由RTS—barnase嵌合基因的表达导致的雄性不育水稻植株

用ＰＣ赍水稻品种ＩＲ３６的总ＤＮＡ中扩增了ＲＴＳ基因５’调控区（－１２８８＋２５＿顺序并与从解粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）染色体ＤＮＡ中克隆的ＲＮａｓｅ（ｂａｒｎａｓｅ）基因编码区构建了嵌合基因,通过根癌农杆菌介导转化水稻品种ＺＨ１１,所获得转基因植株的主要性状与供体亲本无显著差异,但开花后药壁不开裂,并且大多数植株的花粉不被Ｉ－ＫＩ染色,自交条件下结实率为完     

RTS启动子与GUS的嵌合基因在转基因水稻花药中的专一性表达

通过PCR扩增 ,从籼稻品种IR36中克隆了RTS启动子的DNA片段 ;序列分析表明 ,所克隆的DNA片段含 12 5 7个核苷酸 ,与Lee等 (1996 )报告的序列比较 ,核苷酸同源性为 97.1% ;将 - 12 2 8～ 2 5的RTS启动子区段与GUS编码区组成的嵌合基因插入双元载体的T DNA中 ,经根癌农杆菌介导转化 ,得到转基因水稻植株。GUS活力检测表明 ,此嵌合基因不仅能在花药绒毡层 ,而且还在花药表皮细胞、药室内壁以及花粉中表达 ,而 - 783～ 2 5的 5’上游区与GUS编码区组成的嵌合基因则未在转基因水稻的花药中检测到其表达。     

RTS启动子与GUS的嵌合基因在转基因水稻花药中的专一性表达

通过ＰＣＲ扩增,从灿稻品种ＩＲ３６中克隆了ＲＴＳ启动子的ＤＮＡ片段,序列分析表明,所克隆的ＤＮＡ片段含１２５７个核苷酶,与Ｌｅｅ等（１９９６）报告的序列比较核苷酸同源履为９７．１％,将－１２２８～＋２５的ＲＴＳ启动子区段与ＧＵＳ驱组成的嵌合基因插入双元载体的Ｔ－ＤＮＡ中,经根癌农杆菌介导转化,得到转基因水稻植株。ＧＵＳ活力检测表明,此嵌合基因不仅能在药花棋毡层,而且还在花药表皮细胞、药到内壁以及花     

TA29—barnase基因转化甘蓝产生雄性不育植株

用PCR技术从烟草革新1号品种的总DNA中扩增了TA29基因的启动子和从解淀粉芽孢杆菌的总DNA中扩增了核糖核酸水解酶基因（barnase）,将其构建成融合基因,并克隆于pCAMBIA2301载体上。通过根癌农杆菌介导转化甘蓝下胚轴,经Km选择压下连续选择、扩繁和进行生根培养,获得了甘蓝转基因植株。经GUS、PCR和Southern blot检测,证明TA29－barnase融合基因已经整合至转基因植株的染色体中,经花器官观察,转基因植株中有雄蕊退化的雄性不育和半不育植株出现,用正常花粉对不流株进行人工授粉,不育株能正常结实,这表明转基因不育植株的雌性器官发育正常,其不育性与TA29－barnase融合基因在转基因植株中的表达有关。     

简单高效的根癌农杆菌介导的水稻基因转化方法

本文在研究影响农杆菌介导的水稻转化的主要因素基础上,建立了一套简单、高效的水稻转基因系统。将水稻成熟胚来源的愈伤组织用农杆菌EHA101／pHQ9,EHA101／pHQ10,EHA101／pHQT3感染后,筛选抗性愈伤,经分化获得转化株。抗性愈伤的平均得率为约100个愈伤／g愈伤外植体,抗性愈伤的分化频率平均高达85％。转基因植株的GUS染色、Southern杂交结果表明,T-DNA上的外源基因已整合进转基因植物的基因组中。转基因植株T1代对潮霉素的抗性表明,多数转基因株系符合孟德尔分离比3：1。该系统的建立将有助于应用T—DNA标签法和基因打靶法进行水稻功能基因组的研究。     

