肺癌相关肿瘤抗原基因的分离及鉴定

通过分离肺癌肿瘤抗原 ,为肺癌早期诊断提供血清学标志物 ,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原 ,成功构建了库容为 0 .8× 10 6个重组子的肺癌原发病灶组织的cDNA表达文库。采用SEREX技术对该cDNA表达文库进行筛选 ,获得了 33个阳性克隆 ,包括黑色素瘤抗原基因 (MAGE)、白斑相关蛋白基因、纤连蛋白基因、钠钾ATP酶基因等已知基因或EST ,另外有 18个基因或EST在GenBank数据库中没有同源性 ,可能是新的基因或EST。选取其中 3个克隆进行肺癌患者及正常人群血清的检测 ,结果显示肺癌患者的阳性率明显高于正常人群     

应用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌体内表达基因

为寻找新型抗结核药物靶标 ,采用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌的体内诱导基因。首先构建了结核分枝杆菌基因组质粒表达文库 ,库容量为 1 0 2× 1 0 5CFU。再用经过结核分枝杆菌和大肠杆菌的裂解产物吸附过的结核病人血清 ,通过原位免疫印迹来筛选基因组表达文库 ,共获得 1 6个阳性克隆。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析 ,发现该 1 6个阳性克隆可能包含 2 2个开放阅读框 (ORF)。按照功能将其分为 7类基因 :脂类代谢 2个、信号途径 5个、PE/PPE蛋白家族 2个、中间产物与能量代谢 6个、细胞壁与细胞处理 1个、假想蛋白 4个和与牛型分枝杆菌定向进化同源的 2个 ,其中部分基因可能与毒力相关 ,可以作为候选药物靶标     

人巨细胞病毒cDNA文库的构建、鉴定及pp65阳性克隆筛选

为进一步进行人巨细胞病毒 (HCMV)后基因组功能的研究 ,以及为疫苗分子和早期诊断试剂的研制提供有效工具 ,从HCMVAD1 69株感染 96h的HF细胞中提取HCMV的mRNA ,逆转录合成cDNA片段 ,重组入λgt1 1EcoRI酶切位点之间 ,包装蛋白包装 ,构建HCMVAD1 69株基因组cDNA表达文库。结果表明 ,初始HCMVcDNA文库容量为 3 6× 1 0 6,重组率为 96% ;HCMV鼠多克隆抗血清筛选出 1 68个HCMV阳性克隆 ;地高辛标记pp65特异性寡核苷酸探针原位噬斑杂交筛选出 3 4个pp65阳性克隆 ,再经PCR扩增 ,筛选出 2个pp65阳性克隆 ;pp65PCR扩增产物进一步被Southernblotting证实 ;3 端测序比较 ,同源性为 98%。为进一步克隆、表达该基因及其产物功能研究奠定基础     

人肝癌血清对人体胚胎干细胞文库的筛选及方法改进

用人肝癌血清从人体胚胎干细胞cDNA表达文库中筛选肝癌相关抗原,并对SEREX条件方法的改良作进一步的探索。将已构建好的人胚胎干细胞cDNA表达文库进行滴度计算。利用38例原发性肝癌病人血清,结合SEREX技术,应用Western blot方法,对表达文库中的相关抗原做血清学免疫筛选。同时,对SEREX技术贴膜条件及假阳性的排除方法进行改良。cDNA表达文库滴度为3.8×10~8pfu/ml,筛选出阳性克隆有31个。从人胚胎干细胞cDNA表达文库中能筛查到部分有效的肝癌肿瘤相关抗原,为后续工作提供宝贵资料。     

狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析

对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。     

食源性金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳分型分析

对石家庄地区食源性金黄色葡萄球菌进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,建立石家庄市金黄色葡萄球菌PFGE分型的数据库,探讨引起食物中毒金黄色葡萄球菌菌株和其他食源性金黄色葡萄球菌的分子特征。利用PFGE分型技术对2010至2012年石家庄市的75株食源性金黄色葡萄球菌进行全基因组分析,DNA酶切图谱用BioNumerics软件进行聚类分析。75株食源性金黄色葡萄球菌的PFGE图谱的相似性系数在54%～100%之间,经聚类分析得到45个PFGE型别,6起食物中毒的金黄色葡萄球菌分别由PFGE01型、PFGE02型、PFGE11型、PFGE12型、PFGE15型和PFGE45型引起。建立的金黄色葡萄球菌PFGE分型数据库分子型别较多,且存在差异明显的多个克隆系,对石家庄地区金黄色葡萄球菌引起食物中毒的防控和溯源工作有重要意义。     

