稳定表达Aβ特异性单链抗体的哺乳动物细胞株构建和功能研究

构建可以稳定表达Aβ特异性单链抗体(scFv)的哺乳动物细胞株。应用重叠延伸PCR的方法,以前期建立的Aβ特异性单克隆抗体(A8)的轻、重链可变区基因为模板,构建scFv的基因片段,通过(G_4S)_3或p2A两种不同的连接肽(Linker)序列,拼接得到多种形式的scFv基因片段,用于构建真核表达载体。利用脂质体分别转染人宫颈癌细胞(Hela)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO),Western blot鉴定scFv的表达情况;以潮霉素筛选获得稳定表达抗Aβ的scFv细胞株,以间接ELISA和斑点印迹分析所得scFv的抗原识别能力;采用体外细胞实验,在超微病理水平分析所得scFv的细胞保护作用。结果:成功构建了Aβ特异性scFv的3个真核表达载体pSecTag2/HygroA-VL-(G_4S)_3-VH、pSecTag2/HygroA-VH-(G_4S)_3-VL和pSecTag2/HygroA-VL-p2A-VH,获得了2株稳定表达Aβ特异性scFv的细胞株Hela-VL-p2A-VH和CHO-VL-(G_4S)_3-VH。Western blot结果表明了相应scFv的正确表达,间接ELISA和斑点印迹结果表明所分泌的细胞上清具有Aβ抗原识别能力,体外实验显示其具有阻断和抑制Aβ寡聚体细胞毒性的作用。稳定表达Aβ特异性单链抗体的细胞株有助于AD免疫治疗基础研究的进一步开展。     

抗伏马菌素单链抗体与碱性磷酸酶的融合表达及活性鉴定

为原核表达抗伏马菌素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白并分析其活性,本研究根据抗伏马菌素单链抗体H2的基因序列设计引物,PCR扩增获得目的基因,经限制性核酸内切酶SfiⅠ和Not Ⅰ的酶切位点克隆到pDAP2/S载体中,转化大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株XL1-Blue并鉴定阳性转化子.IPTG诱导H2-AP...     

单链抗体的制备及其在肿瘤诊疗中的应用

单链抗体(single-chain fragment variable, scFv)是由可变重链(VH)和可变轻链(VL)通过柔性肽接头连接在一起的小分子重组抗体。从杂交瘤中分离单链抗体的mRNA,逆转录成cDNA作为单链抗体基因扩增的模板,可得到包含大量不同VH和VL片段的单链抗体的基因文库。利用展示技术完成单链抗体亲和力和特异性筛选及鉴定,得到的单链抗体可通过各种表达系统成功表达单链抗体的蛋白质。虽然单链抗体分子量小,但已包含了完整抗体的抗原结合域,对抗原具有高特异性、高亲和力及低免疫原性,还具有较好的肿瘤组织穿透和扩散能力。因此,单链抗体已成为肿瘤诊疗方法开发中的研究热点。详细介绍了单链抗体的制备方法和问题,重点阐述了单链抗体在肿瘤诊断和治疗中的研究进展,以期为单链抗体制备及其治疗和诊断肿瘤提供理论依据。     

不同连接肽的双价单链抗体基因的构建及表达

采用基因重组技术分别借助不同长度的连接肽[G4S和(G4S)3],将两个相同的抗人大肠癌单链抗体基因ND-1scFv共价连接,构建表达载体pET-28a( )ND-1sc(Fv)2,并在大肠杆菌BL21中表达ND-1sc(Fv)2的融合蛋白。应用Ni2 亲和层析方法对表达产物进行纯化,SDS-PAGE、免疫荧光法(IFA)和ELISA对纯化后的蛋白质进行纯度和免疫活性分析。结果表明成功构建了表达载体pET-28a( )ND-1sc(Fv)2,并在大肠杆菌中获得高效表达,其表达产物以不溶性包涵体形式存在。纯化后ND-1sc(Fv)2-5、ND-1sc(Fv)2-15的蛋白质纯度分别为90%和86%。IFA及ELISA结果表明,二者均保留了亲本抗体的免疫活性,对表达在人大肠癌细胞上的肿瘤相关抗原LEA具有特异结合活性,其免疫活性均明显高于ND-1scFv,其中ND-1sc(Fv)2-15的免疫活性更接近于亲本单抗ND-1,该抗体有望成为大肠癌临床导向诊断和治疗的理想载体。     

