盐胁迫下OsDSR2 RNAi转基因水稻的生理特性及转录组学分析

为探究盐胁迫下OsDSR2 RNAi转基因水稻的生理特性和差异基因的表达调控,以中花11(ZH11)植株为对照,对OsDSR2 RNAi转基因水稻幼苗进行生理特性和转录组学分析,结果表明:正常条件下,ZH11和Os DSR2 RNAi转基因水稻中叶绿素含量和根部Na+/K+均显著低于ZH11,其他各项生理指标均没有显著性差异,而盐胁迫处理后,Os DSR2 RNAi转基因水稻中的叶绿素含量、可溶性糖(SS)含量、过氧化氢酶(CAT)活性与ZH11相比没有明显变化,但转基因植株中的细胞膜透性、丙二醛(MDA)含量、Na+/K+显著或极显著低于ZH11,脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性显著或极显著高于ZH11。Os DSR2 RNAi转基因水稻在盐胁迫前后共产生68个差异表达基因,其中有55个上调表达,13个下调表达。GO分析结果显示,差异表达基因主要富集在胁迫应激反应、分解代谢等生物学过程中。KEGG分析结果表明,差异表达基因主要参与类胡萝卜素生物合成、油菜素内酯生物合成以及表皮素,软木脂和蜡质生物合成代谢通路中,进一步通过RT-q PCR验证了Osb ZIP16、Os LEA3、RAB21等差异表达基因参与水稻的胁迫应答反应。综上,在生理层面上,Os DSR2 RNAi转基因水稻主要通过降低细胞膜透性、MDA含量和Na+/K+,增加Pro含量,提高SOD和POD活性,抑制叶绿素的降解来提高耐盐性;在分子水平上,Os DSR2主要通过脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BR)信号通路参与调控Osb ZIP16、Os LEA3、RAB21等逆境相关基因的表达来提高苗期水稻的耐盐性,为进一步阐明Os DSR2参与调控水稻耐盐的详细分子机制奠定基础。     

过量表达NtRopl基因增加了植物对盐胁迫的敏感和过氧化氢的含量

Rop／Rbo类的小G蛋白是一类重要的信号分子,它在植物的生长发育过程中起着重要的调控作用．根据已知的序列信息,我们从烟草中克隆得到了编码NtRopl基因的基因组序列,并研究了该基因在不同胁迫处理下的表达情况及转基因植物在盐胁迫下的反应,该基因的基因组中含有7个外显子和6个内含子,半定量RT-PCR表明,该基因的表达受到NaCl,甲基紫精（MV）和1．氨基环丙烷－1－羧酸（ACC）的诱导,而脱落酸（ABA）抑制该基因的表达,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥增加了对盐胁迫的敏感性,具体表现为,在盐胁迫下,转基因植株根的长度明显比对照短,并且相对电导率也明显比对照高,通过对过氧化氢含量的测定发现,转基因拟南芥的过氧化氢的含量比对照高,这表明NtRopl基因可能是通过增加植物体内过氧化氢含量从而导致植物对盐胁迫的敏感性。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控。构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)植物和水稻(OryzasativaL.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因。转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高。这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达。在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节。     

水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

羊草LcPIP基因遗传转化露地菊及其抗盐性鉴定

PIP是重要的水孔蛋白之一,与植物的抗逆性有关。本文用叶盘法将羊草LcPIP遗传转化露地菊火焰,通过常规PCR和GUS染色方法鉴定转基因株系,Real-time PCR检测盐胁迫下转基因和野生植株中CmPIP1和CmPIP2的相对表达量,并测定SOD、POD活性和MDA含量。结果显示,在转LcPIP基因的露地菊植株叶片中,CmPIP1和CmPIP2基因表达量均上升,是野生型植株的2倍;根部的CmPIP1与CmPIP2基因的表达量均上升,CmPIP1上升程度高于CmPIP2。在200 mmol·L~(-1) NaCl的胁迫下,野生型植株中CmPIP1基因表达量明显下降,而转基因植株中CmPIP1基因表达量在12~48 h出现明显的上升;在盐胁迫12 h后,转基因植株中CmPIP2基因表达量上升程度明显高于野生型植株。盐胁迫12 h后,转基因植株的SOD活性提高更为明显。在盐胁迫前期(0~24 h)转基因植株MDA含量增加幅度低于野生型植株;在盐胁迫后期(48~72 h)转基因露地菊POD活性出现明显上升,而野生型露地菊呈下降趋势。     

