白皮黄瓜鲨烯合酶基因cDNA克隆及生物信息学分析

为认识葫芦科植物中葫芦素生物合成途径所需鲨烯合酶基因结构特征,克隆白皮黄瓜鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因c DNA并进行生物信息学分析。根据葫芦科植物绞股蓝、罗汉果、红花栝楼等的鲨烯合酶基因cDNA序列,设计白皮黄瓜鲨烯合酶引物,分别采用3'RACE和5'RACE技术扩增鲨烯合酶基因3'端和5'端。获得白皮黄瓜鲨烯合酶基因的两个cDNA克隆,命名为CsSS1和CsSS2,其cDNA序列全长分别为1 627 bp和1 534 bp,都编码417个氨基酸残基,分子质量为47.6 k D。成功克隆得到白皮黄瓜鲨烯合酶基因全长cDNA序列并对其进行序列分析,后续可用于葫芦素生物合成途径所需鲨烯合酶基因正选择位点功能分析。     

SEFA-PCR法克隆灵芝鲨烯合酶基因启动子及其序列分析

鲨烯合酶是灵芝三萜生物合成的关键酶,灵芝鲨烯合酶基因的表达和活性的高低决定了灵芝中三萜含量的高低。根据已经获得的灵芝鲨烯合酶全长cDNA序列设计一对专一引物,通过PCR扩增得到了灵芝鲨烯合酶基因的基因组全长,序列长1984bp,含有3个内含子。根据其基因组序列设计引物,采用SEFA-PCR的方法,以总DNA为模板,克隆了灵芝鲨烯合酶基因的启动子序列,长1042bp。序列分析发现灵芝鲨烯合酶基因启动子中没有明显的TATA和CAAT框,但是含有CCAAT-bindingfactor、GATA-1、GC-box、TFⅡD等重要的转录因子的结合位点,以及在人和酿酒酵母鲨烯合酶基因启动子中发现的甾醇调节相关的顺式调控元件。     

绞股蓝法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及其序列分析

目的:克隆并分析绞股蓝法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因的全长序列。方法:参照罗汉果法呢基焦磷酸合酶基因,设计扩增绞股蓝FPS基因的3′RACE引物,采用3'RACE和5'RACE法克隆绞股蓝FPS基因全长cDNA。结果:获得绞股蓝FPS基因全长cDNA序列共1288个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放读框,编码342个氨基酸残基,推断该蛋白的相对分子质量为3.94×104。NCBI Blast结果显示绞股蓝FPS基因编码蛋白的氨基酸序列与已知的植物FPS氨基酸序列的同源性为91%~74%,核酸序列的同源性为88%~78%。结论:克隆了绞股蓝FPS基因全长cDNA序列,为进一步研究绞股蓝FPS基因的表达及三萜皂苷合成通路关键酶分子的进化奠定了基础。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

巴西橡胶树鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

鲨烯合酶(SQS )是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。以巴西橡胶树为试验材料,提取胶乳总 RNA,利用 RT-PCR 以及 RACE 的方法克隆橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区片段,并进行序列分析。结果表明：橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区为1239 bp,编码413个氨基酸,命名为 HbSQS 。荧光定量分析表明鲨烯合酶基因在不同组织里表达水平存在明显差异,且受乙烯调控。     

苦荞查尔酮合成酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因（CHS）的全长DNA序列和cDNA开放阅读框（ORF)序列. 序列分析表明,苦荞CHS DNA序列（GU172165）全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区（HM852753）全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS. 生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列（GFGPG）、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点. 半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子＞叶＞茎＞花＞根＞成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性.     

