广西眼镜蛇蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

目的对广西眼镜蛇毒中磷脂酶A2(PLA2)进行分离纯化,测定其对肝星状细胞HSC-T6的增殖抑制作用。方法采用Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱、Macro-prep High S预装柱结合的方法分离广西眼镜蛇粗毒,经平板法测定各峰的PLA2活性;经SDS-PAGE电泳鉴定终产物纯度并测定分子量,NanoLC-ESI-MS/MS鉴定其组分;CCK-8法测定PLA2对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,确定其凋亡的最小毒性浓度。结果 Sephadex G-50凝胶层析柱、CM-Sepharose CL-6B离子交换柱、Macro-prep High S预装柱层析法,得到第Ⅲ峰具PLA2活性,且达到电泳纯,经NanoLCESI-MS/MS鉴定其为PLA2,分子量约为14.06kD;PLA2在0~1μg/ml的浓度下对HSC-T6细胞具有一定的促增殖作用,2μg/ml时细胞数达到最大值,4~16μg/ml时对细胞生长有抑制作用,且随浓度增大细胞数降低。结论采用Sephadex G-50、CM-Sepharose CL-6B、Macro-prep High S预装柱结合的方法对广西眼镜蛇毒进行分离纯化,得到电泳纯且具PLA2活性的磷脂酶A2;广西眼镜蛇毒PLA2对肝星状细胞HSC-T6增殖有抑制作用,PLA2对HSC-T6细胞的最小毒性浓度为2μg/ml。     

眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

为了得到高纯度眼镜蛇毒细胞毒素-4N,探索眼镜蛇毒中细胞毒素-4N(cytototxin-4N,CTX-4N)对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC-T6)的增殖抑制作用。本研究采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱结合的方法对眼镜蛇毒蛋白进行分离纯化。在每一步分离纯化过程中,采用CCK-8法检测各蛋白峰组分对HSC-T6细胞的增殖抑制作用活性,收集增殖抑制作用最强的CTX-4N峰。经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度,Nano-LC-ESI-MS/MS质谱方法鉴定其组分,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测CTX-4N对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,从而确定其药理作用。经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化后得到一个电泳纯度的蛋白,蛋白质谱鉴定为CTX-4N,分子量约为9.605 k D。不同浓度的CTX-4N作用HSC-T6细胞24 h后,随着其浓度的增大对HSC-T6细胞增殖抑制作用越强,呈剂量-效应关系,IC_(50)为(12.836±0.045)μg/m L。因此,本研究建立一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化方法,并确定了其对HSC-T6细胞的增殖抑制的药理作用随浓度的增加而增强,为进一步研究其药理作用提供一定的理论依据。     

广西眼镜蛇毒细胞毒素-2的分离纯化及其对大鼠肝星状细胞HSC-T6的作用

目的通过层析法从广西眼镜蛇毒中分离得到电泳纯的细胞毒素-2(CTX-2),探索CTX-2对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用。方法采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换层析、Spehadex G-50凝胶层析和Macro-prep High S阳离子交换层析结合的方法分离眼镜蛇毒粗毒;经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度;NanoLC-ESI-MS/MS质谱方法鉴定其组分并测定分子量;CCK-8法检测CTX-2对HSC-T6的增殖抑制作用,确定其最小有效浓度。结果眼镜蛇毒粗毒经分离纯化获得电泳纯的CTX-2,其分子量约为9.548 kD;不同浓度CTX-2作用于HSC-T6细胞24 h后,其增殖抑制作用随浓度增加而增大,呈量效关系,抑制增殖的最小有效浓度为8 mg/L,IC_(50)为11.52 mg/L。结论广西眼镜蛇毒粗毒经三步分离法得到电泳纯且具有高生物活性的CTX-2;广西眼镜蛇毒CTX-2可抑制HSC-T6细胞增殖,抑制作用呈量效关系。     

霍山铁皮石斛糖蛋白的制备及抗氧化活性

以霍山铁皮石斛枫斗为试验材料,经脱脂脱色、0.3 mol/L盐溶液浸提、Sevage法脱蛋白、硫酸铵分级沉淀、透析、聚乙二醇10 000浓缩、冷冻干燥得到粗品;经SDS-PAGE电泳、DEAE 52离子柱和Sephadex G-100凝胶柱分离纯化得到糖蛋白并测定其抗氧化活性。SDS-PAGE电泳显示硫酸铵饱和度越大,盐析作用越强,糖蛋白条带越明显,糖蛋白分子量在6.62×10~4附近;DEAE 52离子柱和Sephadex G-100凝胶柱逐步分离纯化得到2个组分的糖蛋白GP1和GP2;分光光度法测定GP1和GP2中糖蛋白含量分别约为95%和87%;抗氧化结果表明,霍山铁皮石斛糖蛋白具有较强的还原能力且可有效地清除自由基·DPPH、·OH和·O~-_2。     

