植物源β- 葡萄糖苷酶活性检测方法学研究

目的:来源于植物β-葡萄糖苷酶活性检测的方法学研究。方法:以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物,β-葡萄糖苷酶为催化剂催化底物生成对硝基苯酚,用紫外分光光度法测定对硝基苯酚的含量,根据生成的对硝基苯酚含量计算酶活性,并对此进行方法学研究。结果:对硝基苯酚标准曲线的相关系数为0.999;催化反应的线性相关系数为0.999;反应精密度的相对标准偏差为0.05%;方法重复性的相对标准偏差为2.8%;方法耐用性考察中,酶活性均大于1200 U/g,九个不同方法参数的酶活性相对标准偏差为4.6%;中间精密度实验中,十二份样品酶活性的相对标准偏差为6.6%;稳定性实验中,β-葡萄糖苷酶与底物反应后,放置0小时、16小时、22小时后,测定的酶活性均大于1200 U/g,相对标准偏差为1.1%。结论:此方法线性较好,有良好的方法重复性、精密度、中间精密度、耐用性和溶液稳定性,适用于来源于植物的β-葡萄糖苷酶活性检测。     

青霉素酰化酶活性中心的定点突变

对Ｅ．ｃｏｌｅ ＡＴＣＣ １１１０５的青霉素酰化酶（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ ａｃｙｌａｓｅ,ＰＧＡ）活性中心的Ｓｅｒ２９０分别进行了定点突变和和化学修饰,将活性中心的Ｓｅｒ２９０改变成Ｃｙｓ或Ｓｅｃｙｓ,ＰＧＡ水解活力均大为下降,但仍保留部分活性。其对底物６－硝基（３－苯乙酰氨基）苯甲酸（６－ｎｉｔｒｏ－３－ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｏ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ,ＮＩＰＡＢ）的ｋｃａｔ分别从１     

定点突变及非定点突变技术的新进展

1992年是Zoller和Smith的寡核苷酸诱导的定点突变方法发表十周年[1]。这方法发表后的前几年中,以此方法为基础,改进了的定点突变方法,如雨后春笋相继产生,如Kunkel等人(1985),Calter等人(1985)及Tayler和Eck-stein等人(1985)的改进方法。这些改进方法使突变效率得到了很大的提高[2]。可以说定点突变技术在蛋白质工程研究中发挥了很大的作用。随后非定点突变技术也有了新的改进,如错误参入法,饱和突变技术等在用来寻找具有新的活性蛋白质序列中发挥了作用[3]。现综述一下近几年来定点突变及非定点突变技术的发展情况。     

Gln49-磷脂酶A2基因工程定点突变及酶活性分析

为了确认49位谷氨酰胺磷脂酶A2（Glutamine 49 phospholipase A2, Gln49-PLA2）酶活性缺失与氨基酸序列的相关性,对Gln49-PLA2编码基因第49位氨基酸进行PCR定点突变,利用pET32a+质粒载体在大肠杆菌中表达Gln49-磷脂酶A2的突变体--天冬氨酸磷脂酶A2（Aspartic acid 49 phospholipase A2, Asp49-PLA2--Q49D-PLA2）。将表达的包涵体蛋白变性,采用固定化金属离子亲和层析进行柱上复性、纯化获得突变体融合蛋白（fusion Q49D-PLA2--fQ49D-PLA2）;突变体融合蛋白经蛋白水解酶Factor Xa酶切后,采用Hitrap SP阳离子交换层析和Superdex 75凝胶层析进一步纯化,得到突变体蛋白Q49D-PLA2,得率为1.3%,比酶活为72U/mg。从而证实Gln49-PLA2酶活性缺失的关键原因是49位氨基酸为谷氨酰胺。     

定点突变提高苯丙氨酸羟化酶的热稳定性

嗜热菌中,蛋白质存在Ala替换Gly以及Arg替换Lys的趋势。为了提高紫色色杆菌来源的苯丙氨酸羟化酶的热稳定性,将该酶中所有Gly突变成Ala,Lys突变成Arg,筛选获得热稳定性提高的突变体,并进行组合突变,对突变酶的酶学性质进行研究。结果表明,突变酶K94R和G221A在50℃的半衰期分别为26.2 min、16.8 min,比原始酶(9.0 min)分别提高了1.9倍、0.9倍,同时组合突变酶K94R/G221A在50℃处理1 h后仍保留65.6%的酶活,比原始酶(8.6%)高出6.6倍。圆二色谱结果显示原始酶和突变酶K94R、G221A及K94R/G221A的T_m值分别为51.5℃、53.8℃、53.1℃和54.8℃。蛋白三维结构模拟推测突变体热稳定性提高机理为:突变体K94R中Arg94与Ile95之间形成额外氢键,稳定其所在的柔性区域;突变体G221A中Ala221与Leu281产生疏水作用,稳定酶分子C-端柔性区。该研究结果为蛋白质热稳定性改造提供了参考,也为苯丙氨酸羟化酶在功能性食品领域的应用奠定了基础。     

利用黑曲霉β-葡萄糖苷酶催化香兰素葡萄糖苷水解

本文通过在香兰素葡萄糖苷溶液中加入黑曲霉菌种发酵制取的β-葡萄糖苷酶,进行酶促反应实验,定时取样进行高效液相分析检测,结果表明在反应过程中,溶液中香兰素葡萄糖苷的含量呈逐步下降趋势,香兰素的量呈逐步增加趋势;而在没有加β-葡萄糖苷酶的对照实验中,整个反应过程中香兰素葡萄糖苷的含量基本没有出现什么变化,在反应液中也没有检测到香兰素,这说明黑曲霉β-葡萄糖苷酶能够催化香兰素葡萄糖苷分解为香兰素的反应.     

