东方肉座菌EU7-22纤维素酶基因的克隆及序列分析

东方肉座菌EU7-22与XC-9、里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉、斜卧青霉进行产纤维素酶比较,结果表明菌株EU7-22具有较高的产纤维素酶能力及完整的纤维素酶系.根据里氏木霉和绿色木霉的外切葡聚糖酶,内切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶相关基因序列,设计引物PCR扩增出菌株EU7-22 cbhⅠ、cbhⅡ、egⅠ、egⅡ及bgl Ⅰ.基因序列经NCBI Blast分析表明,cbhⅠ与绿色木霉cbh1基因(FJ871063)同源性最高达99％;cbhⅡ与康宁木霉cbh2基因(DQ504304)同源性最高达99％;eg Ⅰ与长枝木霉egl基因(GU144298)同源性最高达99％;egⅡ与绿色木霉eg2基因(EF602036)同源性最高达99％;bglⅠ与菌株Trichoderma sp.SSL bgl基因(FJ040193)同源性最高达100％.5种纤维素酶基因编码的相应氨基酸序列与其他木霉纤维素酶的氨基酸序列相似性也非常高.对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白的分子量、等电点、N-糖基化位点、信号肽序列进行分析;对纤维素结合区及糖基水解酶家族特征结构区进行了定位;用SWISS-Model模拟了酶蛋白的三级结构.     

海南仙人掌matK基因的克隆和序列分析

2015年12月,为了分析采自海南海口城西仙人掌mat K基因的序列及同源关系,利用RNA plant Reagent试剂盒提取仙人掌叶总RNA,反转录成第一链c DNA。同时设计仙人掌成熟酶K基因(mat K)的1对保守引物,利用RT-PCR的方法扩增仙人掌成熟酶K基因,所得序列经Blastn进行比对,发现与已报道的22个仙人掌mat K基因核苷酸序列一致;利用Blastn的Distance tree of results构建系统进化树,结果显示海南仙人掌mat K基因与其它报道的30个仙人掌mat K基因同源性最高,同源性在99%以上,属于同一组,而与Opuntia basilaris(Gen Bank accession No.JF786750.1)同源性最低,为96.6%。本研究利用RT-PCR方法获得了仙人掌成熟酶K基因序列,同时构建的系统进化树确定了该仙人掌成熟酶K基因的同源关系。本结果将为海南仙人掌的进化研究提供科学线索。     

应用whaF基因序列鉴定20型肺炎链球菌血清型

目的应用wha F基因测序方法,对20型肺炎链球菌进行血清型鉴定。方法采用血清凝集法和用20型肺炎链球菌型特异性基因(wci L基因)合成的引物进行PCR扩增,对中国医学细菌保藏管理中心所保藏的20型肺炎链球菌进行血清学鉴定;根据Gen Bank上发表的wha F基因设计合成引物,PCR扩增wha F基因,利用测序获得基因序列,分析wha F基因多态性。结果 7株20型肺炎链球菌菌株均能与20型血清产生血清凝集反应,wci L基因PCR扩增产物,可见与预期相符大小500 bp的特异性条带。wha F基因PCR扩增产物,除20-3外,其余6株菌均可见1 000bp大小与预期相符的PCR扩增产物。wha F基因测序和分析显示:20-2、20-4、20-5、20-7与20B亚型(Gen Bank accession No.:CR931679和JQ653093)的wha F基因序列相同;20-6与20A亚型(Gen Bank accession No.:JQ653094)的wha F基因序列相同;20-1与CR931679和JQ653093相比,在898有点突变(A→C)。20-3的wha F基因比20A亚型和20B亚型的wha F基因均少了约600 bp。结论 20-6为20A亚型肺炎链球菌,20-2、20-4、20-5、20-7均为20B亚型肺炎链球菌。     

