拟南芥PKS2与CAM4蛋白互作研究

植物蓝光受体向光素(phototropin,PHOT)介导许多生理反应,现已从拟南芥中分离了其下游的一些信号转导组分。前期研究表明,拟南芥光敏色素底物PKS家族成员PKS1与部分Ca2+结合蛋白钙调素(calmodulin,CAM)成员互作,参与PHOT2介导的强蓝光诱导下胚轴向光反应。旨在探讨PKS2和CAM4之间的互作关系,首先用RT-PCR技术得到PKS2和CAM4的c DNA全长序列。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术,从体外与体内证实PKS2和CAM4能相互作用。此结果进一步丰富了PKS家族与CAM之间的联系,为深入解析PHOT功能研究奠定基础。     

拟南芥WRKY61转录因子的转录活性与互作蛋白分析

该研究采用双荧光素酶报告系统、酵母双杂交和双分子荧光互补实验,对拟南芥AtWRKY61的转录活性及与AtWRKY61转录因子的互作蛋白进行了分析,并用qRT-PCR方法分析AtWRKY61对多种非生物逆境的响应特征,为进一步揭示AtWRKY61的功能与分子调控机制奠定基础。绿色荧光蛋白介导的亚细胞定位分析显示,AtWRKY61定位于细胞核内;基于原生质体的双荧光素酶报告系统和酵母实验发现,AtWRKY61具有转录抑制活性。qRT-PCR分析表明,AtWRKY61对多种非生物逆境的处理具有明显的响应,可能是在多条信号通路中发挥作用。酵母双杂交与双分子荧光互补分析表明,AtWRKY61与自身以及同组的AtWRKY9和AtWRKY72存在互作关系,暗示可能通过形成WRKY复合物来行使特定的转录抑制功能。     

拟南芥AtJ3通过核质转运调控植物质膜H~+-ATPase活性与ABA响应

拟南芥AtJ3(Arabidopsis thaliana Dna J homolog 3)为一蛋白分子伴侣,在植物体内可通过与PKS5(SOS2-like protein kinase 5)蛋白激酶形成复合物来抑制PKS5的活性;同时AtJ3-PKS5复合物可对质膜上H~+-ATPase质子转运活性进行正向调节,并参与对外源ABA的响应。为揭示AtJ3-PKS5复合物参与质膜H~+-ATPase活性调节及对外源ABA响应中的作用,本研究以拟南芥AtJ3、PKS5不同突变体为材料,在盐及ABA共同处理下对AtJ3-PKS5复合物的功能及作用机制进行了探讨。结果显示,在2种因素共同处理下,AtJ3-PKS5复合物可同时对处理因素进行响应。即AtJ3-PKS5复合物可对质膜上H~+-ATPase质子转运活性进行调节,并使细胞内p H值发生变化,同时还可诱导ABI5下游ABA响应基因的表达;外源ABA可引起AtJ3从细胞核向细胞质的转运,从而增强了AtJ3对H~+-ATPase活性的调节。说明AtJ3-PKS5复合物在对H~+-ATPase活性调节及对外源ABA响应的交互代谢途径中起着关键调节子的作用。     

拟南芥中WRKY31转录因子的转录活性与互作蛋白分析

为深化对AtWRKY基因家族中功能尚未被报道成员的认识,探究拟南芥中WRKY转录因子基因在非生物逆境响应中的作用与可能的机制,通过对AtWRKY31进行亚细胞定位以及转录活性分析,并利用qRT-PCR检测AtWRKY31在不同逆境处理1、3和12 h后的表达变化,通过酵母双杂交(Y2H)和双分子荧光互补(BiFC)对其互作蛋白进行了筛选与验证。发现AtWRKY31定位于细胞核,具有转录抑制作用,且表达受热害、低钾、低氮等处理显著的抑制。此外,发现WRKY31可以与WRKY31、WRKY6和WRKY42在体内发生互作。拟南芥WRKY31作为一个转录抑制子,可能通过与WRKY6和WRKY42转录因子互作来参与调控对一些非生物逆境的应答。     

