海洋微生物信号降解酶基因aiiA克隆与表达载体的构建

根据已知的微生物信号降解酶基因aliA的序列设计、合成特异性引物探针,以从海洋分离的微生物ZD02的基因组为模板,PCR扩增编码蛋白alia信号降解酶的基因aliA序列,产物经PCR验证后用于构建克隆载体pMD18-ZD02aiiA,并以此克隆载体为模板,以带酶切位点的引物扩增基因,经BamHI和EcoRI双酶切后将其插入表达载体pET-17b,构建原核表达质粒pET—ZD02aiiA。经酶切、PCR鉴定及序列测定等,结果表明：克隆基因已正确插入到载体的多克隆位点,序列和读码框正确,为海洋微生物ZD02信号降解酶基因的体外重组和诱导表达研究打下基础。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建

以TMV复制酶基因作为RNAi的靶向序列,应用RT－PCR法获得目的DNA序列。依据RNAi机制,以酶切后连接的方法将目的DNA序列正向、反向锚定连接到pUCCRNAi载体质粒,构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体;反向重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成双元载体系统的构建。每步的重组子经特异引物PCR验证和酶切验证有相应的特异条带存在,且测序鉴定序列正确。确认成功构建了TMV复制酶基因靶向的RNAi双元载体,为RNAi技术在植物病毒病害防治中的应用奠定基础。     

薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建

利用薄荷挥发油合成途径关键酶之一的薄荷牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS)基因特异引物,扩增得到GPPS基因开放式阅读框(1 131 bp),并将其插入到原核表达载体pET-28a中,经酶切测序验证的重组质粒pET-28a-GPPS转入Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示,终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导后6 h,SDS-PAGE显示薄荷GPPS基因在Rosetta(DE3)中获得高效表达。目前利用RNA干扰技术研究基因功能的方法已日趋成熟,以GPPS大亚基基因为靶目标,成功构建了薄荷GPPS大亚基基因的pBI121-RNAi-GPPS干扰载体。     

人白细胞介素-36受体拮抗剂基因的克隆及序列分析

[目的]构建人白细胞介素-36受体拮抗剂(interleukin-36 receptor antagonist,IL-36Ra)的真核表达载体,并对其基因全长编码区进行分析。[方法]提取总RNA,逆转录出IL-36Ra c DNA序列。设计人IL-36Ra基因的上游引物和下游引物。利用热启动PCR扩增目的基因,将扩增出的IL-36Ra基因编码区通过限制性内切酶酶切后,把酶切的目的片段与载体pc DNA3.1连接,转化到感受态细胞大肠杆菌DH5α中。通过氨苄青霉素抗性筛选、双酶切及菌落PCR鉴定,最后选取阳性克隆进行测序。[结果]重组载体pc DNA3.1-h IL-36Ra经菌落PCR和酶切鉴定,最后通过序列分析证实,其序列与Gen Bank中数据一致。[结论]人IL-36Ra基因的重组真核表达载体pc DNA3.1-h IL-36Ra的成功构建,为进一步研究IL-36Ra在免疫性疾病中的作用奠定了实验基础。     

水蕨(Ceratopteris thalictroides)查尔酮合成酶基因的克隆和表达（英文）

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮化合物合成的关键酶,有关蕨类植物CHS基因的序列及功能信息尚不完善。本研究采用快速扩增c DNA末端(RACE)技术克隆获得了模式蕨类植物——水蕨(Ceratopteris thalictroides)Ct CHS基因(Gen Bank登录号:JX027616.1),其c DNA序列全长为1616 bp,具有3个外显子和2个内含子,开放阅读框(ORF)为1215 bp,编码404个氨基酸。进化树分析表明,Ct CHS与问荆(Equisetum arvense)、松叶蕨(Psilotum nudum)和3种薄囊蕨的查尔酮合成酶基因聚为一枝,说明这些蕨类植物亲缘关系较近且为单系起源。通过构建原核表达体系成功获得Ct CHS蛋白的多克隆抗体并用于免疫印迹分析,结果表明Ct CHS基因的表达明显受紫外光(UV)诱导。Ct CHS基因的克隆与表达分析为进一步研究水蕨类黄酮化合物的合成及其调控机制提供了依据。     