耐糖β-葡萄糖苷酶基因的挖掘、突变及应用研究进展

降低木质纤维素生物炼制的用酶成本,对推动木质纤维素的绿色利用至关重要。作为纤维素水解过程中的限速酶,β-葡萄糖苷酶酶解活性受高浓度葡萄糖的胁迫抑制。目前,挖掘和突变耐糖β-葡萄糖苷酶的基因是解决这一问题的重要策略。本综述总结了近年来在耐糖β-葡萄糖苷酶基因的挖掘、酶耐糖分子机制的分析、旨在提高酶耐糖性能的酶基因突变以及基于β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株基因工程改造等方面所取得的进展,并进行了展望。本综述为构建高产耐糖β-葡萄糖苷酶的基因工程菌株提供参考,这对推动木质纤维素生物炼制工业化进程具有重要意义。     

肉桂抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

为寻找肉桂中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的化学成分,采用高效液相色谱结合体外抑制α-葡萄糖苷酶活性筛选模型的方法,进行活性成分的跟踪分离,并对活性化合物进行酶抑制动力学研究.结果显示,肉桂石油醚提取物(IC50=350.37 μg/mL)的活性明显高于阳性对照阿卡波糖(IC50=1028.99 μg/mL),从中分离出2个活性成分,分别鉴定为桂皮醛( IC50 =277.89 μg/mL)和肉桂酸(IC50=286.22 μg/mL).酶抑制动力学结果表明它们对α-葡萄糖苷酶的抑制类型均为非竞争性抑制,Ki值分别为178.07 μg/mL和229.43 μg/mL.     

谷精草抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究

研究谷精草中α-葡萄糖苷酶活性抑制成分。采用色谱技术分离鉴定了26个化合物,对所有分离得到的化合物都进行了抗α-葡萄糖苷酶活性的体外筛选试验。其中化合物决明内酯-9-O-β-D-葡萄糖苷(3)、万寿菊素(7)、1,3,6,8-四羟基-2-甲氧基口山酮(13)、万寿菊素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(19)显示出显著的抑制活性,IC50分别为106.7、8.73、56.6、80.4μM。     

茶芽叶中β—葡萄糖苷酶活性的日变化

一天之中茶芽叶中的β－葡萄糖苷酶活性表现出两个高峰,即在中午１２：００左右达到最高峰,然后下降;下午４：００左右酶活性再次上升,１８：００－２０：００酶活性达到一天次高峰;随后便缓慢下降,次日凌晨０：００－２：００酶活性最低,尔后缓慢上升。酶活性日变化与温度、光照强度及空气相对湿度等生态因子日变化无明显关系。     

植物β-葡萄糖苷酶的研究进展

β-葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶,广泛存在于动物、植物和微生物中。β-葡萄糖苷酶能够水解非还原性末端糖基,在植物细胞壁代谢、植物激素激活以及逆境防御等方面发挥着重要作用。β-葡萄糖苷酶依据其氨基酸序列可以分为GH1、GH3、GH5、GH7、GH9、GH12、GH35、GH116等8个家族;但是,目前仅对GH1和GH3有较深入的研究,其他家族的功能依旧不清楚。综述了近年来植物中β-葡萄糖苷酶的结构、理化性质、底物特异性、催化机制以及糖苷水解酶家族在植物中的功能等方面的研究进展,总结了植物中β-葡萄糖苷酶研究中存在的问题,并指出今后的研究方向。     

随机突变提高单胺氧化酶活性

前期获得了一个对底物美西律具有一定活性的单胺氧化酶突变体A-1(F210V/L213C)。为进一步提高其酶活性,利用MegaWHOP PCR构建了库容约为104的随机突变库。筛选后获得了一个最优突变酶ep-1,比活力为A-1的189%。选择性测定结果表明,酶的对映体选择性有较大提高,E值由101提高到282;动力学常数测定揭示,酶催化效率有较大提高,kcat/Km由0.001 51 mmol/(L?s)提高到0.002 89 mmol/(L?s)。和A-1酶相比,在所测定的11种胺类底物中,ep-1对其他7种底物的比活力有较明显提高,对其他4种底物的比活力变化不大。序列分析表明,ep-1的突变为T162A。分子动力学模拟结果提示,该突变主要通过修正通道氨基酸的二级结构和扩大活性口袋来发挥作用。     