钙传感蛋白互作激酶CIPK14参与拟南芥盐和ABA胁迫应答调节

钙和蛋白激酶在植物胁迫应答过程中起重要作用．本研究以拟南芥蛋白激酶CIPKl4的T—DNA插入突变体为材料,系统研究了CIPK14基因在不同组织与生长发育期的表达情况,和CIPKl4基因的钙调节属性及其在胁迫应答过程中的作用．研究发现CIPKl4基因在拟南芥根、茎、叶、花各组织器官中都有所表达,其中花器官和根部表达量较为显著;不同阶段比较发现CIPKl4在幼苗期具有较高的转录水平．研究同时发现,ABA和盐胁迫能激活CIPKl4基因的转录;CIPKl4T-DNA插入突变体中一系列胁迫应答基因的转录水平全都不同程度地降低或表达滞后,说明CIPKl4基因在胁迫应答中起作用．另外,CIPKl4突变体的种子萌发和根伸长对各种渗透胁迫敏感,并且ABA合成抑制剂哒草伏（Norflurazon）能部分恢复突变体对ABA,盐等的敏感表型．进一步证明CIPKl4是胁迫应答相关基因．研究还发现,CIPKl4的转录受到极端浓度下外源钙离子的激活,另外在一定胁迫条件下,突变体中RD29A基因的表达对外源钙离子浓度变化不敏感,说明CIPKl4基因功能缺失降低了受钙调节的胁迫相关基因对外源钙的敏感性．相应的表型分析发现,突变体种子萌发和根伸长与野生型相比对外源钙敏感性下降,进一步证明CIPKl4基因接受钙信号调节,并作用于拟南芥ABA和盐胁迫应答信号途径,激活胁迫相关转录因子．     

RNA结合蛋白与RNA互作鉴定技术

RNA结合蛋白（RNA binding proteins,RBPs）通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）研究的快速发展,催生了多种RBPs RNAs相互作用鉴定技术。这些技术反之又推动了 RNA领域的研究进程。本文对紫外交联免疫沉淀（ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation,CLIP）,CLIP cDNA文库高通量测序 (high-throughput sequencing of CLIP cDNA library,HITS-CLIP),光活化核苷增强的CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,PAR-CLIP),单核苷酸分离CLIP (individual nucleotide resolution CLIP,iCLIP),TRIBE (targets of RNA-binding protein identified by editing),RNA 标记,相互作用组捕获(interactome capture,IC) 和SerIC (serial RNA interactome capture)等RBPs-RNAs相互作用鉴定技术的基本原理和优缺点以及应用进行综述。     

与PRRSV nsp11互作的宿主细胞蛋白鉴定及生物信息学分析

【目的】研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp11与宿主细胞蛋白之间的相互作用,对于揭示nsp11在病毒复制过程中发挥的功能至关重要。【方法】在病毒感染细胞的基础上,利用nsp11的单克隆抗体,采用免疫沉淀结合串联质谱的方法,筛选与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,并对所筛选出的宿主细胞蛋白进行了GO注释、COG注释和KEGG代谢通路注释;选取筛选出的宿主细胞蛋白IRAK1,利用免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术鉴定其与nsp11之间的相互作用。【结果】与空白对照组相比,病毒感染组中出现3条差异带;经质谱分析共筛选得到了201个与nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,分别与蛋白质代谢、细胞信号通路转导以及病原致病性等密切相关;在生物信息学分析的基础上,实验验证了nsp11确与宿主细胞蛋白IRAK1进行相互作用。【结论】鉴定出与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,生物信息学分析显示它们在病毒的复制和致病过程中发挥重要作用。研究结果为探究nsp11的生物学功能指明了方向,也为研究宿主细胞蛋白与病毒蛋白间的相互作用及其调控病毒复制和致病性的分子机制奠定了基础。     

拟南芥F-box蛋白FKF1与转录因子FUL互作调控开花研究

F-box蛋白FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX 1(FKF1)参与调控拟南芥光周期开花,但其分子机制尚不完全清楚。本研究通过体内和体外实验,证明FKF1与转录因子FRUITFULL(FUL)相互作用。qRT-PCR和Western blot结果显示,FKF1正调节FUL的转录水平,但不影响FUL蛋白的稳定性。遗传分析结果显示,35S-FKF1-Myc / ful-8双突变体的开花表型以及开花基因FLOWERING LOCUS T(FT)的转录水平与ful-8突变体相一致。研究结果表明FKF1可通过与FUL互作,在FUL的上游促进FT表达,进而促进开花。     

