雌激素受体与Ⅰ型胶原蛋白存在相互作用

目的:利用酵母双杂交技术筛选与雌激素受体(ER)αAF1转录激活结构域相互作用的蛋白,为乳腺癌发生、发展机制的研究奠定基础。方法:将编码ERαAF1的cDNA片段克隆到诱饵蛋白载体pGBKT7中,以构建的pGBKT7-ERα-AF1为表达靶蛋白的质粒,筛选人乳腺文库。将筛选到的含Ⅰ型胶原基因的质粒与表达ERα和ERβ不同结构域的质粒共转化酵母细胞,验证Ⅰ型胶原与ERαAF1作用的特异性。结果:经酶切鉴定,证实重组质粒pGBKT7-ERα-AF1含有目的基因片段;Western印迹证实ERαAF1在酵母中获得表达;酵母双杂交筛选得到与ERαAF1相互作用的Ⅰ型胶原蛋白。酵母细胞共转化实验证实,Ⅰ型胶原蛋白与ERα和ERβ的AF1结合,但与ERβ的DBD、AF2不结合。结论:Ⅰ型胶原与ERα和ERβ的AF1及ERβ的DBD存在相互作用。     

HCV截短型E2蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

目的：获得不包含C末端跨膜区的HCV包膜糖蛋白E2蛋白（E2 661）编码基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增HCV E2661 cDNA片段,先克隆入pMD-18T载体中,经测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7,将重组质粒pGBKT7-E2661用醋酸锂法转化入酵母菌AH109,检测目的蛋白在酵母细胞中的表达以及对报告基因有无激活作用。结果：成功构建含有HCVE2661基因片段的酵母双杂交诱饵载体,目的片段可在酵母细胞AH109中正确表达,对酵母菌无毒性且对报告基因无自主激活作用。结论：可利用所构建的pGBKT7-E2661作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,进行相互作用分子的筛选研究。     

协同激活分子CBP诱饵表达质粒的构建和鉴定

构建协同激活分子CBP（CREB（cAMP response element binding）binding protein）的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.PCR扩增小鼠CBP的基因编码序列（CDS（coding sequence）序列）并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,通过酶切和测序鉴定后,把构建好的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP转化到酵母AH109细胞中,Western blot检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果成功扩增了小鼠CBP基因的CDS序列,并成功克隆到酵母诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果正确.诱饵表达质粒成功转化到酵母AH109细胞中,Western blot分析结果证实酵母细胞高表达诱饵蛋白CBP,但诱饵蛋白有自激活作用.提示pGBKT7-CBP不能用于酵母双杂交或三杂交系统检测CBP与其他蛋白质或小分子的相互作用,对其他研究CBP生物学功能试验的方法选取具有一定的借鉴意义.     

TNF-α转化酶酵母双杂交系统"诱饵"质粒的构建及鉴定

目的：构建酵母双杂交系统“诱饵”质粒载体pGBKT7-TACE,并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法：从小鼠肝组织提取总RNA,用RT-PCR的方法获得TACE,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-TACE在MATH-MAKER GAL4 Two-Hybrid System 3中的自激活和毒性作用。结果：本实验成功构建了“诱饵”质粒载体pGBKT7-TACE,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。结论：构建的诱饵质粒pGBKT7-TACE可应用在酵母双杂交系统中,为筛选小鼠cDNA文库中与TACE相互作用的蛋白奠定实验基础。     

白桦开花抑制因子BpFLC与BpSVP蛋白互作的结构域筛选与互作验证

为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理。从重组质粒pGBKT7-BpFLC、pGBKT7-BpSVP分别克隆出6个BpFLC截短体（BpFLC1~6）和6个BpSVP截短体（BpSVP1~6）,分别编码MI、MIK、K、IKC、KC和C域。在酵母Y2HGold菌中,分别共转诱饵质粒pGBKT7-BpFLC1~6×pGADT7-BpSVP及pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP1~6。酵母转化子Y2HGold［pGBKT7-BpFLC2~5×pGADT7-BpSVP］,可在选择性固体培养基TDO、QTO/A上生长,并在QDO/A/X上长出蓝色菌落,表明BpSVP能与截短体蛋白BpFLC2~5异源结合。此外酵母Y2HGold［pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP2~5］也能同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。进一步研究发现：Y2HGold［pGBKT7-BpFLC3×pGADT7-BpSVP3］存在相互作用,表明BpFLC的K域与BpSVP的K域能够异源结合,是介导BpFLC与BpVP蛋白互作的关键结构域。     

DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

为构建鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因酵母双杂交诱饵载体,采用PCR技术扩增出DEV-NP基因,克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,以PCR检测、限制性酶切和序列测定等方法进行鉴定;然后采用PEG/LiA.法将阳性质粒pGBKT7-NP转化酵母Y2HGold,在不同营养缺失型培养基进行自激活检测,结果显示,经PCR检测和EcoR I/BamH I双酶切,可见到与预期相一致的目的片段;测序表明该片段含DEV NP基因全部序列;转化Y2HGold酵母菌后,在SD/-Trp/X-a-Gal 固体培养基上长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/X-a-GaUAbA固体培养基上未见有菌落生长.无自激活作用的诱饵载体pGBKT7NP的成功构建,为DEV NP宿主结合蛋白的筛选莫定了基础.     

抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测抗增殖蛋白在酵母双杂交系统中是否具有转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增抗增殖蛋白基因全长序列,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-PHB,制备酵母菌AH109感受态细胞,将pGBKT7-PHB转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:扩增出抗增殖蛋白基因全长序列,构建了诱饵载体pGBKT7-PHB,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明报告基因未被激活。结论:抗增殖蛋白没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

鲤疱疹病毒II型ORF25B编码蛋白诱饵载体的构建及其互作蛋白的筛选

【目的】鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染养殖鲫引起的鲫造血器官坏死病,给鲫养殖业造成了重大的经济损失。揭示CyHV-2感染宿主细胞的机制,是建立鲫造血器官坏死病有效防治技术的重要基础。【方法】本研究针对CyHV-2富含抗原表位的ORF25B区域设计引物,扩增ORF25B基因截短序列。将扩增产物克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-tORF25B,转化至酵母菌株Y2HGold中。在营养缺陷型培养基上,验证诱饵表达载体pGBKT7-tORF25B对酵母菌Y2HGold自激活现象和毒性作用。利用酵母双杂交技术,将诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2HGold与鲫脑组织细胞系(GiCB)cDNA文库杂交。【结果】ORF25B基因截短序列扩增大小约为981 bp,成功构建了诱饵菌株pGBKT7-tORF25B/Y2H Gold,自激活和毒性验证结果表明,诱饵表达载体对酵母菌株无自激活现象,也无毒性作用,初步筛选出4种与tORF25B基因编码蛋白互作的宿主蛋白。【结论】本研究结果为深入开展CyHV-2 ORF25B编码蛋白功能及病毒入侵宿主细胞的机制研究奠定了重要基础。     

盐穗木转录因子HcSCL13转录激活的体外鉴定及植物表达载体的构建

通过同源重组的方法将盐穗木盐响应GRAS家族转录因子HcSCL13基因(GenBank登录号:KC68640)构建至酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7上,转化酵母菌Y2HGold,通过自激活性和毒性检测确定该转录因子的体外激活能力。试验表明,重组菌株pGBKT7-HcSCL13/Y2HGold对宿主菌无毒性,且该菌株表达的融合蛋白能够激活报告基因的表达,说明HcSCL13具有转录激活域,是一类转录因子。成功构建了HcSCL13基因的植物表达载体和亚细胞定位表达载体,为进一步在体内研究该基因的耐盐功能奠定了基础。     

FOXL2酵母双杂交诱饵载体构建及检测

目的:用FOXL2编码区片段构建酵母双杂交诱饵质粒并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测.方法:PCR扩增FOXl2编码区DNA片段,克隆入pGBKT7质粒,转化至DH-5α大量扩增后提取质粒,经PCR、酶切和测序验证,再转化至Y187酵母菌株中用缺陷培养基筛选并进行自激活和毒性检测.结果:获得FOXL2基因1137bp片段,并成功将人类正常和一突变型FOXL2编码区克隆人pGBKT7中,经检测在SD/-Trp/X-α-Gal单缺培养基平板上无蓝色菌斑出现,在SD/-Ade/-Trp培养基平板无生长.同时在SD/-Trp/Kana(20μg/ml)培养24h后测得菌液OD600≥0.8,说明重组诱质粒无自激活活性和酵母毒性,满足作为诱饵质粒的条件.结论:成功构建了正常及突变型的FOXL2酵母杂交诱饵质粒;为进一步利用酵母双杂交技术研究与FOXL2相互作用的蛋白打下坚实基础.     