根癌农杆菌介导的水稻遗传转化

就根癌农杆菌介导水稻遗传转化的研究历程和影响农杆菌转化水稻的几个关键因素以及这一问题的前景作了评述和展望     

TA29-barnase基因转化甘蓝产生雄性不育植株

用PCR技术从烟草革新1号品种的总DNA中扩增了TA29基因的启动子和从解淀粉芽孢杆菌的总DNA中扩增了核糖核酸水解酶基因(barnse),将其构建成融合基因,并克隆于pCAMBIA2301载体上。通过根癌农杆茵介导转化甘蓝下胚轴,经Km选择压下连续选择、扩繁和进行生根培养,获得了甘蓝转基因植株。经GUS、PCR和Southernblot检测,证明TA29-bar-nase融合基因已经整合至转基因植株的染色体中。经花器官观察,转基因植株中有雄蕊退化的雄性不育和半不育植株出现。用正常花粉对不育株进行人工授粉,不育株能正常结实,这表明转基因不育植株的雌性器官发育正常,其不育性与TA29-barnse融合基因在转基因植株中的表达有关。     

根癌农杆菌介导的水稻转化研究进展

农杆菌介导的水稻基因转化是水稻基因转化的热门。本文对由农杆菌介导转化获得的水稻品系（品种）,影响农杆菌介导转化的因素,农村菌浸染的方法,外源基因的检测和遗传等方面作综合论述,并提出了农杆菌介导转化水稻的前景。     

根癌农杆菌介导转化水稻成熟胚及转Metr基因植株的获得

以粳稻品种广陵香糯为材料,用携带有双元载体pBB的根癌农杆菌EHA105为载体,研究了根癌农杆菌介导转化粳稻成熟胚愈伤组织的几个影响因素,建立了合适的粳稻成熟胚愈伤组织转化系统。一种基于MS为基本培养基的商品培养基(HRM)较适合于作为粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基,合适的愈伤组织诱导培养天数为7~8 d,合适的筛选培养基为CC培养基。在此基础上,将Metr基因导入粳稻品种广陵香糯中,获得了一批转基因水稻植株,PCR分析表明外源基因已经整合进了水稻的基因组中。部分转基因植株后代遗传分析表明外源基因的分离符合3∶1的理论比例。     

根癌农杆菌介导的水稻转基因技术体系的优化

对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的各重要因素逐一分析,比较不同基因型、培养基成份、光照、继代次数、菌液浓度、侵染时间、干燥情况等因素对遗传转化的影响。通过培养条件的优化,建立了一个高效的水稻转化技术体系。研究结果表明,相比较于暗培养,光照培养进行愈伤诱导可以使诱导天数缩短4~5d;诱导培养基中加入适量的激素可以使籼稻愈伤诱导提高25%~30%;分化培养基中加入适量的氨基酸和甘露醇可以使植株再生频率提高15%~20%。     

根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立

比较了影响根癌农杆菌转化水稻的各种因素后,建立了农杆菌介导的水稻高效转基因实验体系。按该体系,水稻品种中花11号预培养4d的幼胚经农杆菌EHA105／pCAMBIA1301感染后,具有GUS基因瞬间表达的幼胚比例在50％以上,最高可达90％;按产生潮霉素抗性愈伤和转基因植株的比例计算,转化率分别达到87．6％和64．6％。转基因植株总DNA的Southern杂交分析表明T－DNA上的外源基因已整合进了水稻基因组,且在大多数转基因植株中表现为单拷贝插入;遗传分析证明T1代的表型分离符合孟德尔法则。此转化系统的建立为高效地将有用的外源DNA导入水稻植株奠定了基础。     