通过免疫共沉淀和蛋白质谱鉴定与拟南芥DSP1互作的蛋白

拟南芥(Arabidopsis thaliana)DSP1(defective in snRNA processing 1)蛋白是DSP复合物的主要成员,其参与snRNA转录和剪切成熟,并在植物生长发育的多个方面发挥重要作用。本研究利用在线平台分析了DSP1蛋白的理化性质,并预测了DSP1蛋白的二级结构和高级结构。在全长DSP1蛋白无法在细菌表达系统中诱导的情况下,通过无缝克隆技术成功构建包含DSP1蛋白N端(DSP1-N)的重组蛋白表达载体,并且成功纯化了GST-DSP1-N重组蛋白,进一步制备了DSP1的特异性多克隆抗体。通过免疫共沉淀和液相色谱串联技术,共鉴定出45个潜在的与DSP1互作的蛋白,后续的功能聚类分析结果暗示DSP1蛋白可能通过蛋白质代谢、核酸结合活性等方面发挥生物学功能。本研究可为进一步揭示DSP1蛋白在植物中的功能提供研究目标和方向。     

甲状腺激素受体与Drosha蛋白互作鉴定分析

为了证明甲状腺激素受体(THR)与Drosha蛋白之间的相互作用,以HEK293细胞为材料,利用免疫共沉淀的方法获得蛋白免疫复合物,再经Western blot检测和质谱分析。结果表明,用THR抗体Western blot检测出有THR蛋白的存在,反之Drosha抗体Western blot检测有Drosha蛋白的存在;同时,THR抗体免疫沉淀后的质谱鉴定存在Drosha蛋白,Drosha抗体免疫沉淀后的质谱鉴定也存在THR蛋白,由此说明甲状腺激素受体与Drosha蛋白之间确实存在相互作用。并且,初步筛选出与两者共同作用的54个蛋白,经Go聚类分析揭示鉴定蛋白主要是细胞膜和细胞核中成分,参与细胞迁移、细胞凋亡、蛋白代谢、免疫应答、信号通路调节及转录调控等生物途径,具有核酸结合、细胞骨架结合等分子功能。     

拟南芥花粉管与柱头互作的乙醇代谢耦合模型

依据拟南芥公开的代谢途径数据库,构建了基于酶与酶的拟南芥代谢网络模型。利用拟南芥花粉管与柱头互作过程中的转录组数据,挖掘出花粉管与柱头在互作过程中的特异表达基因,进一步将特异表达的酶基因匹配到已构建的拟南芥代谢网络中,根据网络拓扑模型中的节点(酶)之间的共表达关联性,最后给出了一个拟南芥花粉管与柱头互作的乙醇代谢耦合模型。     

L-periaxin与DRP2蛋白互作的精细分析

轴周蛋白L-periaxin作为外周神经系统中特异表达的骨架蛋白之一,在髓鞘成熟与维护过程中发挥重要作用.肌营养不良相关蛋白2(DRP2)是目前报道与L-periaxin存在明确相互作用的唯一蛋白,但两蛋白精细的互作区域及互作的分子机制仍不清楚.本研究通过双分子荧光互补、免疫共沉淀、GST pull-down、荧光光谱、细胞定位等技术,进一步揭示了periaxin蛋白的核定位信号NLS结构域上3段不同的亚结构域中,NLS1只参与periaxin蛋白的核定位,NLS2和NLS3参与DRP2蛋白的互作;DRP2蛋白中spectrin like2和WW结构域参与和L-periaxin蛋白的互作.L-periaxin与DRP2互作区域的精细定位,为进一步在蛋白水平探讨L-periaxin与脱髓鞘型腓骨肌萎缩症4F亚型的发生机制之间的关系提供参考.     