梭梭NAC转录因子家族基因的克隆和转录激活分析

以梭梭NAC转录组测序结果设计特异引物,成功克隆5个梭梭NAC转录因子。通过与其它物种NAC蛋白进行多重比对,表明克隆的5条序列具有NAC转录因子所共有的5个典型亚结构域。通过构建p GBKT7融合表达载体,将其转入AH109酵母菌中进行转录激活功能分析。结果显示含有Ha NAC10、Ha NAC17、Ha NAC18、Ha NAC21转录因子的重组酵母菌可以在SD-Trp-His-Ade缺陷培养基平板上生长,X-gal检测显蓝色。这表明Ha NAC10、Ha NAC17、Ha NAC18、Ha NAC21可以激活下游报告基因表达,说明其具有转录激活活性;Ha NAC16不具备转录激活活性。为进一步分析梭梭NAC转录因子功能和调控机制提供帮助。     

人FAM92A1基因诱饵表达质粒的构建与鉴定

目的 构建人FAM92A1基因（hFAM92A1）的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.方法 PCR扩增hFAM92A1的基因编码序列并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,酶切和测序鉴定后,转化到酵母AHl09细胞中,Western印迹检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功构建FAM92A1基因的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1,测序结果正确.Western印迹实验证实酵母细胞高表达诱饵蛋白hFAM92A1,诱饵蛋白没有自激活作用.结论 构建的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1可用于下一步酵母双杂交系统实验,为进一步研究hFAM92A1功能奠定了基础.     

核转录因子TR3及其缺失突变体在酵母双杂交系统中转录激活作用的检测

目的:检测TR3及其转录活性域缺失突变体在酵母双杂交系统中的转录自激活作用。方法:采用PCR方法扩增TR3全长序列及其缺失突变体,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-TR3和pGBKT7-TR3/Δ1～690,将pGBKT7-TR3转化感受态酵母菌AH109后培养于含缺失培养基的平板上,检测β-半乳糖苷酶活性,判定其是否具有转录自激活作用。结果:构建了包含TR3全长序列和TR3/Δ1～690序列的诱饵载体,转化酵母菌AH109后在双缺和三缺培养基上未能使β-半乳糖苷酶活性滤纸片变蓝,说明β-半乳糖苷酶报告基因未被激活。结论:TR3及其转录活性域缺失突变体没有转录自激活作用,可用于酵母双杂交系统。     

水稻TFⅢA型锌指蛋白基因ZFP207的克隆和表达分析

锌指蛋白是一类重要的转录因子, 广泛参与植物的生长发育和胁迫应答过程。文章使用生物信息学方法从水稻中预测并克隆了一个TFⅢA型锌指蛋白基因ZFP207(GenBank 登陆号: AK063147.1), 该基因包含一个567 bp的开放阅读框, 编码一条188个氨基酸组成的多肽,其编码产物的预测分子量为20.72 kDa, 等电点为9.67。锌指蛋白ZFP207含有一个典型的TFⅢA型锌指结构, 并且在C端含有一个可能具有转录抑制功能的EAR-motif, 但不具有任何已知的核定位信号。系统发生分析结果表明, ZFP207与植物中已经发现的单锌指蛋白亲缘关系较近。通过RT-PCR方法分析了ZFP207基因在成株期水稻不同组织中的表达, 发现ZFP207在茎和叶中表达量较高, 而在穗和根中表达量较低。在酵母中的转录激活实验结果显示, ZFP207在酵母中不具有转录激活功能。     

PC-1分子转录激活功能研究

PC-1基因是在人前列腺癌细胞中克隆的新基因,表达水平随前列腺癌恶性程度增加而升高,其表达产物具有转录因子的一些特征.为研究PC-1分子的转录激活功能,首先应用酵母双杂交系统将PC-1全长以及不同区段的cDNA克隆到表达载体pAS2-1中,然后分别转化酵母细胞株CG-1945. lacZ和His3报告基因激活的检测结果表明,该分子具有转录激活活性并将该活性定位于N端的46个氨基酸区域.此外,将PC-1分子不同区段的cDNA分别克隆至表达载体pZHO1中,将它们与报告基因质粒pTRE-luc共转染哺乳动物细胞COS7和C4-2,Firefly荧光素酶相对活性的检测结果表明,该分子N端的46个氨基酸区域具有转录激活活性.     

白番红花CrCBF1基因的克隆及功能分析

该研究选取新疆地区耐寒植物白番红花为研究材料,采用RT-PCR方法,从白番红花中克隆得到白番红花CBF1的全长cDNA序列,命名为CrCBF1(GenBank登录号MF681787)。结果表明,CrCBF1基因完整开放阅读框ORF长642bp,编码213个氨基酸,分子量为23.8kD,理论等电点为4.99,具有CBF家族典型的AP2保守结构域;亚细胞定位分析显示,CrCBF1基因编码的蛋白定位于细胞核;酵母自激活分析显示,CrCBF1转录因子具有转录激活活性;酵母功能验证分析显示,过表达CrCBF1基因可以明显提高酵母的抗寒性。     