双价和双特异性Diabody的构建及表达

单链抗体(ScFv)是由一个重链可变区(V_H)、一个轻链可变区(V_L)经连接肽(linker)连在一起构成的单价小分子抗体,为使其能组装成双价,我们对一个抗人红细胞的ScFv进行了改造,将其连接肽由17个氨基酸[SR(GGGGS)_3]缩短为6个氨基酸(SRGGGS),强迫不同分子间的V_H和V_L组合成F_V,从而形成双价小分子抗体(Diabody),在大肠杆菌中分泌表达后,显示:①具有血球凝集活性:抗人RBC ScFv虽可与RBC结合,但不能产生凝集     

从噬菌体抗体库中淘选血纤维蛋白特异的单链抗体

为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 .     

人源性抗TNFα小分子抗体的改构和分析

在获得人源性抗人TNF α单链抗体 (ScFv)基因序列的基础上 ,对ScFv的连接肽部分进行基因改造 ,并构建了Fab抗体基因。改构前后的ScFv分别重组入表达载体pBV2 2 0 ,经 42℃热诱导 ,在E .coliDH5α中表达了ScFv蛋白 ,得到分子量约为 30kD的重组蛋白质 ,改构前后ScFv的表达量分别占菌体总蛋白质的 6 .5 %和13 .8%。同时构建Fab可溶性表达载体并转化非抑制型菌株HB2 15 1,经IPTG诱导 ,在约 5 0kD分子量处呈现一条新生蛋白质条带。从大肠杆菌裂解液中对ScFv进行了复性和层析纯化 ,对Fab基因的表达产物进行了亲和层析纯化 ,并证实 :(1)改构后ScFv在大肠杆菌中的表达量有所提高 ;(2 )改构前后的ScFv与Fab均具有与hTNF α相结合的活性 ,具有GGGGS连接肽的ScFv与hTNF α的亲和常数为 6 .70× 10 4 (mol/L) -1,而改构后具有(GGGGS) 3 连接肽的ScFv的亲和常数提高为 7.2 7× 10 5(mol/L) -1,Fab与hTNF α的亲和常数为 7.6 1× 10 5(mol/L) -1,Fab与改构后ScFv的亲和力无明显差异 ;(3)ScFv与Fab均有中和hTNF α细胞毒的作用 ,具有(GGGGS) 3 连接肽的ScFv与Fab的中和活性基本相同 ,但均明显低于一株鼠源性单抗     

文摘

000042抗结肠癌相关抗原单链抗体基因的构建和表达[中]/朱林霞…//生物工程学报.-2000,16(1).-82～85通过ＰＣＲ扩增和酶切分别得到抗结肠癌相关抗原抗体的重链可变区序列、轻链可变区序列及连接肽序列,将它们构建成为ＶＨ-ｌｉｎｋｅｒ-ＶＬ形式的单链抗体基因片段,并在大肠杆菌中进行表达。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析结果表明,以ｐＣｏｍｂ3为载体,在大肠肝菌ＪＭ83中,ｓｃＦｖ未获得有效表达,而以ｐＥＴ-22ｂ( )为载体的ｓｃＦｖ在大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)中,30℃诱导培养获得了高效表达,表达水平占全菌蛋白的35.5%。(杨淑培)000043大肠杆菌原核…     

抗A型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达

以获得的抗A型肉毒毒素人源单链抗体ScFvB17为模板 ,PCR扩增抗体ScFv基因的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (Vκ) ,以重链恒定区 1(CH1) 5′端 12个氨基酸的序列作为连接肽 ,构建成三结构域抗体分子 :VH_连接肽_Vκ(VH Vκ)。重组VH Vκ抗体分子在大肠杆菌中得到高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白质的 34%以上。表达的蛋白质在菌内形成包含体 ,采用镍柱金属鏊合层析法对该包含体进行纯化 ,得到了纯度高达 95 %的VH Vκ。ELISA等实验结果显示 ,重组设计并制备的三结构域抗体蛋白VH Vκ不但可以特异识别毒素抗原 ,具有与原母本单链抗体ScFv相同的抗原特异性 ,而且具有了更高的相对亲和力和稳定性。     

抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达

以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆抗体AA98为基础,采用PCR扩增抗体AA98基因的重链可变区(V_H)和轻链(L),以重链恒定区1(C_H1)5′端12个氨基酸的序列作为连接肽,并将连接肽中的Lys突变为Ser,构建VH连接肽-L三结构域单链抗体。重组VH/L单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白质在菌内形成包含体,经凝胶过滤法复性,获得了有抗原结合活性的V_H/L。该三结构域单链抗体的成功构建和复性,为重组抗体片段的研制提供了借鉴。     