人脑神经特异性烯醇化酶的纯化及其性质研究

本研究设计了利用DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤、以及经Ultrogel和DEAE-Sepharose CL-6B柱进一步层析分离获得高纯度人脑神经特异性烯醇化酶(NSE)的纯化方案。纯化的酶经SDS电泳鉴定为单一亚基区带,其亚基分子量约为45,000。NSE的等电点约为4.7。该酶作用2-磷酸甘油酸的km值为0.7mmol/L,对Mg~++的km值为0.7mmol/L。Mg~++为烯醇化酶必不可少的辅助因子。在50℃以下,NSE具有一定的热稳定性。     

利用FPLC系统结合自装层析柱纯化兔血清IgG

为了建立一种简便、成本低的纯化兔血清IgG的实用方法,采用FPLC系统结合实验室常规手段填充的Sephacryl-S200凝胶柱和DEAE-Sephadex A-50离子交换柱进行兔血清IgG的纯化,结果表明,在流速为0．5ml／min时,此方法可以纯化得到高纯度的兔IgG;脱盐柱Sephadex G-25重复实验证明此实验方法具有很好的稳定性;并且与商品化的层析柱相比,成本大为下降;此方法主要的不足之处是层析柱的流速较低,为0．5ml／min左右。该方法可以推广到其他生物大分子的纯化中去。     

膜荚黄芪种子中2种几丁质酶的分离纯化及活性测定

运用传统的层析技术对膜荚黄芪种子中两种几丁质酶进行分离纯化,并对分离纯化中各个步骤得到的蛋白进行了活性研究.结果表明:(1)粗提液的硫酸铵沉淀经再生几丁质亲和柱和凝胶过滤层析Sephadex G-75得到几丁质酶A.(2)粗提液的硫酸铵沉淀经离子交换色谱DE-52、CM、凝胶过滤层析Sephadex G-75得到几丁质酶B.(3)几丁质酶A、B的比活性分别为35.6 U/mg和4.1 U/mg.(4)从膜荚黄芪种子中分离纯化的几丁质酶A和B均为糖蛋白,含糖量分别为6.1%和5.8%.(5) SDS-PAGE显示,几丁质酶A、B的分子量分别为35.5 ku、39.6 ku;凝胶过滤层析测定几丁质酶A、B的分子量分别为36.9 ku、40.8 ku;表明几丁质酶A、B均为单亚基蛋白.     

眼镜蛇毒神经生长因子抑制肝星状细胞增殖并诱导其凋亡

目的:从眼镜蛇毒中分离纯化神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF),观察眼镜NGF对肝星状细胞HSC-T6增殖、凋亡活性的影响,进一步为蛇毒NGF在抗肝纤维化治疗提供依据。方法:采用shephadex G-75和CM Sepharose CL-6B二步柱色谱对眼镜蛇毒NGF进行纯化分离;PC12细胞测定各洗脱峰的活性,再用SDS-PAGE鉴定具有NGF活性洗脱峰的纯度和相对分子质量。实验设立空白对照和NGF处理组,分别作用于HSC-T6,培育相应时间,MTT检测眼镜蛇毒NGF对HSC-T6细胞活力影响;HE染色、紫外激光显微镜与透射电镜观察HSC-T6细胞的形态学变化;TUNEL、流式细胞技术检测眼镜蛇毒NGF对HSC-T6细胞凋亡的影响。结果:眼镜蛇毒经PC-12细胞鉴定第Ⅵ峰具有NGF活性;SDS-PAGE检测为电泳纯,相对分子质量为22.3KD;NGF对HSC-T6细胞增殖具有明显抑制作用(2μg/ml NGF的抑制率为49.66%±6.50%,P<0.05;6.25μg/ml NGF的抑制率为71.33%±1.53%,P<0.05);TUNEL法检测发现NGF干预组的凋亡率28.71%±1.59%(2ug/ml NGF)和34.4%±2.49%(5μg/mlNGF)明显高于对照组的15.85%±1.58%(P<0.05);流式细胞仪也有同样的发现,NGF干预组的凋亡率16.12%±3.02%(2 ug/mlNGF)和21.15%±3.31%(5μg/ml NGF)明显高于对照组的2.7%±1.55%(P<0.05)。结论:眼镜蛇毒NGF能抑制肝星状细胞HSC-T6增殖并诱导其凋亡。     