基于功能宏基因组学技术的金黄色葡萄球菌生物被膜抑制物的发现与活性分析

宏基因组学方法直接提取环境中的全部微生物基因组DNA,并使其得到功能性表达,为微生物天然产物的开发利用提供了新的方法。利用功能宏基因组学技术,使用大肠杆菌-链霉菌穿梭载体构建四川峨眉山土壤宏基因组文库,并将文库菌中所携带的环境DNA接合转移到链霉菌宿主中。通过活性筛选获得两个具有抗菌活性的阳性链霉菌克隆,其发酵粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成均有很好的抑制作用,当浓度达到2 MIC(Minimum inhibitory concentration)时,抑制作用超过90%;同时,两种粗提物样品对金黄色葡萄球菌生物被膜也存在显著的清除作用,其中EM110样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的清除率高于EM123样品。本文通过功能宏基因组学技术,直接从土壤中筛选获得了对金黄色葡萄球菌生物被膜有较强抑制及清除作用的活性物质。     

日本血吸虫未成熟卯单链抗体库的构建、筛选及初步应用

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原（SIEA）单链抗体（scFv）表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体．并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26-28ku特异性scFv大量表达．随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA2628ku天然分子候选疫苗相关的编码基因．结果显示,所获得的SIEA26-28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4．SIEA26-28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26-28ku的编码基因奠定了基础．     

金黄色葡萄球菌多组分疫苗制备及对小鼠的保护性评价

目的筛选多株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)菌株,为疫苗研发提供备选菌株,并对多组分金黄色葡萄球菌疫苗进行小鼠交叉保护性初步评估。方法通过菌株耐药性、毒力试验筛选获得金黄色葡萄球菌候选菌株;优化菌体破碎和酶解条件获得胞质抗原,并对胞质抗原进行免疫保护性研究以确定最佳免疫剂量;采用抗体中和滴度方法评价类毒素抗原免疫效果;采用多组分疫苗对候选株免疫保护性及同种属其他菌株的交叉保护性进行试验研究。结果 12株金黄色葡萄球菌候选菌株均具有多重耐药性,且对庆大霉素、环丙沙星及苯唑西林的耐药性都比较高,均为83.33%,但都对万古霉素敏感;菌株SA59和SA79毒力分别为34.19 LD_(50)和11.96 LD_(50);菌体破碎最佳条件为3～4次,破碎率达到90%以上,胞质抗原酶解的最佳条件为600 mg胞质抗原在2～4 mg胰蛋白酶条件下,消化至少2 h,抗原含量基本保持不变;SA79胞质抗原免疫剂量不低于1.0 mg/mL时,保护率均70%。类毒素抗原5 EC/mL (A组)、8 EC/mL(B组)和10 EC/mL(C组)免疫小鼠后,血清中抗体中和效价均值分别为2.13、3.13和3.50 AE/mL,B组和C组免疫后的抗体中和效价差异无统计学意义(P_(BC)=0.224,P0.05),但均高于A组,具有统计学意义(P_(AB)=0.008,P_(AC)=0.001,P0.05)。多组分疫苗对候选菌株SA79、SA59的保护率分别为80%和70%,对外毒素的保护率为60%;多组分疫苗对同种属其他菌株的交叉保护率在50%～100%之间,保护率均≥50%。结论多组分金黄色葡萄球菌疫苗对候选株具有保护性,也对同种属其他菌株具有保护性,为后续预防用金黄色葡萄球菌疫苗的工艺开发提供数据支持。     

DADS诱导HL-60 G2/M期阻滞消减文库的构建与初步筛选

目的:构建DADS诱导HL60-细胞G2/M期阻滞的差异表达文库,初步筛选相关基因.方法:分别提取无DADS和有DADS处理HL-60细胞的总RNA和mRNA,构建消减cDNA文库.随即挑选正向SSH的阳性克隆,PCR检测插入片段,将含插入片段的克隆测序.Blastn分析差异cDNA片段的同源性.结果:构建了DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达文库,其中包含120个正向SSH的克隆和100个反向SSH的克隆.50个随机正向SSH的克隆测序、比较同源性,发现5个新EST片段,已经在GenBank中登录.结论:所构建的DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞消减文库为进一步筛选白血病HL-60细胞G2/M期阻滞相关基因奠定了基础.     