陆生植物鲨烯合酶适应性进化正选择位点分析

鲨烯合酶是三萜类皂苷生物合成途径中的关键酶,其活性的高低决定了三萜皂苷、植物甾醇等后续次生代谢物的含量．对鲨烯合酶进行正选择位点分析,可为识 别重要的功能位点提供有意义的信息．本研究在克隆获得五加科三七、葫芦科绞股蓝鲨烯合酶cDNA的基础上,结合GenBank中所登载的植物鲨烯合酶cDNA序列信息,利用位点模型检测并分析了38种陆生植物鲨烯合酶的适应性进化．结果显示,进化上相对保守的鲨烯合酶受到正选择作用,检测到的21个正选择位点大部分集中于第2跨膜区及其两侧,其中189S、194S、196S、265I、389P、390T、408A、410R和414N等9 个位点很可能与鲨烯合酶的活性有关．本研究从分子进化角度为调控三萜类化合物的生物合成提供了一个新的思路．     

麻疯树鲨烯合酶基因SQS的克隆及生物信息学分析

以麻疯树(Jatropha curcas L.)总RNA为模板,根据已报道的鲨烯合酶基因序列设计简并引物,用RACE方法克隆得到麻疯树鲨烯合酶基因全长cDNA,命名为JcSQS。JcSQS全长1609 bp,包含1个1242 bp的开放阅读框,预测麻疯树鲨烯合酶基因编码的蛋白含有413个氨基酸。JcSQS具有鲨烯合酶类的保守结构域,JcSQS 蛋白与蓖麻、柿、木榄等植物中SQS基因编码的氨基酸序列具有高度同源性。这为研究麻疯树萜烯类物质的生物合成和调控机制奠定了基础。     

绞股蓝β-香树脂醇合酶基因的克隆和序列分析

为克隆绞股蓝的β-香树脂醇合酶基因(β-amyrin synthase,bAS),探讨绞股蓝bAS的性质特征及其与绞股蓝三萜生物合成及调控的可能关系。本研究根据绞股蓝转录组测序的结果设计合成bAS全长扩增引物,采用RT-PCR技术扩增绞股蓝bAS的开放阅读框架(open reading frame,ORF)全长序列并连接克隆载体进行测序,利用ExPASy等在线工具及MEGA-X软件对测序结果做相应的生物信息分析。测序结果显示绞股蓝bAS的cDNA的ORF全长共2 283 bp,编码760个氨基酸。该序列信息已提交GenBank,登录号为GM251742。对绞股蓝bAS的氨基酸序列进行了性质与结构预测和系统发育分析。bAS的全长cDNA序列的成功克隆,为绞股蓝bAS基因结构与功能研究提供了基础,并可为研究绞股蓝三萜合成通路的调节方式提供新的认识。     

黑曲霉木聚糖酶Xyn43A基因的克隆和生物信息学分析

[目的]克隆黑曲霉木聚糖酶(Xyn43A)基因,进一步对其进行生物信息学分析。[方法]利用3'RACE与5'RACE技术,克隆Xyn43A全长cDNA序列,扩增Xyn43A的DNA序列,并进行序列分析。[结果]cDNA全长1152bp(不含Poly(A)),包含一个957bp开放阅读框,编码信号肽19个氨基酸,成熟肽299个氨基酸,5'与3'非编码区分别为113bp、82bp。预测该蛋白相对分子量为33.47kDa,等电点为4.55。该序列含一个长度为86bp的内含子。Xyn43A为亲水性稳定蛋白,有4个N-糖基化位点,26个磷酸化位点。与GH43族木聚糖酶亲缘性较近,具有GH43族糖基水解酶典型的5叶片螺旋桨结构。[结论]克隆了一个新的木聚糖酶基因,属于GH43族糖基水解酶。     

苦荞谷胱甘肽转移酶(FtGST)基因的克隆与序列分析

采用RACE技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到一个谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase protein,FtGST)基因。序列分析表明,FtGST基因全长DNA序列和cDNA序列编码区分别为746 bp和666 bp,DNA序列含有一个长度为80 bp(342-421 bp)的内含子;开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸。生物信息学分析表明,FtGST基因推导的蛋白质含有Tau家族典型的底物结合口袋、谷胱甘肽结合位点(G-site)和疏水性底物结合位点(H-site)氨基酸残基,表明FtGST为Tau家族蛋白。     