裂殖壶菌丙二酸单酰转移酶(MAT)基因的克隆与序列分析

二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的多不饱和脂肪酸,裂殖壶菌(Schizochytrium)因富含DHA成为当前的研究热点。丙二酸单酰转移酶(MAT)是该菌合成DHA的关键酶。以Schizochytriumsp.FJU-512cDNA文库中的EST序列contig417(GenBank accession No.EF483907)为基础,获得了丙二酸单酰转移酶基因的DNA序列和cDNA序列。序列分析表明,cDNA序列与DNA序列完全一致,开放阅读框全长1 176bp,编码391个氨基酸,且具备该类酶氨基酸序列的两个经典保守区。对该蛋白进行系统发育分析,构建进化树,结果显示,该蛋白同Schizochytriumsp.TIO01的丙二酰辅酶A-ACP转移酶(MCAT)亲缘关系最近。     

观赏向日葵ζ-胡萝卜素脱氢酶基因HaZDS的克隆与表达分析

采用RT-PCR和RACE技术,从观赏向日葵新品种闽葵3号黄色花瓣中克隆获得类胡萝卜素合成途径关键酶基因ZDS,命名为Ha ZDS(Gen Bank No.KF263657),该基因c DNA全长2069 bp,具有一个1761 bp的完整开放阅读框(ORF),编码587个氨基酸。推导氨基酸序列分析表明,Ha ZDS蛋白在N-末端区域含有一个叶绿体转运肽序列,含有一个典型的氨基氧化酶结构域和NAD(P)结合结构域,存在一个特征序列。系统发育分析表明,观赏向日葵Ha ZDS与万寿菊、菊花蛋白的同源性分别达96.4%、90.1%,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR技术分析结果显示,Ha ZDS基因在盛花期表达量最高,不同组织中的表达量舌状花瓣绿色管状花苞片叶片黑色管状花,随着花瓣黄色的加深,基因表达量逐渐增加。推测Ha ZDS基因在转录水平上参与观赏向日葵花色形成的调控。     

川芎咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及序列分析

克隆川芎(Ligusticum chuanxiong Hort)咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)基因并做序列分析。采用RT-PCR方法,以新鲜的川芎嫩叶c DNA为模板,克隆出川芎COMT基因的c DNA序列。此基因全长1328 bp,编码360个氨基酸。将得到的序列提交Gen Bank,序列号为KU942388。此川芎COMT具有植物O-甲基转移酶家族特征性的功能结构域,与中粒咖啡、牵牛花COMT的氨基酸序列同源性分别为70%、69%,推测其能够催化咖啡酸的氧甲基化反应。该川芎COMT基因的成功克隆为下一步活性验证及利用生物技术来生产阿魏酸奠定坚实基础。     

对胞必佳生产菌株的重新鉴定

主要是从形态学观察、菌株脂肪酸成分和16S rRNA基因全序列3个方面出发,重新对胞必佳生产菌株红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)进行鉴定。结果表明,该菌株并非诺卡氏菌属中的红色诺卡氏菌,而属于红球菌属。16S rRNA序列相似性比较和系统进化树进一步说明,该菌株与Rhodococcus ruber(AY114117.1)的同源性最高,是1株红色红球菌。     

基于核糖体基因序列快速鉴定产脂肪酶微生物

利用含罗丹明B的橄榄油检测平板从中国各省市油污土壤中分离、筛选产脂肪酶微生物菌株,扩增细菌的核糖体基因16S rDNA序列和真菌的ITS2序列,分析核糖体基因簇DNA,并结合形态学特征从而对产脂肪酶菌株进行分子生物学鉴定.核糖体基因16S rDNA序列分析及系统发育分析表明,分离得到的产脂肪酶细菌分别属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱伯克霍尔德氏(Burkholderia cepacia)、琼氏不动杆菌(Acinetobater jurii)、嗜麦芽窄食单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)和荧光假单胞菌(Pseudomonas sp.);真菌核糖体基因转录间隔区(ITS2)序列及同源性分析表明产脂肪酶真菌分别属于黑曲酶(Aspergillus niger)、白地酶(Galactomyces geotrichum)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、丝孢酵母(Trichosporon guehoae)和假丝酵母(Candida sp.).研究结果表明,核糖体基因簇的DNA分析技术为从自然界分离、鉴定产脂肪酶菌种提供了一种快速有效的手段,为产脂肪酶微生物资源开发利用奠定了技术基础.     

