大豆再生相关基因GmARF的生物信息学及表达分析

生长素响应因子(auxin response factor,ARF)在植物生长和发育中起到了非常关键的作用。本研究利用实验室前期转录组测序技术得到的差异表达基因Gm ARF,并应用PLACE数据库、Interpro、expasy数据库、SOPMA、Phyre、Protscale、MEGA5等工具对该基因的启动子元件、编码氨基酸的功能、亲水性、等电点、二级结构、三级结构、同源进化树及KEGG通路进行分析。并研究了对其在外源激素处理下的表达分析。结果表明:其前体序列具有很多与再生相关的响应元件,理论等电点为6.28,稳定系数为60.45,属于不稳定蛋白,Gm ARF编码的蛋白属于生长素蛋白,有一个B3超家族的保守结构域,一个生长素响应因子,以及一个PB1结构域,二级结构中23.33%为α螺旋结构,49.67%为不规则卷曲,8.59%为α转角,18.42%为延伸链,三级结构共有194个氢键,9个螺旋结构,32个转角结构,亲水性平均系数为-0.497,Gm ARF基因与苜蓿亲缘较近,其KEGG通路属于植物激素信号调节通路中色氨酸代谢途径,q RT-PCR结果表明在外源激素处理下,Gm ARF的表达量显著提高,说明Gm ARF基因作为正调控因子参与大豆再生过程。本研究的初步结果对今后进一步研究该基因的功能,提高大豆再生率,建立稳定的大豆再生体系提供了理论基础。     

大豆PM34基因生物信息学预测及表达分析

以大豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR法从吉豆2号品种中克隆获得大豆种子成熟蛋白( PM34)基因序列,利用生物信息学方法对大豆PM34基因编码的蛋白进行预测。结果表明：该基因编码蛋白理论分子量为31.7 kDa,等电点为6.60,为亲水性蛋白;该蛋白中无跨膜结构;该蛋白中不存在信号肽。 PM34基因编码蛋白的二级结构中α螺旋占12.97％,无规则卷曲占41.30％,β折叠占45.73％。 PM34基因编码蛋白的三级结构预测表明,同源模建的模板是3ijr.1.A,是一种短链脱氢酶/还原酶,与该蛋白的同源性为54.65％。在进化关系上,与绿豆、苜蓿的亲缘关系相对较近。采用实时定量PCR方法( qRT-PCR),检测大豆PM34基因在大豆各器官中的表达方式,结果表明该基因在大豆根、茎、叶、花中的表达活性低,而在种子中,尤其是成熟种子中的相对表达活性很高。该研究结果为大豆PM34基因结构和功能的进一步研究奠定了基础。     

大豆再生相关基因GmBIN2的克隆及生物信息学分析

根据前期实验获得的大豆Gm BIN2基因登录号,从大豆中克隆Gm BIN2基因的全长CDS序列,得到大豆Gm BIN2基因。对大豆再生相关基因Gm BIN2的启动子序列、氨基酸序列、编码的蛋白质结构、亲疏水性以及同源进化树进行分析,结果表明,大豆再生相关基因Gm BIN2编码区c DNA长度为1 125 bp,编码374个氨基酸,Gm BIN2编码的蛋白为亲水性蛋白;分析其蛋白功能结构域发现,Gm BIN2蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化域,为PKc-like超家族成员;构建系统进化树发现其与野生大豆亲缘较近。本研究的实验结果有利于更加深入的研究Gm BIN2基因在大豆再生过程中的关键作用,为提高大豆再生效率提供依据。     

鳗弧菌flaE基因的克隆及蛋白结构分析

[目的]:克隆鳗弧菌flaE基因并分析其蛋白结构,为研究该蛋白的生物学功能及免疫原性奠定基础。[方法]通过PCR方法对鳗弧菌flaE基因进行扩增,利用生物学软件对其序列及蛋白质结构进行分析。[结果]所得flaE基因的大小为841bp,其开放阅读框长度为798 bp,编码262个氨基酸。蛋白分子质量为28 411.4,理论等电点p I为5.70,脂肪系数为81.60,不稳定系数为31.81;为疏水性蛋白;没有信号肽和跨膜螺旋结构;保守区结构域属于flagellin家族;二级结构中以α螺旋为主,其次是无规则卷曲和β片层,少量β转角;三级结构与3k8v.1.A的结构模型相似率为90%。[结论]成功克隆了鳗弧菌flaE基因,Gen Bank登录号为KM091934。     

