三株散囊菌发酵茶叶的初步研究

散囊菌属真菌(Eurotium spp.)能赋予发酵茶独特的口感和香味。本研究利用前期从广西某六堡茶中筛选并鉴定的三株散囊菌属真菌Aspergillus chevalieri E2、Aspergillus chevalieri E3与Aspergillus cristatus E6,探讨在不同温度下以优化察氏液体培养基培养的生长状况,发酵前不同灭菌条件下的茶叶品质,以及所得茶汤中茶多酚含量、总抗氧化能力和DPPH·自由基清除能力。结果显示:三株真菌在优化的察氏液体培养基中31℃～34℃下都能良好生长。茶叶发酵温度为28℃,三株真菌在发酵初始含水量为20%以上生长良好,其中E3和混合发酵组的生长速度最快。E2在茶叶表面生长出大量金黄色子囊果以及大量浅绿色分生孢子梗; E3几乎只有浅绿色分生孢子梗; E6几乎只有金黄色子囊果。发酵茶叶制作的茶汤内茶多酚含量比未发酵低,抗氧化性指标也有所下降,说明本实验真菌发酵促进了茶内抗氧化物质的氧化。本研究对源于六堡茶不同散囊菌属真菌的茶叶发酵有重要参考价值。     

三株散囊菌属真菌的茶叶液态发酵与其成分分析

散囊菌属真菌(Eurotium spp.)又称“金花菌”,能在六堡茶表面生长出金黄色的子囊果而得名,是一类对发酵茶叶的品质有积极影响的真菌。本研究前期从广西梧州六堡茶中筛选到的三株散囊菌属真菌Aspergillus chevalieri E2(简称E2),Aspergillus chevalieri E3(简称E3)与Aspergillus cristatus E6(简称E6),将菌株接种于自制液体茶粉培养基中培养,检测发酵液中产生的色素物质;测定发酵液中纤维素酶、果胶酶、淀粉酶的酶活力、总糖和还原糖糖含量、氨基酸含量、总抗氧化能力、自由基清除能力和茶多酚含量。结果表明:三株真菌在液体茶粉培养基中生长良好,E3生长尤其迅速。在8 d的培养期限内,E2、E3和E6的最高果胶酶活力分别为2.52、3.44和5.15 U/mL;最高纤维素酶活力分别为0.57、0.82和1.10 U/mL;最高淀粉酶活力分别为0.31、0.35和0.49 U/mL。三株真菌的发酵后培养液中还原糖含量大幅增加,增幅分别达到131.70%、627.02%和459.12%;总糖含量同样呈上升趋势,增幅分别达到6.84%、35.25%和2.07%;E2与E3的氨基酸含量分别下降了17.43%与32.68%,E6则上升了0.52%;E3的总抗氧化活性提升最大,达65.87%;DPPH·自由基清除能力提升最大的是E2,达128.33%;茶多酚含量都显著提升,增幅分别为50.85%、51.58%和53.06%。本研究对改善六堡茶的品质及茶叶的发酵的研究有一定意义和参考价值。     

普洱茶渥堆发酵与堆肥渥堆发酵的比较研究

普洱茶的自然渥堆发酵工艺与农业及环保中的堆肥发酵工艺在堆垛方法、堆垛形状和大小、自然升温过程、高温发酵、翻堆工艺等方面有许多相似之处,主要差别是原料和含水量的不同。对不同原料堆肥已有详细的研究及其动态菌群和多种发酵剂的研究和应用报道,明确了高温菌在渥堆发酵过程中起重要作用,对其翻堆工艺也有较详细的参数及其机械化的应用,但普洱茶渥堆发酵基本上还停留在自然发酵、人工翻堆、常温菌的研究及老茶头作发酵剂的应用等水平上。堆肥的许多研究手段和方法甚至物质转化、脱毒、高温菌的研究等都值得普洱茶渥堆发酵研究加以借鉴。     

