kb的gDNA区.扩增出的各片段克隆到T-载体上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性.将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达.结果注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性.结论所克隆的牛β-乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达.     

一个植物乳杆菌隐蔽质粒的序列分析

[目的]分离植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum LP101)中的质粒,并对其序列进行分析。[方法]从植物乳杆菌LP101中提取质粒并行双酶切,纯化后与载体pet22b进行连接,电转化到大肠杆菌DH5α中。将测序后得到的质粒片段进行拼接,对拼接成功的质粒进行序列分析。[结果]从植物乳杆菌LP101中分离得到一个隐蔽质粒p LP101,测序结果显示该质粒大小为3 496 bp,碱基G+C含量为38.2%,编码了一个移动蛋白和一个复制蛋白。BLAST结果显示该质粒的核苷酸序列与干酪乳杆菌(L.casei)中的质粒p SMA23相似性在99%以上。[结论]分离得到了植物乳杆菌LP101中的一个隐蔽质粒p LP101,推定其复制方式为滾环复制,属于滚环复制p C194家族成员。     

利用乳酸乳球菌AcmA表面展示β-1,3-1,4-葡聚糖酶

采用PCR扩增乳酸乳球(Lactococcus lactis)MBl91菌株的全长肽聚糖水解酶基因acmA,通过C-末端融合构建了与绿色荧光基因gfp的融合基因acmA-gfp,再连接于表达载体pMG36k上后得到可组成型表达AcmA-GFP融合蛋白的重组质粒pMB137,然后将该质粒电转化导入到乳酸乳球菌AS1.2829中获得重组菌MB137.经SDS-PAGE检测.重组菌MB137可表达预期的分子量约74 kD的蛋白质.Western blotting、细胞分级分离组分的荧光活性测定和特异GFP 二抗标记的流式细胞仪检测证实GFP被成功锚定在重组茵细胞表面,被锚定蛋白约占总表达融合蛋白的35%.进一步通过从枯草芽胞杆菌BF7658基因组中扩增去信号肽序列的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因gls,来取代pMB137中的gfp,得到携带融合基因acmA-gls的重组质粒pMB138,经导入到乳酸乳球茵AS1.2829后得到重组菌MB138,其全细胞β-1,3-1,4-葡聚糖水解酶的活性约为12 U/mL茵液,明显高于对照茵株.     

藏黄牛β-乳球蛋白基因启动子部分序列特征

目的:阐明藏黄牛、牦牛、中国荷斯坦牛β-乳球蛋白(β-Lg)遗传变异体在乳中表达差异的分子基础。方法:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定乳中β-Lg遗传变异体及其相对表达量,然后利用PCR方法扩增β-Lg启动子部分序列(375bp)并直接测序。结果:在杂合型β-Lg个体中,中国荷斯坦牛乳中β-Lg A的相对表达量(63.7±2.9%)均一致性地高于β-Lg B,而藏黄牛乳中二者比例十分接近,但个体差异差异较大。16个测序样品中共检测到13处碱基突变,其中有5处为牦牛特异的。另外,在牦牛β-Lg启动子-452与-453之间,还存在一个插入碱基。结论:β-Lg启动子-430碱基在中国荷斯坦牛中表现为等位基因特异的,而在藏黄牛中无等位基因特异性。     

胰蛋白酶水解β-乳球蛋白获得ACE抑制肽的条件优化

采用三因素二次通用旋转设计和体外检测法,对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白获得ACE抑制肽的条件进行优化。结果表明,底物浓度(X1)、温度(X2)、酶与底物的质量比(X3)对ACE抑制率的影响回归方程为:Y=50.62-2.33X1-1.97X2+5.81 X3-3.36X2X3-6.56X22-1.96X32,胰蛋白酶水解β-乳球蛋白获得ACE抑制肽的最优水解条件为:底物质量浓度为60 g/L,水解温度30℃,酶与底物的质量比为5.5%,水解时间6 h,水解产物对ACE抑制活性最大抑制率为53.86%。     

排风藤中皂苷类化学成分研究

从茄属植物排风藤的全草中分离得到了4个皂苷类化合物,经鉴定分别为:25R-螺甾-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-O－β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(1),5α,25R-螺甾-3-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O－β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(2),22α,25R-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羟基-呋甾-△5-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃半乳糖苷(3),22α,25R-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-羟基-呋甾-△5-3β,26-二醇-3-O－β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4).化合物1-4均为首次从排风藤中分离得到.     