黑曲霉C112纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析

以紫外诱变获得的高产纤维素酶黑曲霉C112菌株为模板,采用RT-PCR技术克隆黑曲霉C112的纤维二糖酶基因bgl(Gen Bank登录号:KP307454);该基因全长2 934 bp,含有非编码序列,编码860个氨基酸,等电点为4.70,核酸序列与数据库的Aspergillus niger(Gen Bank登录号JX982101.1)同源性达到了99%;生物信息学分析表明,纤维二糖酶为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白;二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件;该基因经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测结果表明,重组表达产物的相对分子量约为93.3 k D,与预期相符;纤维二糖酶在大肠杆菌BL21中胞内融合表达,重组蛋白p NPG酶活为5.847U/m L,最适反应温度为50℃,最适p H值为5.0。     

棉卷叶野螟泛素基因的克隆、序列分析及原核表达

本研究用RT-PCR方法,克隆了棉卷叶野螟Haritalodes derogata (Fabricius)泛素基因编码区,GenBank登录号为EU580145。序列分析表明,该编码区长228 bp,编码76个氨基酸,推测的编码蛋白的相对分子质量和等电点分别为8.53 kD和5.83。同源性比较发现,棉卷叶野螟泛素基因与其他10种昆虫泛素基因在氨基酸水平上具有93%以上的相似性。系统发育树显示棉卷叶野螟与斜纹夜蛾Spodoptera litura (Fabricius)遗传距离较近,通过同源建模获得了该棉卷叶野螟基因编码蛋白的理论三维结构。将棉卷叶野螟泛素基因与pET-32a(+)连接,构建原核表达载体pET-32a-ub,经IPTG诱导,棉卷叶野螟泛素基因在大肠杆菌BL21(DE3) 中高效表达。本研究成功克隆了棉卷叶野螟泛素基因的编码区,并经Western blotting分析证明实现了该基因的原核表达,为进一步研究其在该昆虫体内的作用机理奠定了基础。     

茶树CsGME1基因的克隆与逆境胁迫响应分析

该研究基于茶树转录组和基因组信息,以茶树‘龙井43’为实验材料,从其cDNA中克隆获得茶树CsGME1基因,并对其蛋白序列特征、基因表达模式及其在不同非生物胁迫下的表达水平进行实时荧光定量分析。结果显示:(1)茶树CsGME1开放阅读框长度为1131 bp,编码376个氨基酸;该序列与多个相关物种的GME氨基酸序列一致性为94.25%,均含有NAD结合域。(2)进化树分析表明,茶树CsGME1基因与番茄SlGME1亲缘关系较近,与水稻OsGME2亲缘关系最远。(3)CsGME1蛋白属于亲水性蛋白,理论相对分子量为42046.84 Da,理论等电点为5.73,具有4个无序化区域,无序化程度较低;CsGME1蛋白二级结构由39.25%α-螺旋,13.26%延伸主链,5.84%β-转角和41.38%随机卷曲组成;三级结构分析结果显示,CsGME1包含螺旋和随机卷曲,与二级结构吻合。(4)荧光定量分析结果显示,在高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(20%PEG)和高盐(200 mmol·L-1 NaCl)4种非生物胁迫处理下,茶树CsGME1基因均有响应,且表达存在差异,推测CsGME1参与了茶树的逆境胁迫响应过程。     

大豆GmLEC2基因的生物信息学及表达分析

AtLEC2基因最早发现于拟南芥中,是参与体细胞胚胎发生与种子发育过程的重要基因,在植物生长和发育过程中起着非常关键的作用。本研究选择功能已知的AtLEC2基因作为参考,对大豆GmLEC2基因的启动子元件、蛋白的功能、等电点、脂肪指数、亲水性、不稳定系数、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、二级结构、三级结构和结构域进行预测分析。并采用荧光定量RT-PCR方法对GmLEC2基因的组织特异性表达进行分析。本研究的结果为今后进一步研究该基因的生物学功能提供了理论基础。     

番茄LeABI3基因的生物信息学分析

对所克隆到的番茄LeABI3基因测序结果进行序列分析,发现得到LeABI3基因的2种转录本.应用生物信息学的方法和工具对LeABI3蛋白质的理化性质、跨膜区域、疏水性/亲水性、二级结构、结构功能域和同源树进行分析,结果表明此蛋白是包含一个保守B3结构功能域的亲水性不稳定蛋白,相对分子量为65.4 kD,等电点为6.54,可能存在2个跨膜区域.蛋白质二级结构中的主要构成元件是α-螺旋和不规则卷曲,蛋白质同源分析发现番茄LeABI3和马铃薯vp1-ABI3类蛋白相似度最高,同源性为89%.     