一株能高效降解梗丝果胶和纤维素的曲霉的筛选和鉴定

用传统培养法从广西梧州六堡茶中初筛获得5株真菌菌株,再用烟草梗丝培养基复筛,得到一株可以高效降解梗丝果胶和纤维素的产香菌菌株,经ITS及部分r DNA序列分析及形态特征观察,将其鉴定为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis),命名为GYC 501。该菌株在发酵培养过程中,能够产生令人愉悦的特殊香气,并且具有很好的果胶酶和纤维素酶活性,在2%蔗糖察氏液体培养基中培养36 h,纤维素酶活力达到418.2 U,培养48 h,果胶酶活力达到471.4 U。该菌株有望用于烟草梗丝发酵,降解梗丝中的果胶和纤维素,提高梗丝的质量和工业可用性。     

不同发酵茶中优势真菌的抗氧化酶活性

目的在云南普洱茶、广州小青柑、广西六堡茶、湖南熙茯茶及陕西泾阳茯砖茶分离到9种真菌的基础上,探讨9种真菌发酵液和发酵茶沸水冲泡液的抗氧化酶活性。方法采用抗氧化试剂盒测定真菌发酵液及发酵茶沸水冲泡液的抗氧化酶活性;利用Past 3软件对9种真菌发酵液抗氧化酶活性和5种发酵茶沸水冲泡液的抗氧化酶活性进行主成分分析。结果通过比较不同真菌发酵液的抗氧化酶活性表明,小青柑中分离到阿曲霉Q1的CAT(过氧化氢酶)活性最高,酶活力单位为(4.37±0.15)U/mL,熙茯茶中分离到谢瓦曲霉X1的POD(过氧化物酶)活性最高,酶活力单位为(21.67±1.05)U/mL,其次为泾茯茶中分离到赤散囊菌J17,酶活力单位为(18.59±2.74)U/mL;六堡茶中分离到的黑曲霉L1的T-SOD(总超氧化物歧化酶)的活性最高,酶活力单位为(71.11±3.90)U/mL,其次为普洱茶中分离到篮状菌P1,酶活力单位为(59.29±1.42)U/mL;通过比较不同发酵茶沸水冲泡液的抗氧化酶活性表明,5种发酵茶的CAT(F=37.409,P0.01),POD(F=164.268,P0.01),T-SOD(F=26.639,P0.01)活性差异均有统计学意义。其中,泾茯茶冲泡液的CAT活性最高,而其余4种茶叶冲泡液均无CAT活性;普洱茶与泾茯茶冲泡液的POD活性最高,酶活力单位分别为(18.11±0.71)和(18.11±0.64)U/mL;普洱茶和六堡茶冲泡液的T-SOD活性最高,酶活力单位分别为(48.72±0.43)和(45.82±2.02)U/mL;通过对9种真菌发酵液抗氧化酶活性的PCA分析表明,谢瓦曲霉X1、赤散囊菌J17、阿曲霉Q1、烟曲霉Q2、绳状篮状菌Q3和冠突曲霉L2的抗氧化酶活性相近,篮状菌P1、篮状菌P2和黑曲霉L1的抗氧化酶活性相近;通过对5种发酵茶沸水冲泡液抗氧化酶活性的PCA分析表明,小青柑与熙茯茶沸水冲泡后的抗氧化酶活性相近,六堡茶、普洱茶和泾茯茶沸水冲泡后的抗氧化酶活性相近。结论不同发酵茶的优势真菌不同,其真菌发酵产物的抗氧化酶活性不同,且不同发酵茶冲泡液的抗氧化酶活性也不同。     

曲霉属真菌在普洱茶后发酵中的作用

为阐明微生物在普洱茶后发酵过程中的作用及其机制,本文进行了普洱茶温湿度试验,并利用从普洱茶后发酵堆中分离鉴定的优势曲霉属真菌,进行接种试验和专用菌剂的发酵生产试验.结果提示,只有在微生物的作用下,普洱茶才具特有的感官特性,曲霉属真菌能控制后发酵的过程,改变茶叶的感官特性.曲霉属真菌的种类及组合对普洱熟茶的茶多酚组成与含量,以及没食子酸、茶氨酸、咖啡因等特征成分的含量均有显著的影响.因此,应用专用菌剂进行后发酵生产,能加快普洱茶的熟化速度,提高发酵成功率,保证产品质量的稳定性,使普洱熟茶的规范化生产成为可能.     