小麦泛素结合酶TaE2的表达分析及蛋白互作

以小麦抗逆相关蛋白TaMAPK2作为诱饵,利用酵母双杂交系统筛选小麦cDNA融合表达文库,获得候选蛋白TaE2。生物信息学分析表明,TaE2基因属于泛素结合酶UCE2基因家族成员。半定量RT-PCR结果表明TaE2基因在小麦根、茎、叶和种子等器官中均有表达,荧光定量PCR显示TaE2基因在干旱、高盐和ABA胁迫下均上调表达。利用原核表达获得GST-E2融合蛋白并使用蛋白标记亲和层析柱纯化。本文报道的小麦TaE2基因,为进一步分析泛素蛋白酶体途径在小麦逆境响应中的功能和机制打下基础。     

AtSARK互作蛋白的筛选与鉴定

植物LRR型类受体蛋白激酶在植物生命活动中发挥着重要作用。前期研究发现了一个通过生长素和乙烯的协同作用参与拟南芥叶片衰老过程正调控的类受体蛋白激酶, AtSARK。为深入研究 AtSARK 蛋白的作用机制, 文章采用酵母双杂交系统, 以AtSARK胞内域（AtSARK-CD）为诱饵蛋白, 对拟南芥均一化cDNA文库进行筛选, 得到83个AtSARK的候选互作组分, 经过复筛, 初步发现AtSARK的互作组分包括14-3-3蛋白、FKBP-型肽脯氨酰顺反异构酶、醛缩酶超家族成员、RING/U-box 超家族成员以及WRKY转录因子家族成员。我们对其中一个功能未知的醛缩酶家族基因AtFBA5 （AT4G26530）的表达模式进行了分析, 并用GST pulldown实验证实了AtSARK-CD与 AtFBA5间存在直接的相互作用。At-SARK互作组分的文库筛选及AtFBA5的分离有利于进一步研究 AtSARK 基因在衰老信号通路中的作用机制。     

甘蓝型油菜钙依赖蛋白激酶6(BnaCPK6)的定位与互作蛋白分析

为了探究甘蓝型油菜中钙依赖蛋白激酶(calcium dependent protein kinase, CPK)在植物对逆境响应中的作用和机制,同时为油菜品质的升级改良发掘新的基因资源,开展了对于BnaCPK6研究的分子生物学试验。首先,通过在本氏烟草中瞬时表达BnaCPK6与GFP融合蛋白来检测它的亚细胞定位情况;其次,利用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation)试验来检测BnaCPK6与ABA信号通路中转录因子BanABF1/3/4、BnaABI5、BnaAREB3的相互作用情况。结果显示BnaCPK6具有典型的钙依赖蛋白激酶特征,N端具有潜在的棕榈酰化和豆蔻酰化位点,并且与AtCPK6在进化上有着很高的同源性。亚细胞定位的结果发现BnaCPK6主要分布于细胞膜和细胞核中。同时,双分子荧光互补试验还发现BnaCPK6与调控ABA信号转导的关键转录因子BnaABF3/4、BnaABI5以及BnaAREB3之间存在相互作用。本研究为进一步研究BnaCPK6在ABA信号通路中的作用提供了依据。     

胃(H~(+)+K~(+))-ATPase与急性胃粘膜病变的关系的研究

 本文对急性胃粘膜病变与胃粘膜(H~(+)+K~(+))-ATP_ase的关系作了初步探讨,实验结果说明以消炎痛为诱因引起大白鼠急性胃粘膜病变时胃粘膜上的胃酸分泌的质子泵(H~(+)+K~(+))-ATP_ase活力受到抑制。在离体实验中低浓度的消炎痛<2μmol,大白鼠胃粘膜(H~(+)+K~(+))-ATP_ase的活力便受到显著的抑制,在整体实验中维酶素对消炎痛引起的胃粘膜(H~(+)+K~(+))-ATP_ase的抑制具有保护作用。     