盐胁迫下大豆转录因子GmTFIIIC功能研究

大豆是中度耐盐植物,土壤盐碱化会对大豆产量及品质造成严重影响。因此挖掘耐盐基因,提高大豆耐盐能力十分必要。真核生物中,转录因子TFIIIC作为RNA聚合酶III转录机制的辅助因子,其转录活性易受到外部因素的影响,进而影响tRNA基因转录效率和蛋白质的合成。本课题组前期研究发现大豆GmTFIIIC在盐胁迫下上调表达,但目前大豆GmTFIIIC的抗逆功能还不清楚。本研究通过大豆发状根体系,将GmTFIIIC基因过表达,进行盐胁迫下转基因复合体植株表型及生理指标分析,研究大豆GmTFIIIC基因在盐胁迫下的功能。结果表明:GmTFIIIC基因过表达,盐胁迫条件下,大豆转基因复合体根、茎的Na+/K+要低于野生型空载对照;叶片叶绿素相对含量高于野生型空载对照;叶片H2O2和O-2含量低于野生型空载对照;叶片含水率高于空载对照,表明大豆发状根中过表达GmTFIIIC基因提高了大豆转基因复合体的耐盐能力。研究结果为大豆GmTFIIIC基因耐盐功能研究提供理论基础。     

水稻含有B-box锌指结构域的OsBBX25蛋白参与植物对非生物胁迫的响应

锌指蛋白在调控植物生长发育和应对逆境过程中发挥着重要作用.为进一步研究锌指类蛋白参与植物非生物胁迫响应的分子机制,对水稻(Oryza sativa)中一个编码含有B-box锌指结构域蛋白的OsBBX25基因进行了功能分析.OsBBX25受盐、干旱和ABA诱导表达.异源表达OsBBX25的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)与野生型相比对盐和干旱的耐受性增强,且盐胁迫条件下转基因植物中KIN1、RD29A和COR15的表达上调,干旱胁迫下KIN1、RD29A和RD22的表达上调.外源施加ABA时,转基因植物的萌发率与野生型之间没有明显差异.OsBBX25可能作为转录调控的辅助因子调节胁迫应答相关基因的表达,进而参与植物对非生物胁迫的响应.     

LeERF2基因对旱稻耐盐性的影响

采用T2代转LeERF2基因旱稻(旱297)为材料,研究分蘖期盐胁迫下植株光合性能和生理反应.结果表明,50 mM NaCl胁迫条件下,转基因植株(T)和野生型对照(WT)的各项光合参数差异不明显,但在100 mM NaCl胁迫条件下,转基因植株仍能维持较高的光合速率和气孔导度.随着NaCl胁迫浓度增加,野生型旱稻和转基因旱稻植株叶片SOD活性增加幅度加大,但都表现为转基因植株增幅更明显,而MDA含量则表现为野生型植株增幅更明显,表明LeERF2基因增强了旱稻盐胁迫下抗氧化能力,提高了耐盐性,能维持较高光合速率.     