大肠杆菌半乳糖结合凝集素的提取纯化

采用琼脂糖凝胶CL-6B（Sepharose CL-6B）亲和层析以及Sephadex G-75凝胶分子筛等对大肠杆菌（Esche-richia coli,E.coli）半乳糖凝集素进行了纯化。结果显示,目标蛋白经简单的步骤即可以得到纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及凝血实验证明纯化蛋白为E.coli半乳糖凝集素,蛋白提取回收率为11.4%。研究首次从E.coli蛋白提取液中分离得到纯的半乳糖凝集素,且此方法简单快捷,优越性明显。应用此方法将有利于微生物半乳糖凝集素的深入研究。     

镉诱导家兔肝脏含锌金属硫蛋白的纯化及鉴定

预先给家兔皮下注射CdCl_2四次,取肝脏经匀浆、离心、乙醇沉淀后,通过Sephadex G-50凝胶过滤层析,DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-25层析柱脱盐,得到MT的两个“亚型”—MT-1和MT-2,对其进行鉴定,其紫外扫描图谱示在280和250nm处无吸收峰,而最大吸收在220nm处。MT-1和MT-2均不含镉和铜,而每分子结合6个锌。用简化巯基试剂测定,MT-1含18.8个巯基,MT-2含19.1个巯基;HPLC分析MT主要以单体存在,也有少量二聚体。氨基酸组成与Cd-MT一致。整个纯化过程采用示波极谱法和火焰原子吸收光谱法测锌含量。结果表明前者可代替后者。     

牛脑中神经特异性S-100蛋白的纯化及鉴定

牛脑充分匀浆后经三次硫酸铵分级沉淀,再通过一次DEAE-Sepharose CL-6B层析柱,线性梯度洗脱后共收集4个峰洗脱液。PAGE分析(7.5％凝胶)显示第3峰为单一区带;免疫双扩散证实该洗脱液中蛋白为S-100蛋白。SDS-PAG E分析显示S-100蛋白分子量约为10kD;非还原条件下,凝胶过滤(Sephadex G-75)显示S-100蛋白位于MW为20kD区域。认为该纯化方法简便、快速,可获得较高纯度的S-100蛋白,活性高达1∶128以上,完全能满足进一步研究之用。     

番茄离体花柄脱落区多聚半乳糖醛酸酶提取纯化体系的优化

多聚半乳糖醛酸酶是植物器官脱落过程中的重要水解酶,实验以20μL.L-1乙烯处理的离体番茄花柄为试材,建立了与脱落相关的多聚半乳糖醛酸酶提取与纯化体系:以50 mmol.L-1乙酸缓冲液(pH=5.5)为提取液,加入0.1 mol.L-1NaCl、1 mmol.L-1DTT提取效果较好;将酶的粗提液低温浓缩后,经Sephadex G-75凝胶层析分离纯化,最佳流速为0.2 mL.min-1,适宜上样量为3.5 mL;再将凝胶层析分离的活性部分低温浓缩后,经CM Sepharose CL-6B离子交换层析再次纯化,流速为0.3 mL.min-1、洗脱液pH值5.5纯化效果最好。经上述提取纯化过程,得到了分子质量为30.2 kD的多聚半乳糖醛酸酶蛋白。该提取纯化体系为探讨与脱落相关酶的性质及其活性调控提供了参考。     

海洋扩展青霉（Penicillium expansum）果胶酶的纯化及酶学性质研究

通过超滤、DEAE Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析,对一株来自海洋的扩展青霉(Penicillium expansum)所产果胶酶进行分离纯化,得到电泳纯的果胶酶,经SDS-PAGE电泳显示单一条带,且果胶酶亚基的分子质量约为63.96 ku,纯化倍数为24.13,回收率为36.32%。酶学性质研究结果表明,该果胶酶的最适反应温度为50℃,最适p H值5.4,在p H值4.6~6.2比较稳定,Mg2+、Ca2+对果胶酶活力有明显激活作用,Cu2+有明显抑制作用,以果胶粉为底物的Vmax为393.56μg/(min·m L),Km为3.34 mg/m L。     

经高浓度味精废水驯化的B.t菌株伴胞晶体特性及其活性成分研究

对3株能在味精废水中生长的苏云金芽孢杆菌菌株T.4,G.1,S-2.5进行了废水茄子瓶培养基培养,应用液体双相法分离晶体,通过SDS－PAGE电泳确定了它们的分子量为120KD,104KD,67－68KD,43－45KD,选取菌珠G．1经分离后的晶体通过DEAE－纤维素离子交换层析和Sephadex G-100凝胶排阻层析分离到两上峰,分子量分别为120KD,68KD,致死中浓度LC50分别为0．609,＞25。     