1株梅花鹿源狂犬病街毒株全基因组测序与分析

对1株梅花鹿源性狂犬病街毒株(DRV)进行全基因组克隆,对全长cDNA进行测序分析.RT-PCR扩增克隆覆盖全基因组9个重叠基因片段,基因组3'和5'末端采取3,-RACE和5'-RACE方法,9个重叠基因片段序列拼接得到DRV全基因组cDNA序列,共11 863个核苷酸.DRV毒株全基因组构成与其他狂犬病毒基因组构成相似,由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,在核蛋白和糖蛋白的重要抗原位点有个别氨基酸发生变异,对已完成全基因组测序的几个基因1型毒株分别进行了N、P、M、G、L基因核苷酸及氨基酸的同源性比较.与其他具有代表性的毒株进行N基因序列比较建立的系统进化树表明,DRV毒株属于基因1型,与中国人用疫苗株3aG同源性最高为94%,与分类位置未确定的北高加索毒株(WCBV)的同源性最低为71%.本研究结果可为狂犬病毒各项分子生物学研究提供理论参考.     

犬肾细胞MDCK无血清贴壁及单细胞悬浮培养

旨在挖掘用于鉴定金黄色葡萄球菌的高特异性靶点及其PCR检测引物。采用C++语言编程,以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus MRSA 252基因组编码序列为对象,对2 656个可编码区进行分析,获得特异性靶点序列,并设计PCR扩增引物。对包括葡萄球菌属11个种及其他细菌属在内的共计137株细菌验证引物特异性,筛选获得9个DNA序列,并设计了4对引物。经验证2对引物的特异性较好,其中引物SA3的基因组DNA检测限为13.7 fg/μL,菌体检测限为9.25×102 CFU/mL。结果验证     

重组牛乳源金黄色葡萄球菌GapC蛋白优势B细胞抗原表位的预测和筛选

旨在表达牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GapC蛋白并对其B细胞抗原表位进行预测与鉴定，本研究利用实验室分离鉴定的S. aureus分离株15119扩增GapC基因并构建重组表达质粒pET-28a-GapC，诱导纯化得到分子量为44 kD重组蛋白GapC，以此免疫新西兰大白兔，获得特异多克隆抗体。利用生物信息学方法，对GapC蛋白的二级及三级结构进行分析，预测其B细胞抗原表位，并利用特异性抗体对筛选的表位进行鉴定。结果表明，GapC蛋白具有良好的免疫原性，筛选出7个线性B细胞抗原表位，利用兔抗重组GapC蛋白多克隆抗体鉴定得到了PL 5(²²¹ IPEIDGKLDGGAQRVP²³⁶)多肽和PL 7(²⁶⁴KNASNESFGYTEDEIVSSDVVGM²⁸⁶)2个优势B细胞表位。本研究成功制备了GapC蛋白，预测并鉴定了2个优势抗原表位，为其嵌合表位疫苗的开发提供了技术支持。     

TT型病毒基因组的克隆与进化分析

利用PCR方法从输血传播性病毒 (transfusiontransmittedvirus,TTV)阳性标本中获得不同长度且重叠覆盖TTV基因组的DNA片段。将PCR扩增片段克隆到pT Adv载体中 ,筛选获得阳性克隆。DNA序列测定结果表明所克隆的片段为TTV基因组序列。利用DNA片段中特有的限制性内切酶位点将TTV的DNA片段首尾相连 ,得到近全长的基因组克隆 ,命名为TTV0 2 1。对TTV0 2 1的核酸序列进行分析 ,TTV0 2 1长 3472nt,存在 2个阅读框架ORF1和ORF2 ,分别编码 785和 1 46个氨基酸。将TTV0 2 1与其它已知的TTV基因组全序列进行了同源性比较 ,并进行进化分析。结果表明 ,TTV0 2 1序列与TTV分离株CHN2、BDH1的遗传距离较近 ,而与其它分离株相对较远。     

毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因的克隆

通过构建人源毒素源性大肠杆菌野生株E519/66A大质粒的基因文库,成功地筛选出能表达定居因子抗原CS6菌毛的阳性克隆,初步确定了克隆DNA片段的限制性内切酶图谱。CS6抗原的编码和调控基因集中在一大小为4.6kb的DNA区段中,该片段能产生两种分子量大小不同、但抗原反应交叉的菌毛蛋白。本研究获得的CS6抗原阳性的重组菌株可用于人源ETEC多价疫苗的研制,克隆的基因片段亦可作为研究CS6菌毛蛋白基因表达及调控的基础。     