谷胱甘肽转移酶基因过量表达能加速盐胁迫下转基因拟南芥的生长

盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶基因(glutathione s-transferase gene,GST)克隆到植物表达载体pROKⅡ35s启动子的下游,通过农杆菌介导,利用花絮浸泡法转化拟南芥.转化子在含有卡那霉素的培养基上经过筛选以后,将初步验证为阳性的转基因植株通过PCR-Southem进一步证实.经过选育,筛选并分离到卡那霉素的抗性并且遗传稳定的T3代纯合子转基因拟南芥品系.通过Northern杂交证实外源基因在转基因拟南芥中表达.在盐胁迫条件下,通过测量转基因植株(GT)和野生型植株(wY)的生物量和谷胱甘肽(氧化型:GSSG;还原型:GsH)发现:转基因植株的生物量较野生型有一定程度的提高;GssG含量在转基因品系中比野生型的含量明显高.因此,过量表达GsT能够提高转基因植株在盐胁迫条件下的生长,而且这很可能是由于还原型谷胱甘肽被氧化的结果.     

OsPHGPx基因的过量表达增强水稻抗氧化能力

植物在生物或非生物胁迫下会通过表达磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)来抵御胁迫引起的氧化损伤,但是PHGPx在植物体内抗氧化途径中所扮演的生理角色目前尚不完全清楚。利用农杆菌遗传转化技术,构建了过表达Os PHGPx基因的转基因水稻,并对转基因水稻进行了PCR、实时定量PCR以及Western blot等检测分析,结果表明Os PHGPx基因已成功转入水稻并正常表达。与野生型水稻相比,这些过量表达Os PHGPx的转基因水稻抵御百草枯氧化伤害的能力提高。     

水稻NHX1基因启动子和C末端的调控功能研究

为了解水稻Na+/H+逆向转运蛋白(OsNHX1)在植物应答非生物胁迫中的分子调控机制,采用RT-PCR方法克隆OsNHX1基因上游2 000bp的启动子序列,并通过基因枪轰击瞬时转化洋葱表皮细胞,检测不同非生物胁迫下启动子的活性和表达模式;同时,分别克隆全长和C末端缺失的OsNHX1基因,通过花序浸染法转化拟南芥,研究OsNHX1基因及其C末端的功能。结果显示:OsNHX1启动子受逆境胁迫诱导,在盐、干旱、脱落酸胁迫处理下GUS表达活性明显升高;过表达OsNHX1的转基因拟南芥中,种子萌发率、根长、丙二醛含量和相对含水量的测定结果均显示其胁迫耐受性得到改善,但过表达OsNHX1C末端缺失基因对转基因植株的胁迫耐受性无明显影响。研究表明,Na+/H+逆向转运蛋白有助于提高植物耐盐性,且其C末端区域对该转运蛋白活性的发挥具有关键作用。     

过表达SmERF1提高了丹参耐盐性

ERF(ethylene-responsive factor)蛋白是植物中一大类转录因子家族,在植物的生长发育及逆境胁迫中发挥着重要作用.为研究丹参中新的转录因子SmERF1的功能,本研究对其编码序列、表达模式进行分析,并在丹参中进行过表达,检测过表达后转基因植株耐盐性、次生代谢物和激素的变化.研究结果表明,SmERF1含有一个AP2结构域,是典型的ERF转录因子.SmERF1受到MeJA和酵母诱导子(YE)的诱导表达.在盐胁迫下,过表达SmERF1的丹参株系中脯氨酸含量、SOD和POD活性较野生型丹参植株高,MDA含量降低,说明转基因株系的抗盐特性增强.而且过表达SmERF1的丹参株系中ABA含量升高,GA含量降低;过表达SmERF1对丹参酮、丹酚酸等代谢物的合成调控效果不强.综合以上结果,表明SmERF1可能通过调节ABA的合成,提高了丹参耐盐性.     