拟南芥细胞异三聚体G蛋白的分离纯化

以拟南芥哥伦比亚Columbia(Col-0)野生型悬浮培养细胞为材料,采用超声波破碎、匀浆、离心、40%~60%饱和度硫酸铵分步沉淀、Sephadex G-25脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换、Sephadex G-200凝胶过滤,最后经过Sepharose CL-6B得到纯化的目的蛋白,蛋白收率为0.097%。纯化的蛋白质经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定显示为一条带,经Western blotting证实为G蛋白。把经Native-PAGE鉴定的蛋白质的条带回收,进行SDS-PAGE显示有3条带。一条是Gα亚基,其分子量为60kDa左右;另外2条带分子量为45kDa和35kDa,可能是β、γ亚基,初步证实拟南芥中存在异三聚体G蛋白。G蛋白提取方法的建立为在基因突变型拟南芥中G蛋白功能的研究奠定基础。     

牛脑海马NGF分离纯化及微量元素含量检测

将牛脑海马粗提物经盐析、透析、CM-离子交换层析分离纯化得到2个洗脱峰,其中CM2峰含有NGF。利用Western Blot检测结果表明,NGF的分子量约为55 KD和70 KD;PC12细胞法检测其生物学活性,在CM2分离组分作用下,PC12细胞轴突生长效果优于2 ng/mL标准品NGF;原子吸收分光光度法检测脑海马结构微量元素含量,Zn与Cu无差别,Fe与Zn、Cu有差异(P<0.01);CM2组分中Fe与Cu含量无差异,Zn远高于Fe、Cu含量(P<0.01)。     

羊胎盘免疫调节活性因子(SPIF-Ⅰ)的分离纯化和鉴定研究

为探讨研究羊胎盘的活性组分,将羊胎盘绞碎通过匀浆、冻融、超虑等步骤制备羊胎盘提取液,经Sephadex G-50和Sephadex G-25凝胶过滤、Sephadex G-10凝胶柱脱盐,反相高效液相色谱纯化出单一组分并进行理化性质、生物活性初步研究.结果得到紫外特征吸收峰为273nm、分子质量为303.8的羊胎盘免疫调节活性因子-Ⅰ(Sheep placental immunoreglating activity factor-Ⅰ,SPIF-Ⅰ).体外生物学活性试验证明,SPIF-Ⅰ能显著影响小鼠脾淋巴细胞增殖分裂,具有明显的剂量-效应依赖关系.SPIF-Ⅰ是羊胎盘提取液中一种具有免疫调节的小分子活性多肽.     

一种新阿片肽的分离纯化

报道了一种新阿片肽OP1的分离纯化。将重组毕赤酵母经适宜的生长和表达培养后,所得的发酵液经离心得无细胞上清液,上清液经超滤后过Sephadex G-10柱。将经Sephadex G-10柱所得具有阿片活性的粗组分用HPLC-MS分析,根据阿片肽N-端均有一个酪氨酸残基,且在肽链的第三或第四位上有一个芳香族氨基酸残基这一性质,依据分子量确定活性组分中可能存在的所有阿片肽,然后根据这些阿片肽的等电点,利用AKTA Purifier 100快速纯化系统的DEAE-阴离子交换纤维素柱将其进一步分离,活性组分再用Sephasil peptide C18反相高压液相柱分离得到活性组分OP1肽,鉴定纯度后测定其氨基酸组成。最后确定该肽的一级序列为YPFPGPIRYG,该阿片肽序列目前尚未见报道。     

凝胶过滤层析参数对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响

考察了凝胶过滤介质、层析柱直径、柱床高度和洗脱流速对家蝇Muscadomestica蛋白粗提液分离效果的影响,结果表明：凝胶过滤介质种类、层析柱直径、柱床高度、洗脱流速均能不同程度地影响家蝇蛋白粗提液的分离效果。在实验范围内,选择1.3 cm直径、40 cm柱床高度的Sephadex G-75,以0.4 mL/min的流速洗脱时,对家蝇蛋白粗提液的分离效果比较理想。     

NGF诱导PC12细胞分化的研究

动物实验表明,生理浓度的乙醇在脑发育过程中,不但可以影响神经细胞的数量,还可协同增强NGF诱导PC12细胞形态和功能上的分化,分化的PC12细胞具有与交感神经元相似的性状特征。用100mmol/L乙醇和50ng/mlNGF联合诱导可建立PC12细胞分化模型,为以神经细胞为研究对象的实验提供一种获得神经细胞的方法。