普洱茶发酵前后对PTPs靶标抑制效果的比较

用不同品种无性系茶树良种制成普洱生茶和普洱熟茶,进行PTP1B、TCPTP、SHP-1、SHP-2、HePTP、YopH的靶标对比试验,结果表明经自然渥堆发酵的普洱熟茶对六个靶标的的抑制效果明显好于普洱生茶,说明普洱茶的发酵工艺是形成其特有保健功效的关键所在;另外,普洱熟茶对靶标的抑制效果还与其原料有关,在研究的3个大叶种茶中,对六个的靶标的平均半数抑制浓度(IC50)为云抗10号<云抗14号<大黑茶。     

不同发酵茶中优势真菌的分离鉴定 及产消化酶活性比较

目的分离鉴定云南普洱茶、广州小青柑、广西六堡茶和湖南熙茯茶中的主要真菌,并探讨其产消化酶活性。方法采用平板涂布法分离不同发酵茶中的真菌,通过其ITS序列进行分子鉴定;利用平板透明圈法测定不同真菌的产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶活性。结果从4种发酵茶中共分离出8种真菌,其中,在云南普洱茶中分离出2种真菌,分别为篮状菌(Talaromyces. sp.)和T.variabilis;广州小青柑中分离出3种真菌,分别为阿曲霉(Aspergillus amstelodami)、烟曲霉(A.fumigatus)和绳状篮状菌(T.funiculosus);广西六堡茶中分离出2种真菌,分别为黑曲霉(A.niger)和冠突曲霉(A.cristatus);湖南熙茯茶中仅分离出谢瓦曲霉(A.chevalieri)。其中Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.niger、A.amstelodami、A.fumigatus、T.funiculosus有产纤维素酶活性,Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.cristatus、A.fumigatus、T.funiculosus有产淀粉酶活性,Talaromyces. sp.、T.variabilis、A.niger、A.fumigatus、T.funiculosus有产蛋白酶活性,A.niger有产脂肪酶活性。在8种真菌中,T.variabilis、烟曲霉和绳状篮状菌可同时产纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶;黑曲霉能同时产纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶;冠突曲霉仅有产淀粉酶活性;阿曲霉仅有产纤维素酶活性。通过比较不同真菌的产酶活性表明,烟曲霉的产蛋白酶活性能力最强;Talaromyces sp.的产纤维酶活性能力最强;Talaromyces. sp.和绳状篮状菌的产淀粉酶活性最强。结论发酵茶的真菌以曲霉菌属Aspergillus、散囊菌属Eurotium和篮状菌属Talaromyces为主,多数真菌具有产消化酶活性,这些酶可能在茶叶发酵过程中起重要作用,并影响发酵茶叶的品质。     

雪茄茄衣人工发酵过程中叶面微生物区系研究

在恒温恒湿箱内对海南光村茄衣发酵42 d,并对整个过程中烟叶表面微生物进行分离、纯化和鉴定,研究探讨了茄衣人工发酵过程中叶面微生物区系的变化。结果显示:在茄衣人工发酵过程中细菌为优势菌群,霉菌所占比例很小,没有检测出放线菌和酵母菌;所有细菌均为芽孢杆菌,数量由高到低依次是:巨大芽孢杆菌枯草芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌环状芽孢杆菌蕈状芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌短小芽孢杆菌凝结芽孢杆菌;茄衣表面各菌种数量在发酵过程前24 d内呈急剧下降趋势;巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌为雪茄茄衣人工发酵中的优势菌种,分别占芽孢杆菌数量的50%以上和19%左右。     