鸡法氏囊B淋巴细胞中与鸡传染性法氏囊病病毒VP2相互作用蛋白筛选

为了获得鸡法氏囊B淋巴细胞中与鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV) VP2相互作用的蛋白质,利用酵母双杂交系统,用IBDV VP2蛋白为诱饵蛋白,筛选鸡法氏囊B淋巴细胞cDNA表达文库。将表达文库质粒转化含IBDV VP2诱饵质粒的酵母感受态细胞,检测报告基因在相应的营养缺陷型培养基 (SD/-Leu/-Trp/-His) 上表达情况,进一步经β-半乳糖苷酶报告基因检测,筛选到16个阳性克隆。提取阳性克隆质粒,经测序分析获得5个原鸡基因序列,分别是：线粒体DNA、蛋白质O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化转移酶、肿瘤     

利用噬菌体展示肽库筛选鸡传染性支气管炎病毒模拟抗原表位

目的：利用噬菌体展示肽库技术筛选鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的模拟抗原表位。方法：用IBV阳性血清纯化IgG作为靶标。对噬菌体展示随机12肽库进行筛选，通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性，并对阳性克隆提取ssDNA进行测序分析。结果：3轮生物淘洗后，目标噬菌体得到125倍富集。随机挑选50个克隆进行ELISA和竞争抑制ELISA。其中有12个噬菌体克隆可以与IBV阳性血清高特异性结合。测序分析发现，这12个克隆带有2种氨基酸序列。即KSPKHSSSALHF和SFFQLNLHRPTS。且未发现这2种序列与GenBank中已发表的IBV氨基酸序列有同源性。结论：结果提示。这2个肽可能是IBV抗原的模拟表位。     

金黄色葡萄球菌agrC的克隆及序列分析

金黄色葡萄球菌agr系统能够调控多种毒力因子的表达,在该系统中,受体组氨酸蛋白激酶AgrC感受外部信号并传递给细胞内,在整个agr系统中起着重要的作用,成为药物发现的新靶点,该蛋白由agrC基因编码。通过分析发现,agrC基因的保守性非常差,这可能是由于它作为受体需要与信号分子结合的特异性所决定的。通过对已经公开的agrC基因序列进行比对分析,设计了多条引物,以金黄色葡萄球菌ATCC 6538的基因组DNA为模板,进行了PCR扩增并转化大肠埃希菌克隆该基因,获得了金黄色葡萄球菌ATCC 6538附属基因调节系统agrC基因的全序列。同时,通过对现有的提取金黄色葡萄球菌基因组的方法做了改进,得到了一种大量提取了金黄色葡萄球菌DNA的方法,获得的DNA纯度较高。     

性逆转石斑鱼脑垂体差异表达基因克隆的筛选

以17α甲基睾丸酮投喂赤点石斑鱼(Epinephelusakaara),成功地获得了性逆转的有功能的雄鱼。用SMARTcDNA合成和长片段PCR技术构建了性逆转前后脑垂体cDNA文库;用抑制消减杂交技术建立了性反转前后抑制性差减文库。对获得的560个雄鱼脑垂体PCR阳性克隆和350个雌鱼脑垂体PCR阳性克隆进行斑点杂交,共筛选到103个差异表达cDNA片段。对其中29个克隆进行了测序,与GenBank中的已知基因序列进行同源性比较,发现有6个片段为促性腺激素α亚基前体基因(GenBank注册号:AY207430),与同属不同种的石斑鱼促性腺激素α亚基前体基因有97%的同源性;1个片段为生长激素前体(GenBank注册号:AY207431),与同属不同种的石斑鱼生长激素前体基因有99%的同源性;其余22个cDNA片段与GenBank中的序列无明显同源性 。     

肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白CEP65相互作用蛋白的筛选与鉴定

CEP65蛋白(cancer and embryo expression protein 65)为肿瘤单克隆抗体3H11所识别的抗原分子, RT-PCR及RNA印迹检测表明, CEP65蛋白表达于肿瘤及胚胎组织.为了研究CEP65在肿瘤发生中的作用机制,以CEP65为诱饵蛋白,通过酵母双杂交体系筛选人胚胎组织cDNA表达文库. 从5.2×10⁶个克隆中筛选得到14个阳性克隆,并在酵母体系中通过不同方法得到验证.在此基础上,选取在双杂交中作用明显的51号克隆,与CEP65作GST pull-down实验, 结果证明, CEP65与51号阳性克隆蛋白确能相互作用. 生物信息学分析发现, CEP65与51号阳性克隆蛋白相互作用, 可能通过WW结构域或者蛋白激酶C对细胞的增殖与分化起到调节作用.