水蕨(Ceratopteris thalictroides)查尔酮合成酶基因的克隆和表达（英文）

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮化合物合成的关键酶,有关蕨类植物CHS基因的序列及功能信息尚不完善。本研究采用快速扩增c DNA末端(RACE)技术克隆获得了模式蕨类植物——水蕨(Ceratopteris thalictroides)Ct CHS基因(Gen Bank登录号:JX027616.1),其c DNA序列全长为1616 bp,具有3个外显子和2个内含子,开放阅读框(ORF)为1215 bp,编码404个氨基酸。进化树分析表明,Ct CHS与问荆(Equisetum arvense)、松叶蕨(Psilotum nudum)和3种薄囊蕨的查尔酮合成酶基因聚为一枝,说明这些蕨类植物亲缘关系较近且为单系起源。通过构建原核表达体系成功获得Ct CHS蛋白的多克隆抗体并用于免疫印迹分析,结果表明Ct CHS基因的表达明显受紫外光(UV)诱导。Ct CHS基因的克隆与表达分析为进一步研究水蕨类黄酮化合物的合成及其调控机制提供了依据。     

黄花蒿rbcL基因电子克隆、生物信息学及适应性进化分析

[目的]运用电子克隆的方法获得黄花蒿中rbc L基因,并对该基因进行生物信息学及适应性进化分析,获得氨基酸正选择位点及其空间结构特征。[方法]以短葶飞蓬rbc L基因为种子序列(探针,Genbank登录号为:KF482865.1),对黄花蒿的EST数据库进行搜索,应用相关的生物软件进行拼接、组装,利用PAML程序检测其rbc L基因的适应性进化。[结果]获得一个rbc L基因的c DNA序列重叠群,该重叠群长为1 832bp,包含一个完整的长为1 461bp的开放阅读框,共编码486个氨基酸,且与菊科的其他植物的rbc L基因具有较高的同源性,适应性进化分析在rbc L蛋白上有两个氨基酸正选择位点(249S和449T)。[结论]电子克隆获得的c DNA序列为完整的黄花蒿rbc L基因全长c DNA,黄花蒿对生境的适应可能与rbc L蛋白大亚基正选择位点空间结构有关。     

甘蔗ATP合酶基因的电子克隆及生物信息学分析

目的:运用电子克隆的方法获得甘蔗中的ATP合酶基因。方法:以小麦中一个ATP合酶基因为种子序列,对甘蔗的EST数据库进行搜索,应用相关软件进行聚类分析、拼接组装和延长。结果:获得一个ATP合酶基因SATPC1的cDNA序列全长,该序列长1 415bp,包含一个完整的1 077bp的ORF,编码358个氨基酸,且与水稻、玉米、高粱和葡萄等其他植物的ATP合酶具有高度的同源性。结论:电子克隆获得的cDNA序列为完整的甘蔗ATP合酶基因全长cDNA。     

梭梭肌动蛋白基因HaACT1全长的克隆与表达分析

根据本实验已克隆得到的梭梭肌动蛋白基因Ha ACT1部分序列,通过5'RACE技术获得HaA CT1的cDNA全长序列。序列分析表明,该基因c DNA全长序列1 534 bp,其中5'UTR序列为75 bp,3'UTR序列为325 bp,开放阅读框序列为1 134 bp,编码376个氨基酸。该序列与Gen Bank中收录的其它植物Actin基因核苷酸序列的相似性均在84%以上,并且它们的氨基酸序列的相似性达95%以上,Gen Bank登录号为KM886609。根据得到的c DNA序列设计全长引物,进一步克隆了Ha ACT1的基因组DNA序列,由4个外显子和3个内含子组成。利用半定量和绝对荧光定量PCR对Ha ACT1的表达进行分析,发现该基因在梭梭的不同组织及各种非生物胁迫下均能稳定表达,适合作为梭梭中其它功能基因表达研究中的内参基因。     

甜荞查尔酮合酶基因Chs的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术从甜荞中克隆得到查耳酮合酶(CHS)的cDNA开放阅读框(ORF)序列,命名为FeChs,NCBI登录号为GU172166.1.该序列长1 179 bp,编码392个氨基酸,与其它植物CHS基因的同源性为78%～92%,其推导的氨基酸序列含有CHS高度保守的活性位点及CHS的标签序列GFGPG.     