DGGE法初步解析茯砖茶发花过程中真菌群落结构

为研究茯砖茶发花过程中真菌群落结构和种类,对发花过程中不同时段真菌落18S rDNA高变区进行扩增,并对真菌变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱中条带进行克隆、测序和序列比对分析。结果表明:茯砖茶发花前后时段其优势菌不同,以发花过程的第10天为临界点,0~8 d和10~14 d,前后存在2个差异较大的真菌优势种群结构的演变,10天前以好干性酵母菌、毕赤酵母、假丝酵母为优势菌,10 d后以阿姆斯特丹散囊菌、好干性酵母菌为优势菌;18S rDNA高变区比对结果表明,茯砖茶发花过程中有好干性酵母、汉逊德巴利酵母、酿酒酵母、假丝酵母菌、热带假丝酵母、路德酵母、毕赤酵母、牧草红酵母、隐球酵母、阿姆斯特丹散囊菌、曲霉、毛霉、安大略假单胞菌、真皮毛孢子菌、青霉、白地霉、灰绿曲霉、蜡叶散囊菌等;比对结果表明存在3株好干性酵母菌和5株阿姆斯特丹散囊菌,说明优势菌存在多种生态类型。采用DGGE指纹图谱能更系统、更真实地反映茯砖茶发花发酵过程中真菌群落结构和多样性动态变化。     

藏仔猪粪便真菌菌群多样性分析

为探究西藏地区藏仔猪粪便中真菌菌群结构,本研究采用ITS1序列分析新生藏仔猪和断奶藏仔猪新鲜粪便中真菌的多样性。结果表明：从5头新生藏仔猪新鲜粪便中,共鉴定出5个门、13个纲、 25个目、33个科和38个属的真菌;从5头断奶藏仔猪新鲜粪便中,共鉴定出5个门、12个纲、20个目、24个科和28个属的真菌。子囊菌门和担子菌门为优势门,占门级分类的86.35%;布勒担菌科、虫草科、丛赤壳科、曲霉科、丝孢酵母菌科、肉杯菌科、酵母菌科和毕赤酵母菌科为优势科,占科级分类的54.38%。随着藏仔猪的生长,其粪便中真菌菌群的数量和优势真菌的相对丰度均发生变化,这说明不同生长发育阶段会影响藏仔猪粪便中真菌的多样性。     

大曲酒微生物区系的初步研究

通过对四个酒厂发酵料的分离、培养,共获得霉菌５６种;细菌３４种;酵母菌２１种;放线菌３种。确定了优势菌株。发现在大曲酒发酵过程中,微生物数量在不同发酵期里规律变化。     

柑橘内生真菌的分离鉴定及其发酵产物对柑橘溃疡病菌的抑制活性

本研究从柑橘抗病品种的健康植株不同组织中分离纯化和鉴定内生真菌,并测定其发酵产物对柑橘溃疡病菌的抑制活性,以明确柑橘抗病品种中内生真菌的组成及其产抗柑橘溃疡病菌活性代谢产物的潜力,为柑橘溃疡病抗菌剂的开发奠定基础。该研究通过组织培养法分离内生真菌,采用形态学和分子生物学方法对其进行鉴定; 基于前期的拮抗预试验结果,选取代表性菌株进行发酵培养,通过乙酸乙酯浸提、真空抽滤、旋转蒸发浓缩制备粗提物; 采用带毒平板涂布法测定不同菌株发酵产物乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌的抑制活性。结果表明:(1)共分离得到72株内生真菌,归为2门(Ascomycota、Basidiomycota)、14个属,其中优势属为刺盘孢属(Colletotrichum)、球座菌属(Guignardia)、链格孢属(Alternaria)和镰刀菌属(Fusarium)。(2)不同柑橘品种中内生真菌多样性指数为温州蜜柑(桂林)>沙糖桔(桂林)>沙糖桔(梧州)。(3)不同组织中内生真菌多样性变化因地理位置差异而有所不同,采自桂林的温州蜜柑和沙糖桔均为叶片中的内生真菌的多样性高于枝条,而采自梧州的沙糖桔为叶片中的多样性低于枝条,并且采自梧州的柑橘样品与采自桂林的柑橘样品中的内生真菌相似性低。(4)测定了30株内生真菌乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌的抑制活性,其中29株菌株表现出不同程度抑制活性。不同柑橘品种中的优势属的MIC介于0.312 5～10 mg·mL^-1之间,特有属的MIC介于0.156～5 mg·mL^-1,共有属镰刀菌属的MIC介于0.312 5～2.5 mg·mL^-1之间。研究结果表明柑橘抗病品种中内生真菌具有丰富多样性,并且其发酵提取物普遍对柑橘溃疡病菌具有抑制作用。特有属抑菌活性总体优于优势属,共有属镰刀菌属在不同柑橘抗病品种中均具有显著抑菌效果。     