白桦开花抑制因子BpFLC与BpSVP蛋白互作的结构域筛选与互作验证

为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理。从重组质粒pGBKT7-BpFLC、pGBKT7-BpSVP分别克隆出6个BpFLC截短体（BpFLC1~6）和6个BpSVP截短体（BpSVP1~6）,分别编码MI、MIK、K、IKC、KC和C域。在酵母Y2HGold菌中,分别共转诱饵质粒pGBKT7-BpFLC1~6×pGADT7-BpSVP及pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP1~6。酵母转化子Y2HGold［pGBKT7-BpFLC2~5×pGADT7-BpSVP］,可在选择性固体培养基TDO、QTO/A上生长,并在QDO/A/X上长出蓝色菌落,表明BpSVP能与截短体蛋白BpFLC2~5异源结合。此外酵母Y2HGold［pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP2~5］也能同时激活报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。进一步研究发现：Y2HGold［pGBKT7-BpFLC3×pGADT7-BpSVP3］存在相互作用,表明BpFLC的K域与BpSVP的K域能够异源结合,是介导BpFLC与BpVP蛋白互作的关键结构域。     

类蛋白质互作网络hub蛋白与其结构域关联分析

hub蛋白质作为参与较多互作的"中心蛋白".在实现蛋白质功能和生命活动中发挥着关键作用.而结构域作为蛋白质上的基本功能区域,决定着蛋白质功能及蛋白质互作的情况.互作网络中hub蛋白质和结构域对于蛋白质功能的实现均起到决定性的作用.对蛋白质互作与结构域的关系分析表明.蛋白质互作与结构域之间存在着密切的联系.对人类蛋白质互作网络中的hub蛋白与结构域进行关联分析.探讨hub蛋白及其互作partner与结构域数目之间的关系,并通过hub蛋白质之间的互作对相应结构域的关系进行进一步的论证.     

黑腹果蝇头部中RNA结合蛋白RBP9的互作蛋白筛选

【目的】筛选RNA结合蛋白RBP9在黑腹果蝇Drosophila melanogaster头部中的互作蛋白。【方法】利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,分别将3×Flag和V5标签编码序列插入到黑腹果蝇成虫头中RBP9和FNE基因起始密码子ATG的后面,构建黑腹果蝇转基因品系3×Flag-RBP 9/3×Flag-RBP9(3FRBP9)和V5-FNE/V5-FNE(VFNE);利用免疫沉淀和质谱法鉴定黑腹果蝇3FRBP9和野生型品系成虫头部中RBP9的互作蛋白并进行生物信息学分析。利用免疫共沉淀方法检测RBP9与FNE蛋白之间的相互作用。【结果】质谱法从黑腹果蝇成虫头部共鉴定了190个与RBP9相互作用的蛋白,其中包括ELAV和FNE。KEGG富集分析显示这些蛋白的基因主要参与核糖体、碳代谢、三羧酸循环、氨基酸生物合成等通路。免疫共沉淀实验结果验证了RBP9与FNE蛋白之间存在相互作用。【结论】RNA结合蛋白ELAV家族成员在黑腹果蝇成虫头部中具有相互作用。本研究为RBP9在果蝇神经系统发育中的功能研究提供了重要实验依据。     

生物信息学分析人类病毒互作广谱蛋白的特征

了解病毒与人类蛋白的相互作用对于理解病毒感染宿主机制非常重要,已有研究主要集中在病毒如何进入宿主细胞、复制、扩散和致病等方向上,对病毒与人类蛋白的相互作用模式缺乏系统研究。本研究中我们构建了迄今为止最全面的病毒与人类之间的蛋白相互作用网络,涵盖来自218种病毒的1 674种蛋白与来自人类的13 724种蛋白的108 832对蛋白相互作用;在此基础上鉴定出109个至少与12种病毒家族存在蛋白相互作用的人类蛋白,定义为人类的病毒互作广谱蛋白（简称广谱蛋白）;从结构、功能、蛋白互作网络以及组织表达量等四个方面系统地分析了广谱蛋白的特征,发现广谱蛋白相较于非广谱蛋白以及其它人类蛋白具有更密集的转角结构、更多的结构域、更高的网络中心度和组织表达量,表明它们可能在病毒感染宿主过程中起着重要作用。本研究有助于加深我们对于病毒感染人类模式的理解,同时也对进一步探究病毒与疾病之间的关联有一定的帮助。