水稻红莲型CMS育性恢复QTL分析

红莲型CMS是在我国杂交水稻生产中被广泛利用的雄性不育细胞质之一。为了同时定位红莲型CMS育性恢复主效和微效QTL,利用红莲型CMS不育系粤泰A(YTA)与“Lemont／特青”RIL群体测交,结合1张含有198个DNA分子标记的高密度遗传图谱,对测交F1群体的小穗育性和花粉育性进行复合区间作图。在对YTA的育性恢复性方面,该。RIL群体的2个亲本之间具有明显差异,特青的恢复性较强,其测交F1的小穗育性和花粉育性分别为72％和51％;而Lemont测交F1的小穗育性和花粉育性分别为32％和9％。复合区间作图定位到4个育性恢复QTL,分别位于水稻第1、2和10号染色体上,单个QTL的贡献率在5％～24％之间。其中,除1个QTL的增效基因来源于Lemont外,其余3个QTL的增效基因均来源于特青。效应最大的QTL为qRF-10-1,该QTL位于10号染色体RM258-C16标记区间,对小穗育性表型变异的贡献率为24％,对花粉育性的贡献率为17％,且该QTL被检测到的LOD值显著较高,因此是1个主效QTL,其增效基因来源于特青。除了主效QTLqRF-10-1外,其它3个QTL对性状的贡献率均在10％以下(5％～8％)。由此表明,该RIL群体对红莲型CMS的育性恢复由1个主效QTL控制,并受其它几个微效QTL的影响。该QTL定位结果与小穗育性在测交F1群体中呈连续的双峰分布的结果相一致。与主效QTL qRF-10-1紧密连锁的SSR标记为RM258,该主效QTL可作为分子标记辅助育种的操作目标之一,用于杂交稻分子育种中培育红莲型CMS的强恢复系。     

红莲型水稻细胞质雄性不育花药蛋白质组学初步分析

采用固相pH梯度－SDS PAGE 双向电泳对红莲型细胞质雄性不育水稻(YTA)的不育系和保持系(YTB)单核期花粉总蛋白质进行了分离,通过银染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。Image Master 2D V5.0 软件可识别约1800个蛋白质点,其中差异表达的蛋白质点数为85。将其中16个差异点采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionizaton time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）进行了肽质指纹图分析,通过采用Mascot 软件对MSDB数据库查询,其中9个蛋白质点得到了鉴定。YTA相对于YTB有部分参与碳代谢和淀粉合成的酶缺失或表达量降低,这些蛋白质分别是ADP-葡萄糖磷酸转移酶（AGPase）,UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶,乙酰辅酶A合成酶和二氢硫辛酸脱氢酶等。其中AGPase是参与淀粉合成的蛋白,与花粉发育密切相关。乙酰辅酶A合成酶和二氢硫辛酸脱氢酶是细胞内合成乙酰辅酶A的重要酶,而乙酰辅酶A是进入TCA循环的重要底物,乙酰辅酶A的缺乏可以导致TCA循环不能顺利进行,从而不能提供小孢子发育所需要的大量能量。YTA相对于YTB部分参与碳水化合物代谢的重要酶缺失或表达量降低,有可能导致因线粒体提供的能量不足,淀粉合成受阻,因而花粉不能正常发育。      

水稻籼粳亚种间杂种低温花粉不育的QTL分析

为探明籼粳杂种低温花粉不育的遗传基础,以籼稻品种3037和粳型广亲和品种02428的F2分离群体进行了低温花粉不育的遗传分析。推迟播种后,F2群体各单株孕穗期的日平均温度为21～23℃,调查了F2群体各单株的花粉育性。利用108对SSR引物构建了包含157个F2单株,覆盖12条染色体的分子标记连锁图谱。该连锁图的总长度为1857．8cM,标记间平均距离为16．26cM,标记较均匀地分布在12条染色体上。采用区间作图法对F2群体花粉不育进行QTL分析,共检测到2个低温花粉不育QTLS,即qLTSPS2和qLTSPS5,分别位于第2、5染色体,其加性效应分别为0．021、0．045,显性效应分别为-0．246、-0．251,显性度分别为11．7和4．8,具有超显性效应．超显性是QTL作用的主要方式,这2个位点杂合基因型在低温环境下具有降低花粉育性的作用,分别解释表型变异的15．6％、11．9％。另外,两因素的方差分析表明这两个QTL之间不存在互作。     

Structural and Expressional Variations of the Mitochondrial Genome Conferring the Wild Abortive Type of Cytoplasmic Male Sterility in Rice

The so-called ＂wild abortive＂ （WA） type of cytoplasmic male sterility （CMS） derived from a wild rice species Oryza rufipogon has been extensively used for hybrid rice breeding. However, extensive analysis of the structure of the related mitochondrial genome has not been reported, and the CMS-associated gene（s） remain unknown. In this study, we exploited a mitochondrial genome-wide strategy to examine the structural and expressional variations in the mitochondrial genome conferring the CMS. The entire mitochondriai genomes of a CMS-WA line and two normal fertile rice lines were amplified by Long-polymerase chain reaction into tilling fragments of up to 15.2 kb. Restriction and DNA blotting analyses of these fragments revealed that structural variations occurred in several regions in the WA mitochondrial genome, as compared to those of the fertile lines. All of the amplified fragments covering the entire mitochondrial genome were used as RNA blot probes to examine the mitochondriai expression profile among the CMS-WA and fertile lines. As a result, only two mRNAs were found to be differentially expressed between the CMS-WA and the fertile lines, which were detected by a probe containing the nad5 and orf153 genes and the other having the ribosomal protein gene rpl5, respectively. These mRNAs are proposed to be the candidates for further identification and functional studies of the CMS gene.     