低温大曲酵母菌分离和计数培养方法优化

低温大曲是清香型白酒酿造的核心因素之一,为酿造过程提供了物系、酶系和菌系。酵母菌是白酒发酵过程中最重要的功能微生物类群,研究大曲中的酵母菌种类和含量具有重要意义,对大曲质量评价也具有重要参考价值。但用常规酵母菌分离技术和培养基从大曲中分离酵母菌时易受优势丝状真菌（霉菌）的干扰,霉菌常常很快长满培养皿,将酵母菌覆盖,难以对酵母菌进行定量计数、观察和分离纯化。本研究根据酒醅发酵过程中随乙酸和乳酸含量的升高,霉菌含量急剧降低而酵母菌含量逐渐升高的现象,用常规培养基YPD为基础培养基,测试了添加不同量的乙酸、乳酸和丙酸（后者为常用食品防腐和防霉剂）,以及不同比例的乙酸乳酸组合物,对低温大曲中霉菌的抑制效果和对酵母菌生长的影响进行探究,发现在灭菌后的YPD中添加3.3mL/L乙酸、2.0mL/L丙酸或在乙酸乳酸1:3的情况下添加2.0mL/L乙酸,30℃培养3-5d之内可有效抑制低温大曲中的霉菌,实现对酵母菌的有效分离、计数和纯化培养,而单加乳酸对霉菌,特别是黄曲霉的抑制效果差。随后测试了以前我们从清香型白酒大曲和酒醅发酵过程中分离的13属18种酵母菌在这些培养基上的生长情况,发现这些酵母菌中的绝大多数,尤其是大曲和酒醅中的优势酵母菌种,均可以在这些加酸培养基上良好生长。综合考虑培养基的成本、配制的简便性及分离效果等因素,本研究推荐将灭菌后添加3.3mL/L乙酸的YPD固体培养基作为低温大曲酵母菌分离和定量计数的优化培养基。     

鸡粪堆肥的微生物变化规律研究

目的:研究鸡粪堆肥中细菌、放线菌和真菌数量的变化规律,为有机堆肥提供技术参数。方法:采取稀释倒平板法和涂布法对堆肥样品进行计数。结果:在发酵过程中,菌数量变化在肥料表面上基本是呈先下降后上升最后达到稳定状态。其中细菌在30cm和60cm深处趋于平稳,真菌在30cm和60cm深处先上升再下降再上升,在第12d后有个急速下降的过程。放线菌在30cm和60cm深处数量比较少。而在后熟发酵过程中,3种菌数的变化规律比较平稳结论:细菌和真菌的生长和繁殖都会抑制放线菌的生长,其中细菌作用大,真菌次之。     

藏灵菇微生物种群结构的分子特性研究*

用PCR-DGGE指纹技术,研究了藏灵菇中微生物多样性及藏灵菇发酵奶发酵过程微生物种群动力学。结果表明,藏灵菇中细菌的种群结构较酵母菌的复杂,不同来源的藏灵菇中细菌种群结构的相似性为78%~84%,酵母菌种群结构的相似性为80%~92%。发酵过程中细菌种群结构变化图谱中的条带B和条带E,以及酵母菌种群结构变化图谱中的条带N贯穿于整个发酵过程,是发酵过程的优势菌。序列分析表明,细菌种群结构的DGGE图谱中的绝大多数条带与乳酸菌相对应,其中最亮条带(条带E)的序列与乳酸乳球菌的相似性为100%。     