小麦高分子量麦谷蛋白5亚基基因的克隆及其表达载体的构建

小麦麦谷蛋白5亚基直接影响面包的烘烤品质,但我国大部分小麦品种的蛋白中缺少这种亚基。通过引物设计、PCR扩增,从Cheyenne中得到了小麦麦谷蛋白5亚基结构基因(sub5)的全长核苷酸序列(2750bp)和小麦麦谷蛋白5亚基基因启动子(Psub5)的核酸序列(630bp)。测序结果表明：得到了小麦籽粒中特异表达启动子——Psub2和用于改良小麦品质的结构基因——sub5。通过选择和改变相应的酶切位点,在构建6个中间载体的基础上,最后得到了含有目的基因的表达载体pCAM—BIAl301—Psub5—sub5—nos。酶切电泳及PCR鉴定表明：已成功地合成了sub5的表达载体。有希望通过基因工程的方法将该表达载体用于小麦的品质改良。     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆及超量表达对三萜合成的影响

灵芝Ganoderma lucidum是我国传统的药用真菌,三萜类物质是灵芝的主要生物活性成分,甾醇14α-脱甲基酶是三萜合成途径中的关键酶。根据已报道其他物种甾醇14α-脱甲基酶的氨基酸保守序列设计简并引物,获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶特异基因片段,并进一步获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的全长DNA和cDNA序列。其中DNA序列长1,981bp,cDNA序列长1,635bp。结构基因编码蛋白包含544个氨基酸,分子量为61.99kDa,等电点为6.36。将甾醇14α-脱甲基酶基因的cDNA序列克隆到灵芝超量表达载体pGl-GPD中,利用农杆菌介导的转化法实现了甾醇14α-脱甲基酶基因在灵芝内的超量表达。转化子的甾醇14α-脱甲基酶基因在转录水平表达量增加,三萜含量增加。进一步研究发现,三萜合成途径的关键酶基因Gl-aact、Gl-hmgr及Gl-ls的转录表达量也有所增加。     

非小细胞肺癌ROS1及其融合基因CD74-ROS1逆转录病毒载体的构建

目的:利用逆转录病毒载体pBaba-puro构建携带ROS1基因及其CD74-ROS1融合基因的重组载体pBaba-puro-ROS1,pBaba-puro-CD74-ROS1。方法:设计与合成引物,提取组织标本RNA,反转录和PCR扩增,经BamHI和TaqI双酶切,琼脂糖凝胶电泳,切胶回收进行连接转化,并再次酶切鉴定,测序分析。结果:成功构建携带ROS1基因及其CD74-ROS1融合基因的重组载体pBaba-puro-ROS1,pBaba-puro-CD74-ROS1,并通过双酶切与测序鉴定。结论:利用逆转录病毒载体基因重组技术能够成功构建出携带相应基因的逆转录病毒,可用于后续研究。     

灵芝-8基因的番茄果实特异性启动子植物表达载体的构建

构建含有灵芝-8（LZ-8）基因和番茄果实特异性E8启动子的重组载体,并将其转化到根瘤农杆菌中。通过PCR法获取LZ-8基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI121中,获得果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定,将其转入根瘤农杆菌GV3101中。PCR法、限制性内切酶酶切图谱和序列测定分析均表明番茄果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒构建成功。获得了含有LZ-8基因和E8启动子的重组质粒,并成功转化根瘤农杆菌,为下一步LZ-8蛋白在番茄果实中特异表达奠定基础。     

乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列的鉴定及在小鼠乳腺细胞表达LacZ基因的研究

乳清酸蛋白（ＷＡＰ）是小鼠乳中的主要蛋白质．在亚克隆该基因的基础上,对其进行了酶切鉴定,并对该基因５′区进行克隆和序列分析,在核实序列正确后,构建了以其为调控序列,指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒,采用直接注射质粒的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性,从而证实基因调控序列的功能正确性,可以用于转基因动物乳腺表达研究,同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．     

转录因子AP-4基因真核表达载体构建及表达分析

本研究利用生物信息学分析AP-4与胃癌患者临床病理信息的相关性,根据GenBank中人AP-4基因cDNA序列设计并合成特异性引物,以胃癌细胞总RNA逆转录的cDNA为模板,利用高保真酶扩增AP-4基因CDS (Coding DNA sequence)序列并构建入pcDNA3.1+载体,并通过限制性内切酶酶切分析和测序法进行进一步验证;脂质体法将AP-4重组表达载体及对照pcDNA3.1+载体转染胃癌细胞,qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)和Western blotting检测分别检测AP-4在m RNA和蛋白水平的表达。生物信息学分析发现,AP-4的表达与胃癌分期及预后显著相关;酶切及测序分析表明,转录因子AP-4真核表达载体构建成功,并能够在胃癌细胞中实现转录和蛋白水平的高效表达。此研究为深入研究转录因子AP-4在胃癌等肿瘤发生发展中的作用及分子机制奠定了基础。     