短小芽孢杆菌β-1，4-甘露聚糖酶的酶学性质及其在干酪乳杆菌中的表达

摘要:【目的】干酪乳杆菌广泛的应用于食品加工和饲料行业,本研究拟构建表达甘露聚糖酶的重组干酪乳杆菌并进行相关评价。【方法】利用干酪乳杆菌表达载体pELX1和pELSH,将短小芽孢杆菌的β-1,4-甘露聚糖酶成熟肽的基因克隆到上述两个载体中,构建的重组质粒电转化到干酪乳杆菌宿主中,分别构建能够胞内表达和分泌表达甘露聚糖酶的重组干酪乳杆菌。【结果】重组干酪乳杆菌菌株经培养后,胞内表达的β-1,4-甘露聚糖酶在重组细胞总蛋白中最高可达23 U/mg,分泌表达培养基上清的β-1,4-甘露聚糖酶最高达到8.8 U/mL。【结论】本研究首次实现了甘露聚糖酶在干酪乳杆菌中的表达,结果表明该重组干酪乳杆菌具有较大的应用前景,值得进一步研究。     

二花脸猪乳中蛋白组分的动态变化

分析了10头二花脸猪乳个主要蛋白质组分在泌乳1-20天的含量及其动态变化。结果表明，α-乳白蛋白(α-La)浓度前4天至上升趋势，1周后略有下降，然而其浓度和百分比均差异不显著。β-轧球蛋白(β-Lg)、总路蛋白(tCN)和清蛋白(SA)的浓度第一天最高，β-Lg有下降趋势，SA缓慢下降，而tCN规律性不强。β-Lg百分比差并不显著。tCN百分比随着泌乳天数逐日上升。SA的百分比在泌乳一周内变化不大，后开始下降。免疫球蛋白(Igs)、乳铁蛋白(Lf)浓度以及Igs百分比第一天显著高于其它泌乳天数，然后急剧下降，在一周后处于很低的水平，Lf百分比至下降趋势。一组高分子量蛋白质(HMWP)浓度和百分比在一周内逐渐上升。     

酶标白桂木凝集素糖蛋白结合特性的分析

采用辣根过氧化物酶 ( HRP)标记白桂木凝集素 ( AHL) ,应用酶联夹心法及糖竞争抑制实验 ,研究 AHL的糖蛋白结合特性 .研究表明 ,AHL能与两种不同类型的糖蛋白结合 ,一类以胃蛋白酶为代表 ,AHL能以高亲和力与胃蛋白酶结合 .其次能与β-乳球蛋白、牛血清清蛋白结合 ,但结合力依次递减 .AHL也能与透明质酸以较高亲和力相结合 .AHL与胃蛋白酶、β-乳球蛋白、牛血清清蛋白、透明质酸的结合受 Me- Gal的强烈竞争抑制 ,亦受 Me- Man\D- Gal\Raf的抑制 .另一类为Con A,AHL与 Con A的结合受 Me- Man的强烈竞争抑制 ,并受 Me- Glc\D- Man\D- Fru\D- Glc的较强抑制 .各种糖的封闭性抑制实验结果与竞争性抑制实验相似 .提示 AHL上存在 O-糖苷键结合位点 .     

奶山羊β—乳球蛋白cDNA的克隆

从奶山羊乳腺中快速抽提总ＲＮＡ,根据已发表的绵羊β乳球蛋白基因的序列,设计并合成与ｏＢＬＧ基因第一个外显子和最后一个外显子的部分序列相对应并能与特定载体末端互补的一对引物,经反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法扩增获得了特异性片段。将扩增片段民互性化质粒ｐＤＩＲＥＣＴ退火,获得重组质粒ｐＤＢＬＧ。ＰＣＲ鉴定、限制性分析和分子我均表明已克隆以奶山羊ＢＬＧ的ｃＤＮＡ。     

蛋白质自组装条件筛选形成的透明液滴中存在的自组装现象

微-纳尺度的蛋白质自组装体具有形貌多样性与良好的生物相容性,因而成为蛋白质自组装领域的研究热点。以蛋白质结晶条件的筛选手段高通量筛选不同类型蛋白质于不同尺度、不同形貌的自组装过程,是一种新兴的研究方法,具有重要研究意义。利用该方法进行蛋白质自组装条件筛选时,常会形成一些表观透明的液滴,其中是否有自组装现象的发生尚不明确。文中以β-乳球蛋白与蛋白质结晶试剂盒IndexTM C10相互作用为例进行探索,实验结果表明透明液滴中存在微-纳尺度的蛋白质自组装体。进一步通过扫描电镜观察不同初始浓度β-乳球蛋白与IndexTM C10混合形成的透明液滴中微-纳自组装体的形貌有所差别;通过激光共聚焦显微镜连续拍摄添加荧光标签的β-乳球蛋白形成自组装体的过程,可实时观察到液液相分离现象及最终形成的自组装体的形貌;通过原位X-射线衍射手段,可观察到自组装体内部结构随时间推移逐渐有序化的过程。以上研究表明,在以结晶条件筛选手段为基础的蛋白质自组装条件筛选实验中,透明液滴内的自组装现象具有深入探索的必要和价值。