用RAPD标记对栽培稻F1花粉不育基因座S-b定位

S－b是栽培稻F1花粉不育基因座痊之一,在S－b基因座,台中65的基因型为Sj/Sj,而台中65（简称T65）的近等基因系TISL2的基因型为Si/Si,通过F2群体和BC1F1群体的遗传分析表明,台中65和TISL2的F1花粉不育性由一个基因座控制,S－b基因座的等位基因s^i和S^j相互作用,导致携带S^j基因的花败败育,产生染败花粉,用187个RFLP标记和500个RAPD引物分析 了T65和TISL2间的多态性,结果只有2个RAPD扩增片段H08－1300和Y09－H08－1300转化为RFLP标记,经F2群体的共分离分析表明,H08－1300和Y09－1500在F2群体中呈明显的偏态分离,用MAPMAKER／EXP3．0计算,H08－1300和Y09－1500与S-b基因座间的遗传 1．3cM和6．6cM,克隆和测定了H08－1300两侧的部分DNA序列,经同源性分析发现,右末端580bp的序列中有101bp 的序列与水稻第五染色体的克隆P0033D06（注册号：AC079357）有94％的同源性,左末端中540bp的序列中P0033D06有86％的同源性,由于P0033D06为由位于水稻第五染色体定位18．8cM处的标记R3166锚定,结果说明S－b基因座位于水稻第五染色体上,与R3166的遗传距离为1．3cM,同时还讨论了对于应用基因组测序的结果进行RAPD标记染色体定位的方法。     

Characterization and Use of Male Sterility in Hybrid Rice Breeding

The hybrid rice （Oryza sativa L.） breeding that was Initiated In China in the 1970s led to a great improvement in rice productivity. In general, It increases the grain yield by over 20% to the inbred rice varieties, and now hybrid rice has been widely introduced into Africa, Southern Asia and America. These hybrid varieties are generated through either three-line hybrid and two-line hybrid systems; the former is derived from cytoplasmic male sterility （CMS） and the latter derived from genlc male sterility （GMS）. There are three major types of CMS （HL, BT and WA） and two types of GMS （photoperlod-sensitlve （PGMS） and temperature-sensitive （TGMS））. The BT- and HL-type CMS genes are characterized as orf79 and orfH79, which are chimeric toxic genes derived from mltochondrial rearrangement. Rf3 for CMS-WA Is located on chromosome 1, while Rf1, Rf4, Rf5 and Rf6 correspond to CMS-BT, CMSoWA and CMS- HL, located on chromosome 10. The Rfl gene for BT-CMS has been cloned recently, and encodes a mltochondriatargeted PPR protein. PGMS Is thought to be controlled by two recessive loci on chromosomes 7 and 12, whereas nine recessive alleles have been identified for TGMS and mapped on different chromosomes. Attention Is still urgently needed to resolve the molecular complexity of male sterility to assist rice breeding.     

水稻雄性不育突变体ms102的鉴定和基因定位

水稻(Oryza sativa)隐性核雄性不育突变体是第三代杂交水稻技术的核心。为了挖掘优质雄性不育突变体, 该研究通过筛选优质籼稻黄华占(HHZ)的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变突变体库, 获得1个雄性不育突变体ms102 (male sterility mutant 102)。该突变体营养生长正常, 但花药不开裂, 花粉败育。细胞学分析表明, 突变体花药绒毡层不能正常降解, 导致小孢子发育异常; 遗传分析表明, 该突变体的不育表型由1个已报道编码酰基转移酶的DPW2基因突变造成。研究获得了1个隐性核雄性不育突变体, 进一步证实了DPW2基因在水稻花药发育中的功能。