大豆E2泛素结合酶基因GmUBC1的克隆及在拟南芥中的异源表达

E2泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)参与植物的抗逆、生长发育等多种生物途径的调控,其功能研究在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的报道较多,但在重要经济作物大豆(Glycine max)中鲜有报道。本研究从大豆"南农94-16"中克隆了1个与大豆子叶折叠突变体可能相关的基因Glyma.12G161200,序列分析结果表明该基因编码一个E2泛素结合酶,因此将其命名为GmUBC1。该基因编码区全长为462 bp,编码一个含153个氨基酸的蛋白,预测其分子量为17.25 kDa,等电点为6.74。利用qRT-PCR技术对GmUBC1在大豆不同组织中的表达模式及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式进行分析,发现该基因在开花后40d种子中表达量最高,在PEG、低温、JA和ABA处理下表达下调。亚细胞定位分析发现GmUBC1蛋白在整个细胞内都有表达。进一步在拟南芥中异源表达GmUBC1,发现转基因株系的千粒重和总氨基酸含量显著提高,表明异源过表达GmUBC1可以调控种子重量和氨基酸含量,为大豆品质改良提供了基因资源。     

昆虫病原菌(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI克隆及生物信息学分析

本研究旨在对昆虫病原菌玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI进行克隆、测序及相关生物信息学分析.序列分析结果显示:IfCHI基因编码区全长为1152bp,编码383个氨基酸,理论等电点(pI)D为9.72,属不稳定水溶性蛋白,其二级结构为混合型,蛋白质溶剂可及性主要分为三类,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,同源序列分析及多重序列比对分析存在明显的差异.该昆虫病原菌玫烟色棒束孢IfCHI编码基因的成功克隆及生物信息学分析,为进一步研究病原菌CHI基因的遗传特性和表达机制以及为寻找更多的查尔酮类化合物提供了理论基础.     

芒果APl同源基因的克隆及其生物信息学分析

我们采用RT-PCR方法克隆了2个APl同源基因全长cDNA,分别命名为MAPl-1(GenBank accession No.FJ529206)和MAPl-2(GenBank accession No.FJ529207).MAPl-1编码247个氨基酸,开放阅读框长度为741 bp,蛋白质分子量为28.54kD,等电点为8.31;MAPl-2编码248个氨基酸,开放阅读框长度为744 bp,蛋白质分子量为28.78 kD,等电点为8.70.同源性分析表明,它们的核苷酸序列与其它木本植物APl同源基因的一致性为72%～81%.实验分析表明,MAPl-1和MAPl-2第1至第61个氨基酸含有一个MADS盒结构域,第88至第178个为K盒结构域;两个基因均定位于细胞核,且功能位点分布存在着不同,推测这两个基因在花器官发育过程中的功能存在差异.蛋白二级结构预测显示,MAPl-1蛋白有12个a-螺旋,4个β折叠区,14个β-转角;而MAPl-2蛋白有11个a-螺旋,5个β折叠区,15个β-转角:其大多数氨基酸具有亲水性.本研究有助于进一步了解芒果的开花分子机理及成花的生物学发育阶段.     

重叠延伸PCR法扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因及生物信息学分析

利用重叠延伸PCR技术扩增EB病毒BZLF1N-BLRF2融合基因,构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并进行了蛋白的诱导表达。通过序列测定和ORF软件分析,该融合基因含有1个1 005 bp的ORF,编码335个氨基酸。应用生物信息学方法,对该融合基因编码的蛋白ZtaN-p23从氨基酸组成、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、二级结构、亚细胞定位、功能域和高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明,该蛋白的预测分子量为46.2 kD,理论等电点约为8.97,是亲水性蛋白,推测它定位于细胞质中。序列分析表明,该蛋白可能具有信号转导、转录调控、免疫应答等功能。预测的二级结构及三级结构都表明该蛋白含有较多的不规则卷曲和α-螺旋,三级结构上呈对称形状。     

葡萄VvBAP1基因的克隆及表达特性分析

以抗性葡萄品种‘F-242’组培苗为材料, 利用同源克隆法克隆了葡萄VvBAP1基因。测序结果显示, VvBAP1扩增片段大小为531 bp, 可编码176个氨基酸序列。利用生物信息学分析VvBAP1基因编码的蛋白序列显示, 该蛋白分子量为19.43 kDa, 含有保守的钙离子依赖性的C2结构域; 等电点pI为9.42; 不稳定系数为37.09, 推测为稳定的亲水性蛋白; 含有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。实时荧光定量PCR表明, 该基因在根茎叶中均有表达, 其中在叶片中表达量较高; 盐胁迫、低温等逆境因子及逆境相关的信号物质, 如水杨酸和一氧化氮均可诱导VvBAP1的表达, 其中低温对其表达量影响更为显著, 推测该基因参与了葡萄抵御逆境胁迫的过程, 尤其是与低温相关的过程。     