抗TNF-α单链抗体的表达及其纯化

克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性。结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL。采用Sarkosyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性。实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化。     

鼠源抗HFRSV衣壳蛋白McAbF3株单链抗体基因克隆构建及表达

为了获得原抗ＨＦＲＳＶ衣壳蛋白ＭｃＡｂＦ３＾１株轻链可变区基因,由连接肽体外连接获得单链抗体基因,在大肠杆菌中表达,从鼠源抗ＨＦＲＳＶ衣壳蛋白ＭｃＡｂＦ３株细胞中分离总ＲＮＡ,以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８为引物逆转录成ｃＤＮＡ,通过ＰＣＲ扩增出抗体的轻链（ＶＬ）和重链可变区（Ｖ１１）基因,由连接本外连接获得单链抗体（ＳｅＦｖ）基因。将此单链抗体（ＳｅＦｖ）基因插入原核表达载体ＰＥＴ２８ａ,经大肠杆菌（     

原核表达抗伏马菌素单链抗体的条件优化

单链抗体可溶性大量表达是其生产应用的前提条件,本研究通过基因工程操作构建含有抗伏马菌素单链抗体基因H3的重组载体p HENHi-H3,转化大肠杆菌XL1-Blue,酶联免疫吸附实验检测不同的诱导温度、IPTG浓度和诱导时间对H3抗体的表达影响。优化后的单链抗体H3的原核表达条件为:菌液培养至OD600达到0.5时加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG,30℃诱导表达8 h。本研究通过对蛋白原核表达的主要影响因素进行优化,能够显著提高H3抗体的原核可溶性表达效率。     

不同方式构建的单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的活性分析

为了研究不同方式构建的单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白原核表达后的生物活性差异,并分析其可溶性表达的影响因素,本研究通过基因工程操作构建含有不同类型的单链抗体-碱性磷酸酶融合基因的表达载体,优化原核表达条件并诱导表达,比较分析宿主菌、连接肽、抗体的单体或二聚体等因素对融合蛋白可溶性表达和生物活性的影响。结果显示不同方式构建的单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的活性差异显著,在单链抗体和碱性磷酸酶之间添加连接肽能够获得更高活性的融合蛋白,而单链抗体二聚体与碱性磷酸酶的融合蛋白的活性明显降低。因此,单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的可溶性表达和活性与单链抗体及其构建方式有关,而抗体自身的特性起着关键性作用。     

抗对硫磷基因工程新型抗体的制备及鉴定

【目的】提高抗对硫磷抗体的亲和力以提高酶联免疫检测的灵敏度。【方法】本研究通过抗对硫磷单链抗体基因和核心链霉亲和素基因片段的拼接重组,获得了抗对硫磷单链抗体-核心链霉亲和素融合基因(scfv-sa),并将该融合基因(scfv-sa)插入到表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,制备融合蛋白。SDS-PAGE和Western blot鉴定scfv-sa的表达,Ni+-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,并用ELISA方法测定该融合抗体的亲和力。【结果】结果表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中该融合基因能表达出分子量约为46kDa的融合蛋白,形成了四价结构域-四价聚合抗体。ELISA测定结果表明该抗体能与对硫磷特异结合,抗体效价在1:1×106以上,亲和常数为4.25×107L/mol。【结论】制备的抗对硫磷四价聚合抗体能与抗原特异结合,与单克隆抗体相比,抗原结合位点显著增加,ELISA检测灵敏度显著提高。     

人源抗转铁蛋白受体单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:在人源单链抗体库中筛选抗人转铁蛋白受体(TfR)单链抗体(scFv)。方法:人源展示型抗体库质粒转染293T细胞,通过第一轮流式细胞分选得到比例为0.2%的阳性细胞,提取质粒并扩增,得到的质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需抗体库;第二轮分选时降低抗原浓度,最后得到2个候选的scFv序列。经序列分析,选择1号单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得单链抗体蛋白,经Forte Bio Octet进一步测定单链抗体蛋白的亲和力。结果:经过2轮筛选获得了全新的抗TfR单链抗体序列,构建并表达了该单链抗体蛋白,该单链抗体与TfR的亲和力常数为5.57×10-7。结论:从展示型人源scFv抗体库中获得了全新的抗TfR单链抗体,该单链抗体与TfR具有较好的亲和力。     