柔嫩艾美耳球虫保守蛋白CHP559基因克隆与真核表达

为构建柔嫩艾美耳球虫保守蛋白Et CHP559基因的真核表达重组质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,并转染DF-1细胞进行表达。利用5'RACE技术克隆获得了柔嫩艾美耳球虫Et CHP559基因全长c DNA序列,该基因全长为1 746 bp,ORF为104-1 327 bp,编码407个氨基酸,编码蛋白的分子量约为46 k D,并利用生物信息学分析该基因编码蛋白的性质、结构等特征,发现该蛋白含有跨膜结构和信号肽。通过RT-PCR扩增得到含完整开放阅读框的基因片段,并将其与真核表达载体pc DNA3.1-flag连接,构建了真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559,所构建的真核重组表达质粒pc DNA3.1-flag-Et CHP559经过PCR和双酶切鉴定,可见一条大小约为1 224 bp的目的条带;重组质粒转染DF-1细胞后,免疫印迹检测可见大小约为47 k D的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验显示在DF-1细胞中检测到绿色荧光。这些研究结果表明已成功获得了Et CHP559的全长序列,并成功构建了Et CHP559的真核重组表达质粒,在真核细胞DF-1中获得表达,为深入研究Et CHP559的功能奠定了基础。     

抚仙金线鲃促性腺激素亚基基因克隆及组织表达分析

抚仙金线鲃Sinocyclocheilus tingi是云南抚仙湖特有种,虽然实现了人工繁殖,但在塘养环境下仍无法自然繁衍。鱼类的生殖活动受下丘脑-垂体-性腺轴的调控,其中促性腺激素在该过程中起重要作用。本实验利用实时荧光定量PCR和c DNA末端快速扩增技术从抚仙金线鲃垂体中克隆了GTHα、FSHβ和LHβ3种基因的c DNA序列,其中GTHα的开放阅读框(ORF)长度为357 bp,编码118个氨基酸,有10个半胱氨酸残基和2个N-糖基化位点;FSHβc DNA全长为856 bp,ORF长度为393 bp,编码130个氨基酸,有11个半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点;LHβc DNA全长为930 bp,ORF长度为441 bp,编码146个氨基酸,有12个半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR结果显示,GTHα和LHβ都只在雄鱼和雌鱼的垂体中表达。FSHβ在垂体中表达量最高,在雌鱼和雄鱼的脂肪、肌肉和雄鱼的精巢和肝脏中有少量表达。本研究为抚仙金线鲃的人工繁育提供了重要的基础数据。     

甜瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

葫芦素类是主要分布于葫芦科植物中具有多种医药活性的四环三萜类化合物,目前药用葫芦素原料主要从甜瓜蒂中提取。该研究从甜瓜中克隆葫芦素类合成关键酶——鲨烯合酶(SQS)的基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明:DNA测序和BLASTRefSeqGene分析表明,克隆的甜瓜SQS基因片段具有完整的该酶基因开放阅读框架(ORF)序列。ORF分析显示,甜瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为7.56。对推衍的甜瓜SQS氨基酸序列分析结果提示,该酶二级结构以α螺旋为主。结构域预测结果表明,SQS属于异戊二烯合酶家族,具有法呢酰基二磷酸及镁离子的结合位点。三级结构预测提示,甜瓜SQS为单体酶,其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。磷酸化位点分析显示,S~(48)处于酶活性中心相关~(47)VSRSF~(52)的模体中,而S~(196)是正选择位点,提示这两处磷酸化位点可能是甜瓜SQS酶活性调节的关键部位。以甜瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。该研究结果为葫芦素类的生物合成调控研究提供了新的线索和实验依据。     

无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)RksAGL基因克隆及表达分析

以无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)花芽提取的RNA为模板,采用同源克隆结合RACE技术克隆得到无籽刺梨AGL基因的c DNA全长,命名为Rks AGL。序列分析表明,c DNA全长1 089 bp,开放阅读框长度为747 bp,可编码248个氨基酸。编码蛋白分子质量预测为28.56 k D,等电点为9.40,无信号肽序列。分析表明,Rks AGL基因属于MADS-box基因家族C类基因,其编码的蛋白与其它植物AGAMOUS类蛋白具有较高的同源性。实时定量PCR分析表明,RksAGL基因仅在雄蕊和心皮中表达,在萼片和花瓣中不表达