马铃薯StDof5的克隆及表达分析

【目的】DNA binding with one finger(Dof)基因家族是植物特有的转录因子在植物生长发育和胁迫响应中发挥重要作用。研究Dof转录因子在马铃薯响应逆境胁迫特别是盐胁迫中的功能与机制,为获得抗盐逆境胁迫新品种提供一定的理论和技术基础。【方法】克隆StDof5,并对其进行生物信息学分析,通过同源重组的方法构建StDof5过表达载体,转化马铃薯得到阳性植株,并对其表达进行分析。【结果】StDof5的CDS全长498 bp,编码165个氨基酸,分子式为C800H1236N242O246S9,StDof5原子个数2 533个,相对分子量为18 468.63 kD,等电点是8.47,脂肪族指数为51.45,不稳定系数为45.16,预测该蛋白为不稳定蛋白。预测得到的跨膜螺旋个数为0,其属于非跨膜蛋白。StDof5蛋白亲水性平均值为-0.876,预测该蛋白属于亲水性蛋白。StDof5蛋白二级结构预测结果显示α螺旋占20%,β转角占0,延长链占9.7%,无规卷曲占66.06%。盐胁迫表型试验表明,过表达植株（OPs）比野生型（DES）的株高、鲜重均有明显程度上升,但根长、根数和叶...     

铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶基因的克隆与原核表达

应用同源序列克隆法克隆了铁皮石斛蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因cDNA全长,并进行了原核表达分析,为进一步研究该基因的时空表达、功能分析及多糖合成机理提供理论依据。结果表明:(1)铁皮石斛SPS基因cDNA全长3 502bp,编码区3 186bp,GenBank登录号JF423929。该基因编码1 061个氨基酸,与文心兰的SPS基因氨基酸序列的一致性最高为93%,与其他科植物SPS基因的氨基酸序列的一致性均高于60%。(2)原核诱导表达结果显示,SPS基因在大肠杆菌中的重组蛋白分子质量约为118.7kD,其表达与序列分析推测的结论一致。(3)生物信息学分析表明,铁皮石斛SPS基因的二级结构包括了螺旋、β-折叠和无规则卷曲,是非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白,有2个功能结构域,分别是蔗糖合成功能域及糖基转移功能域。     

慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是调控植物木质素生物合成的关键酶,本文以慈竹为材料,利用RT-PCR技术克隆慈竹C3H基因,并对其进行生物信息学分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 581 bp,编码区为1 539 bp,编码512个氨基酸,蛋白分子量为58.33KD,等电点为9.09;氨基酸序列和结构分析显示C3H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白,这三种编码蛋白很可能定位在内质网(膜)上,其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链的含量较少,都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JF693629,可能与慈竹木质素的生物合成有关。     

海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。     

葡萄VvSUN基因的克隆及其控制果形功能初探

SUN基因是控制番茄果实形状的主效基因。该研究从NCBI中查找与番茄SUN相似性最高的葡萄序列,设计特异性引物,采用RT-PCR技术从‘天山’葡萄花穗中克隆出该序列,命名为VvSUN基因。序列分析表明,VvSUN基因开放阅读框长度为1 278bp,共编码425个氨基酸;预测蛋白质分子量为48.11kD,理论等电点为10.63。VvSUN蛋白不具有信号肽,为非跨膜蛋白,可能定位于细胞核和线粒体膜上,属于亲水性蛋白;二级结构分析表明α螺旋和无规则卷曲是VvSUN蛋白中主要的结构元件。VvSUN基因编码的氨基酸具有IQ保守结构域,与NCBI中其他7种植物IQD家族成员基因序列相似性在43%~53%;系统进化树分析表明,VvSUN基因与拟南芥IQD12基因亲缘关系最近;推测葡萄VvSUN蛋白质与番茄SUN蛋白质具有相似的功能。荧光定量PCR分析表明,VvSUN基因在两个葡萄品种中均在盛花期表达量最高,花后果实中的表达量均较低;GA3处理后果实果形指数显著增大,且幼果中VvSUN基因表达量明显上升。研究推测葡萄VvSUN基因可能参与果形拉长的调控。