2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2,5-DKG）还原酶II基因序列,合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点,抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应,克隆得到2,5-DKG还原酶II基因,酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2,5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下,连接到pBV220载体上,构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力,测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一个碱基,终止密码子发生移码突变而消失。此外在5’端的启始密码子ATG前有三个碱基与pBV220载体上的SD序列发生配对。据此,重新设计和合成了PCR引物,并用pBV220和pBL4载体构建了两个表达载体。42℃诱导表达均得到了稳定的表达条带和较高的酶活力．     

甲基营养菌MP688中启动子探针载体的构建

目的:以半乳糖苷酶基因作为报告基因,构建适于探测甲基营养菌MP688启动子的载体。方法:通过PCR扩增半乳糖苷酶基因片段,连入质粒pCM66构建启动子活性探针载体pMPlacZ。根据MP688的基因组序列设计引物,通过PCR扩增5个pqqA基因、核糖体亚基A基因(rpsA)、核糖体亚基B基因(rpsB)、伴侣分子groel基因和甲醇脱氢酶基因(mdh)等共9个基因的启动子序列,将这9个启动子片段连入pMPlacZ进行活性测定。结果:构建了一个适于探测甲基营养菌MP688的启动子活性的载体pMPlacZ;利用构建的报告系统对MP688中9个基因的启动子进行了活性比较,得到3个与吡咯喹啉醌合成相关的强启动子。结论:构建的启动子活性检测载体可以有效、灵敏地用于MP688强启动子的筛选和启动子活性检测。     

小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定

目的：应用质粒pEGFP-N1构建含小鼠survivin基因的重组真核载体。方法：采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,自行设计一对分别含有HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的survivin基因上下游引物,利用PCR扩增出该基因的全序列cDNA,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1/survivin重组真核表达载体。然后通过卡那霉素抗性筛选、双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序。结果：双酶切与测序结果表明目的基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组真核表达载体。结论：重组真核表达载体pEGFP-N1/survivin构建成功,为下一步研究sur-vivin在未成熟树突状细胞中诱导分化与致耐受作用奠定基础。     

油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建

利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料,设计合成引物,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB（GenBank登录号分别为AF267640和AF267641）,并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA和Prrn等驱动PHB合成途径中3个关键酶基因phbA、phbB和phbC,分别构建表达盒,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序phbC-phbA-phbB相串联,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起,克隆到油菜叶绿体同源片段中,构建成phb基因定点整合载体pRCABZ和pRCABF。酶切及Southern杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。     

油菜叶绿体基因组同源重组片段的克隆及phb基因定点整合载体的构建

利用叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据烟草、水稻和玉米叶绿体基因组全序列资料,设计合成引物,PCR扩增并克隆了油菜叶绿体两个重要的功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为AF267640和AF267641）,并以此作为定点整合源基因的同源重组片段。以来自叶绿体的强启动子PpsbA和Prrn等驱动PHB合成途径中3个关键酶基因phbA、phbB和phbC,分别构建表达盒,并将它们按照其在原始菌株中的自然转录顺序phbC-phbA-phbB相串联,最后连同选择标记基因aadA表达盒一起,克隆到油菜叶绿体同源片段中,构建成pgb基因定点整合载体pRCABZ和pRCABF.酶切及Southem杂交结果证明所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。     

绿色荧光蛋白基因TuMv病毒表达载体的构建

本研究通过设计引物进行PCR扩增得到绿色荧光蛋白GFP基因,将PCR产物酶切以后与芜菁花叶病毒表达载体相连,得到的阳性克隆通过多对引物组合进行PCR验证及序列测定,说明GFP基因已经连接到该病毒表达载体中,而且没有发生碱基误配及错配。该GFP表达载体的构建为进一步利用TuMv的全长cDNA侵染性克隆进行外源基因的转化奠定了基础。     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与功能分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶（NR）基因5′上游序列序列,并对其功能进行分析。方法: 利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI、Xbal 6种限制性内切酶分别酶切盐藻基因组DNA,并与接头连接,构建成盐藻基因组步行文库。采用 LA-PCR方法,从上述盐藻步行基因组文库中扩增NR基因5′上游序列序列,测序并进行分析。为检测其表达特性,构建了该片段与GUS 嵌合基因的表达载体pNR-GUS, 通过电击法将所构建的重组表达载体转化盐藻,组织化学染色法观察GUS的表达。结果: 从盐藻基因组步行文库中扩增出约1200bp特异片段,序列分析表明5′上游序列含有启动子的特征性序列。GUS瞬时表达染色结果显示,该DNA 片段具有硝酸盐诱导和铵抑制的启动子活性。结论：所克隆的盐藻的5′上游序列可能是一种具有"开关"活性的可控性启动子。