盐芥ThDREB2B基因克隆及功能分析

利用RACE技术从抗逆模式植物盐芥中克隆获得了1个DREB(dehydration responsive element binding)类转录因子基因,命名为ThDREB2B(NCBI登录号EF653377)。结果表明:(1)ThDREB2B基因cDNA全长1 486bp,包含1个954bp的开放阅读框,编码316个氨基酸;推测编码的蛋白质分子量约36.0kD,等电点为4.81,第76～135位氨基酸构成1个AP2结构域。(2)系统进化分析表明,ThDREB2B属于DREB亚家族的A-2亚组,与拟南芥AtDREB2B基因遗传距离最近。(3)半定量RT-PCR检测显示,ThDREB2B基因在正常生长条件下低丰度表达,在低温、干旱或高盐胁迫下上调表达。(4)酵母单杂交结果表明,ThDREB2B蛋白能与DRE元件特异结合,但转录激活能力弱。推测ThDREB2B蛋白可能需要翻译后修饰以获得转录激活功能。     

绵羊CAST基因2型和4型转录本的克隆及特性分析

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)是一种内源性的需要Ca²⁺激活的钙蛋白酶抑制剂, 在肌肉组织的蛋白质降解过程中起重要的调节作用。文章利用牛^CAST基因的mRNA序列, 通过逆转录RT-PCR首次克隆获得绵羊CAST基因2型转录本和4型转录本的部分cDNA序列, 并对序列进行生物信息学分析。CAST基因2型转录本的扩增片段为4 385 bp, 完整的开放阅读框为2 361 bp, 编码786个氨基酸; CAST基因4型转录本的扩增片段为1 467 bp, 完整的开放阅读框为1 317 bp, 编码438个氨基酸。CASTⅡ型蛋白序列存在4个保守结构域, CASTⅣ型蛋白序列存在3个保守结构域; 两者的二级结构均以螺旋为主, 富含疏水区域, 其氨基酸序列存在多个磷酸化位点以及蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)的磷酸化位点。通过RT-PCR分析CAST基因2型转录本和4型转录本的组织表达谱, 结果表明CAST基因2型转录本在所检测的10个组织中均表达, CAST基因4型转录本仅在睾丸组织中表达。     

JAB1与糖皮质激素受体的相互作用及对其转录活性的影响

应用酵母双杂交方法筛选到与糖皮质激素受体(GR)结合的蛋白JAB1,进一步验证JAB1与GR的结合作用并证明其对GR的影响.构建与Gal4-BD融合表达的载体pGBKT7-GR LBD,与构建于pACT2载体上的人骨髓cDNA文库杂交,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp选择培养板上培养,经X-α-gal检测,阳性克隆片段插入pGEM^®-T Vector 载体,测序,再经酵母双杂交和GST pull down蛋白质结合实验验证其结合作用,应用反映GR转录活性的CAT报告基因检测JAB1对GR的调节活性.结果在人骨髓cDNA文库中,筛选到42个X-α-gal检测变蓝且含有pACT2质粒序列的克隆,其中有5个克隆的序列皆为Jun活性区结合蛋白JAB1的一部分.酵母双杂交和蛋白质结合实验表明,JAB1与COS7真核表达的GR-LBD在体外有结合作用.JAB1加强GR转录激活的能力.     

双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒基因组剪接变异体编码蛋白可反式激活GAL4反应元件

为研究双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白—yTPds的功能,以酵母双杂交系统的诱饵质粒pGBKT7克隆yTPds基因并转化酵母细胞AH109获得相应重组子,滤纸法及液相分析法测酵母转化子内β-半乳糖苷酶(-βgal)的活性,证实yTPds蛋白可反式激活酵母GAL4反应元件(GAL4 responsive ele-ment)。在此基础上,为进一步探讨该蛋白反式激活作用的功能区域,以pGBKT7分段克隆yTPds基因,分别编码yTPds蛋白N端47个氨基酸(yTPds-N47)、N端75个氨基酸(yTPds-N75)、中部28个氨基酸(yTPds-M28)、C端92个氨基酸(yTPds-C92)、C端64个氨基酸(yTPds-C64)以及去除中部28个氨基酸的融合蛋白(yTPds-Fusion)。各重组载体转化酵母细胞AH109获得相应转化子。滤纸法定性检测酵母转化子内-βgal活性,结果显示yTPds-N75、yTPds-M28、yTPds-C92蛋白可反式激活GAL4反应元件,液相分析法显示酵母转化子内-βgal活性强弱为yTPds-M28>yTPds-N75>yTPds-C92>yTPds,提示yTPds蛋白反式激活作用的功能区域是其中部28个氨基酸,该区域对应于HBV preS1蛋白反式激活功能域。此研究证实双剪接型2.2kb乙型肝炎病毒(HBV)基因组剪接变异体特异性新蛋白具有反式激活作用,提示其可能具有重要的致病意义。