藏灵菇微生物种群结构的分子特性研究

用PCR—DGGE指纹技术,研究了藏灵菇中微生物多样性及藏灵菇发酵奶发酵过程微生物种群动力学。结果表明,藏灵菇中细菌的种群结构较酵母菌的复杂,不同来源的藏灵菇中细菌种群结构的相似性为78％-84％,酵母菌种群结构的相似性为80％-92％。发酵过程中细菌种群结构变化图谱中的条带B和条带E,以及酵母菌种群结构变化图谱中的条带N贯穿于整个发酵过程,是发酵过程的优势菌。序列分析表明,细菌种群结构的DGGE图谱中的绝大多数条带与乳酸菌相对应,其中最亮条带（条带E）的序列与乳酸乳球菌的相似性为100％。     

普洱茶中功能性微生物的筛选及其对普洱茶感官品质的影响

普洱茶的渥堆发酵过程是以晒青毛茶的内含成分为基础,在微生物分泌的胞外酶及湿热作用下,发生一系列化学变化,最终形成普洱茶独特的风味。采用稀释涂布法,根据产酶微生物的特性,经过固体平板初筛和液体茶汤培养基复筛,从普洱茶中分离得到若干株产酶菌株,并从中挑选优良菌株接种普洱茶固体发酵,考察其对普洱茶感官品质的影响。经分子生物学鉴定,D13-16为米曲霉(Aspergillus oryzae),相似度为98.62%;GJ-02为米根霉(Rhizopus cryzae),相似度为98.57%;XW-10和DF-03均为黑曲霉(Aspergillus niger),相似度分别为99.10%和99.92%。结果表明:普洱茶香气的形成主要与蛋白酶产生菌有关,DB-16发酵后香气评分达到31分(对照28,总分40);汤色主要受多酚氧化酶产生菌的影响,DF-03发酵后汤色评分达到19分(对照12,总分20);而这四种功能性微生物均在不同程度上促进了普洱茶滋味的形成。     

草菇培养料二次发酵过程中真菌的群落结构

【目的】明确草菇培养料二次发酵过程中真菌群落变化情况,确定发酵不同阶段的优势菌群,为能够在分子水平上准确高效监测发酵过程,解析发酵机制奠定基础。【方法】采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)及克隆菌株18S r DNA序列分析技术对草菇培养料二次发酵不同阶段真菌群落结构进行分析。【结果】DGGE图谱显示,不同处理真菌群落多样性存在差异,发酵高温阶段条带多样性较高,而且优势条带及相对含量也在发生动态变化。回收克隆不同发酵阶段的20个优势菌株中,9个菌株为非培养未知真核生物或真菌,其余克隆菌株为非培养散子囊菌目(Eurotiales)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、曲霉菌属(Aspergillus sp.)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Melanocarpus albomyces、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)、轮枝菌属(Verticillium sp.)、普通青霉(Penicillium commune)、三角孢小囊菌(Microascus trigonosporus)和Trichosporon lactis真菌,其中14株(70%)克隆菌株为耐热真菌。【结论】草菇培养料二次发酵过程中真菌群落结构及优势菌群在发生着动态的变化。     

酱香型白酒酿造酒醅中酵母菌多样性研究

为解析酱香型白酒酿造酒醅中酵母菌的菌群结构,获取酒醅中的主要酵母菌,采用高通量测序法分析酱香型白酒酒醅中酵母菌多样性及主要功能菌群,同时采用可培养分离方法获取酒醅中酵母菌活性菌株。从酱香型白酒下沙至五轮次酒醅中共检出59个属、129个种的酵母菌,分离得到酵母菌活性菌株41种,检测到的酵母菌种类与获得的酵母菌活菌在各香型白酒中最多。不同时期酒醅中的酵母菌种类和数量差异明显,其中下沙、造沙轮次以Pichia kudriavzevii为绝对优势酵母菌;一至五轮次随着轮次的递增,酒醅中优势酵母菌的种类增多,其中主要的优势酵母菌有Pichia kudriavzevii、Pichia manshurica、Zygosaccharomyces bailii、Saccharomyces cerevisiae、Candida apicola。酱香型白酒酒醅中蕴藏着极其丰富的酵母菌资源,对酵母菌菌群结构的解析有助于科学地认识酱香型白酒酿造过程中产酒与风味代谢机理,为发酵过程的调控提供一定依据。