沙冬青脱水素基因提高转基因紫花苜蓿的耐旱性

为鉴定转基因紫花苜蓿的耐旱能力,本研究以转基因紫花苜蓿T0代植株为材料,通过干旱胁迫,从转基因植株的表型、生理指标和分子水平等层面检测转基因植株的抗旱特性,试验表明,干旱胁迫后转基因苜蓿和对照的茎、叶片全部干枯,而复水后转基因苜蓿大部分恢复生长,对照几乎全部死亡。干旱胁迫后苜蓿叶片的Pro和MDA含量均随处理时间延长而逐渐增加,转基因植株叶片的Pro含量高于对照,而其MDA含量低于对照植株,且二者均达到了显著差异;转基因苜蓿的离体叶片失水率也明显低于对照。在20%PEG胁迫下,植株体内ProDH和P5CS基因的相对表达量都是先升后降,转基因植株和对照中ProDH和P5CS基因的表达量显著增加,且二者在转基因植株与对照间存在显著差异。这表明,在干旱胁迫条件下,由于AmDHN基因在紫花苜蓿中的过量表达,可能引起植株体内脯氨酸的大量积累,并进一步诱导脯氨酸合成相关基因的表达,最终引起植株抗旱性的提高,因此,推测转基因苜蓿的耐旱性比对照强。     

转BADH基因水稻幼苗抗盐性研究

以转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因水稻品系52-7的受体亲本中花8号、旱作品种开系7和陆稻白珍珠为对照,分别用含0、5、7 g?L-1NaCl的水稻专用营养液培养水稻幼苗,对转BADH基因水稻品系52-7的抗盐性及其机理进行研究.结果表明:在正常培养条件下,转基因水稻幼苗比对照品种长势旺,根系活力强,可溶性糖和叶绿素含量高,抗氧化酶SOD和POD活性高.在盐胁迫条件下,水稻幼苗生长减慢,根冠比值减小,根系活力增强;膜透性和丙二醛(MDA)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性提高;脯氨酸和可溶性糖含量升高,叶绿素含量下降,蛋白质分解加强;且随着盐浓度的升高各指标变化幅度增加.与对照品种比较,转基因水稻幼苗在盐胁迫下的生长量和根冠比较大,电解质相对渗出率和MDA含量较低,蛋白质和叶绿素分解较少,表现出较强的抗盐性.盐胁迫下转基因水稻幼苗比对照品种具有更高的脯氨酸和可溶性糖含量以及SOD和POD活性,使其抗盐性强.     

无苞芥锌指蛋白基因OpZFP提高烟草耐盐性的研究

旨在研究C2H2型锌指蛋白在植物生长发育、非生物胁迫信号转导过程中的作用。前期从新疆无苞芥中克隆的一个单锌指基因Op ZFP,利用叶盘法将Op ZFP基因转入普通烟草中。半定量RT-PCR表明,在转基因植株中Op ZFP基因能够高效表达。烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株的根长要长于野生型植株,且转基因烟草丙二醛(MDA)的含量要明显低于野生型植株;并且高盐胁迫处理,野生型烟草离体叶片叶绿素降解率高于转基因植株。这些结果表明,过量表达Op ZFP的转基因植株可以提高植物对盐胁迫的抗性。     

AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响

为了研究AtNHX5基因在植物耐盐中的作用,构建了植物过量表达载体pROKⅡ-AtNHX5,并转化拟南芥。结果显示:(1)RT-PCR检测表明,转基因拟南芥中AtNHX5基因的表达大幅提高。(2)对转基因纯合株系进行耐盐性分析显示,AtNHX5过量表达提高了植株在种子萌发和苗期的耐盐性。(3)转基因植株在盐处理下的干重、鲜重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。在200mmol/L NaCl处理下,以转基因株系a1-4为例,其地上部分单株鲜重、单株干重、K+含量分别是野生型的1.27、1.54、1.16倍,较野生型显著升高。研究表明,过量表达AtNHX5基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收,转基因拟南芥的耐盐性明显提高。     