UTH1基因破坏提高重组酿酒酵母分泌β-葡萄糖苷酶

异源蛋白质分泌效率低限制了重组酿酒酵母的多种药用蛋白和工业酶生产。挖掘促进蛋白质生物合成和分泌的关键基因,是提高异源蛋白质生产效率的重要手段。酿酒酵母细胞壁完整性影响异源蛋白质分泌,本研究利用基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术,破坏了重组酿酒酵母Y294-BGL1中参与细胞壁合成的未知功能基因UTH1,发现所获得的突变体胞外β-葡萄糖苷酶酶活比出发菌株提高112.9%,而细胞壁完整性下降。对促进产酶的分子机理进行探索,发现突变体产酶条件下与细胞壁完整性相关的关键基因和与蛋白质分泌途径相关的基因转录出现明显差异,提示UTH1基因破坏不仅影响细胞壁完整性关键基因的表达,也影响蛋白质分泌途径。本文的研究结果有助于深入理解UTH1的基因功能,并为构建异源蛋白质高分泌酵母菌株提供了借鉴。     

六种花提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

采用96微孔板法对紫丁香、日本晚樱、锦带花、荆条花、疏毛绣线菊和猥实中不同提取部位对α-葡萄糖苷酶抑制活性进行评价,并与阳性对照药阿卡波糖进行了比较,发现6种花不同提取部位均具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。其中,荆条花的乙酸乙酯部位(IC50=290.57μg/mL)和日本晚樱的乙酸乙酯部位(IC50=292.72μg/mL)抑制活性最好,且都远大于阳性对照阿卡波糖(IC50=1213.38μg/mL)。不同溶剂提取物显示,紫丁香、日本晚樱、锦带花和荆条花的乙酸乙酯部位抑制活性均大于正丁醇部位;而疏毛绣线菊和猥实的正丁醇部位略大于乙酸乙酯部位,且6种花的石油醚部位活性最低。此外,各部位的抑制活性均与质量浓度呈现相关性,具有一定的浓度依赖性。     

通过DNA改组技术获得高活性β-葡萄糖苷酸酶

β 葡萄糖苷酸酶是在植物转基因中广泛应用的报告基因 .以质粒pBI12 1中的GUS基因为基础 ,利用DNA改组方法 ,经DNaseⅠ降解 ,PrimerlessPCR ,PrimerPCR对GUS基因进行了突变和改组 ,然后将改组的GUS基因连接到原核表达载体pG2 5 1中 ,构建了库容为 10 8的突变体库 .经过活性的筛选 ,得到活性提高的克隆 ,再以此为基础 ,经过新的改组、筛选得到活性大幅度提高的克隆GUS2 4 .基因测序显示 ,GUS2 4与GUS基因之间的同源性为 99 7% ,共有 6个核苷酸位点发生了改变 ,分别是 :379位的A突变为G ,396位的T突变为C ,711位的G突变为A ,95 8位T突变为C ,990位的T突变为C ,1649位的A突变为G .核苷酸序列推导的氨基酸序列显示 ,3个氨基酸发生了突变 ,12 7位的Ser突变为Gly ,32 0位的Trp突变为Arg ,5 5 0位的Asn突变为Ser.X gluc染色检测和荧光测活结果显示GUS2 4基因表达的 β 葡萄糖苷酸酶基较GUS基因表达产物活性提高 3倍     

定点突变提高青霉素G酰化酶的稳定性

以大肠杆菌青霉素G酰化酶的晶体结构为模板 ,用软件PMODELING同源模建巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构。在此基础上 ,将 β亚基 4 2 7位 (突变A)和 4 3 0位 (突变B)赖氨酸残基突变为丙氨酸 ,降低了该酶的等电点 ,增加了疏水性 ,从而提高其在酸性和有机溶剂环境中的稳定性。两个突变体与亲本相比 ,比活力和Km相近 ,最适pH减少了 0 .5个单位 ,突变B在 pH 5 .2的溶液中的稳定性明显提高。突变A和B在 15 %DMF中的半衰期分别比亲本酶提高了 60 %和 166%     

定点突变提高木聚糖酶Umxyn10A的热稳定性

木聚糖酶是微生物半纤维素降解体系中的一种关键酶,被广泛地应用在工业中的多个领域。本研究为了提高木聚糖酶Umxyn10A (ABL73-883.1)的热稳定性,将Umxyn10A与GH 10家族4种耐热木聚糖酶进行多序列同源比对以及三维结构的同源建模分析,选定了Umxyn10A第31位氨基酸位点进行定点突变,将氨基酸Ala (A)突变为Phe (F)。分别将Umxyn10A和Umxyn10AA31F在大肠杆菌中进行重组表达,分析2种重组酶的酶学特性,结果发现,Umxyn10AA31F的最适反应温度为85℃,较野生重组酶提高了5℃;在65℃下的半衰期为105 min,较野生重组酶(15 min)提高了6倍;在70℃下突变重组酶的半衰期为15 min,较野生重组酶(5 min)提高了2倍;与此同时突变重组酶的pH耐受区间较原酶也有一定的增大。结果表明,将第31位氨基酸位点Ala突变为Phe能够显著的提高Umxyn10A的热稳定性。