抗肿瘤血管三结构域单链抗体ＶＨ／Ｌ的构建与表达

以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆体ＡＡ９８为基础,采用ＰＣＲ扩增抗体ＡＡ９８基因的重链可变区（ＶＨ）和轻链（Ｌ）,以重链恒定区１（ＣＨ１）５′端１２个氨基酸的序列作为连接肽,并将连接肽中的Ｌys变为Ｓer,构建ＶＨ－连接肽－Ｌ三结构域单链抗体。重组ＶＨ／Ｌ单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占菌体总蛋白质的２０％。,表达的蛋白质在菌内形成包含体,经凝胶过滤法复性,获得了有抗原结合活性的ＶＨ／Ｌ。该三结构域单链抗体的成功构建和复性,为重组抗体片段的研制提供了借鉴。     

具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含硒单链抗体酶制备

 利用RT PCR从分泌有谷胱甘肽结合部位的单克隆抗体杂交瘤细胞株 2F3中 ,扩增出单抗重链可变区和轻链可变区基因 .经DNA测序后 ,用Linker(Gly4 Ser1) 3 构建成单链抗体 (scFv)表达载体pTMF scFv ,将重组质粒pTMF scFv转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,实现了单链抗体的高效表达 .表达的单链抗体占菌体总蛋白 2 5%～ 30 % .该重组蛋白以包涵体形式存在 ,分子量为 30kD .经过金属螯合亲和层析纯化、复性和凝胶过滤纯化 ,得到电泳均一的单链抗体 .再经化学诱变 ,得到含硒单链抗体酶 ,其谷胱甘肽过氧化物酶活性为 330 0U μmol.采用荧光滴定法测定了单链抗体对谷胱甘肽的结合常数     

抗CD47单链抗体制备及抗原结合活性分析北大核心

[目的]研究旨在制备抗CD47小分子单链抗体,并分析其与抗原的结合能力和阻断作用的活性。[方法]采用DNA合成方法,将抗CD47的单克隆抗体B6H12的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),通过短肽(Gly4Ser)3连接形成B6H12单链抗体(B6H12-scFv),在大肠杆菌中可溶性表达并纯化B6H12-scFv。ELISA和Western Blot方法检测与人重组CD47的结合。检测EC9706和KYSE150两种食管癌细胞表面CD47的表达,细胞ELISA和流式细胞术分析B6H12-scFv与细胞表面CD47的结合。最后采用竞争ELISA分析B6H12-scFv对CD47与髓样细胞表面的信号调节蛋白α(SIRPα)结合的阻断能力。[结果]成功获得纯度达到90%以上的可溶性单链抗体。EC9706和KYSE150细胞均高表达CD47。细胞ELISA和流式检测B6H12-scFv浓度为50μg/m L可与EC9706表面CD47有较好结合。B6H12-scFv浓度为40μg/m L时也可以竞争性阻断CD47与SIRPα的结合。[结论]成功地构建了抗CD47单链抗体,浓度在20μg/m L具有EC9706的结合活性,也具有阻断作用。     

抗CD47单链抗体制备及抗原结合活性分析

[目的]研究旨在制备抗CD47小分子单链抗体,并分析其与抗原的结合能力和阻断作用的活性。[方法]采用DNA合成方法,将抗CD47的单克隆抗体B6H12的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),通过短肽(Gly4Ser)3连接形成B6H12单链抗体(B6H12-scFv),在大肠杆菌中可溶性表达并纯化B6H12-scFv。ELISA和Western Blot方法检测与人重组CD47的结合。检测EC9706和KYSE150两种食管癌细胞表面CD47的表达,细胞ELISA和流式细胞术分析B6H12-scFv与细胞表面CD47的结合。最后采用竞争ELISA分析B6H12-scFv对CD47与髓样细胞表面的信号调节蛋白α(SIRPα)结合的阻断能力。[结果]成功获得纯度达到90%以上的可溶性单链抗体。EC9706和KYSE150细胞均高表达CD47。细胞ELISA和流式检测B6H12-scFv浓度为50μg/m L可与EC9706表面CD47有较好结合。B6H12-scFv浓度为40μg/m L时也可以竞争性阻断CD47与SIRPα的结合。[结论]成功地构建了抗CD47单链抗体,浓度在20μg/m L具有EC9706的结合活性,也具有阻断作用。