异源表达AtCYSa基因烟草的耐盐和抗虫特性分析

植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物防御生物与非生物胁迫过程中发挥着重要的作用。拟南芥中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYSa基因的表达能够受到多种胁迫的诱导,且在拟南芥中过量表达AtCYSa基因可以增强转基因拟南芥抵御盐、干旱和氧化等非生物胁迫的能力。为了进一步探究AtCYSa基因的功能以及在烟草中的应用,构建了植物表达载体pCAMBIA 1302-AtCYSa。通过PCR以及RT-PCR验证共获得4株阳性转基因烟草,选择其中3株转基因烟草进行盐胁迫处理和抗虫活性实验。在盐胁迫处理中,100mmol/L NaCl和200mmol/L NaCl处理组的丙二醛含量显著低于野生型对照组。伊文思蓝染色和细胞相对活性结果表明,转基因烟草的细胞活性比野生型烟草明显偏高。这说明在盐胁迫处理下,AtCYSa基因的表达能够起到保护转基因烟草的作用。抗虫活性研究发现,实验组的幼虫总重均呈明显的下降趋势,且幼虫死亡率显著高于对照组。这些结果表明,AtCYSa基因在烟草中的过量表达能够增强转基因烟草的耐盐以及抗虫的能力。     

转反义OsRACK1 基因增强水稻抗旱能力

RACK1是一种多功能支架蛋白, 广泛参与植物生长发育过程的调节。利用反义RNA技术抑制水稻(Oryz a sativa)RACK1基因的表达, 分析了RACK1基因在响应干旱胁迫中的功能。采用实时定量PCR对获得的转基因植株的RACK1基因表达进行分析, 结果表明转基因水稻RACK1基因表达受抑制程度达到50%左右。与非转基因水稻(对照)相比, 转基因水稻耐干旱能力强, 膜脂过氧化程度低且丙二醛的含量少, SOD活性高。这些结果表明, RACK1蛋白负调节水稻对干旱胁迫的耐受过程, 并且这种调节作用在很大程度上与植株体内的氧化还原系统有关。     

陆地棉GhCDPK1基因响应干旱胁迫的功能初探

钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)是一类重要的钙信号感受蛋白和响应蛋白,在植物干旱、低温、盐碱等非生物胁迫应答中起着重要的调控作用。为探讨陆地棉GhCDPK1基因在干旱胁迫下所起的作用,该研究利用实时荧光定量PCR技术分析了PEG模拟干旱胁迫下该基因的表达量,发现GhCDPK1基因受干旱胁迫诱导。通过构建植物表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK1,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,发现干旱胁迫下转基因植株保水能力明显高于野生型植株,叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白含量及POD、SOD活性也高于野生型植株,而丙二醛含量低于野生型植株。研究结果表明,GhCDPK1基因作为正向调控因子响应干旱胁迫诱导,过表达GhCDPK1基因可以使植株积累更多的渗透调节物质、增强抗氧化系统酶的活性和维持细胞膜的稳定性来提高植物抵御外界干旱胁迫的能力。     

高粱ATP合成酶E亚基基因(SbATPase-E)的克隆及其抗逆功能研究

高粱是一种抗旱性较强的禾谷类作物。本研究在高粱中克隆到一个全长为693 bp的编码ATP合成酶E亚基的基因(SbATPase-E)。在高粱幼苗期,SbATPase-E基因受Na Cl和脱落酸(ABA)处理诱导上调表达。该基因在拟南芥中过量表达可提高转基因植株的耐旱性和耐盐性,在逆境胁迫条件下转基因拟南芥植株较野生型植株根系发达,可能是转基因植株耐旱性和耐盐性提高的主要原因。在干旱胁迫条件下,转基因植株中DREB2A、P5CS1、RD29A、RAB18和ABI1基因的表达量相对于野生型植株中的表达量提高更为显著;在高盐处理条件下,转基因植株中SOS1和SOS2基因的表达量也较野生型植株中的表达量明显提高。这些抗逆相关基因的上调表达可能是转基因植株抗逆性提高的主要分子机制。