长梗木霉纤维素酶基因的克隆及序列分析

从富含纤维素环境筛选获得一株纤维素降解菌株FU05,通过形态学特征及ITS序列分析确定其为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)。PCR扩增获得该菌株的bgl2、cbh2和eg1。序列分析表明,这3种纤维素酶基因与GenBank上其他木霉同种纤维素酶基因具有较高同源性:bgl2基因与里氏木霉bgl2基因(AB003110)同源性达91%;cbh2基因与康宁木霉cbh2基因(DQ504304)同源性达99%;eg1基因与长梗木霉eg1基因(X60652)同源性达95%。3种纤维素酶基因编码的相应氨基酸序列与其他木霉纤维素酶的氨基酸序列相似性也非常高。对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白进行PROSITE motif search,对其N端糖基化位点、纤维素结合区、糖基水解酶家族特征结构区等进行了定位。     

北极狐GHR基因cDNA的克隆及序列分析

本文根据狗(AF133835)的GHR基因cDNA编码全序列设计了三对引物,利用RT-PCR方法克隆出北极狐GHR基因编码区全长cDNA序列(GenBank accession No.EU304325)。结果表明,北极狐GHR的ORF为1917bp,编码638个氨基酸的前体蛋白,由18个氨基酸的信号肽和620个氨基酸的成熟肽组成。通过同源性比较发现北极狐与狗的同源性最高,达到98%。另外,利用邻接法(NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,北极狐与狗先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。另外,通过氨基酸对位序列比较发现,北极狐GHR在氨基酸序列上存在明显的特异性,如45和451位分别为A和E,而其它物种均分别为T(大鼠为K)和A(牛羊为V,鼠为T)。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp～76bp之间,且其序列均符合5'-gt……ag-3'规则。     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析北大核心CSCD

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

两个与盐和赤霉病菌胁迫相关的小麦糖基转移酶基因的克隆与表达

摘要: 在植物体内, 糖基转移酶通过参与多种物质的糖基化而在植物抗逆境方面起着重要作用。为了解小麦糖基转移酶基因响应病原菌和盐胁迫的分子机制, 文章分离了两个小麦糖基转移酶基因(TaUGT1, TaUGT2)。这两个基因均编码496个氨基酸, cDNA序列相似性为90％。它们均含有一个内含子, 分别为335 bp(TaUGT1)和324 bp(TaUGT2)。序列比对分析表明, TaUGT1和TaUGT2与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸/尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(UDP-glucoronosyl and UDP-glucosyl transferase)基因同源性最高, 且都含有PSPG(Putative secondary plant gly-cosyltransferase)保守结构域。Real-time PCR表达分析显示, TaUGT1受赤霉病菌抑制表达, 而TaUGT2受赤霉病菌诱导表达; 在高浓度NaCl胁迫下, TaUGT1和TaUGT2的相对表达量分别为对照的2.87及4.56倍, 差异达到极显著水平。以上结果表明, TaUGT2可能与小麦赤霉病抗性有关, 而TaUGT1和TaUGT2可能共同参与了小麦对盐胁迫的响应。     

松材线虫伴生菌中产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及其相关基因的克隆

[目的]从松材线虫伴生菌中筛选出高效降解纤维素的细菌菌株,初步鉴定后,对其相应的纤维素酶基因尝试克隆.[方法]首先从河南南阳松材线虫病疫区采集到的木材样本中,分离获得松材线虫.采用刚果红平板初筛法,从松材线虫伴生菌中获得具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株.基于该菌株的形态学、生理学及16 s rDNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定.设计兼并引物,从高活性菌株中克隆该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析.[结果]获得7株具有分泌较高活性纤维素酶的细菌菌株,其中编号为C8的菌株酶活最高.经鉴定该菌株归为肠杆菌属,命名为Enterobacter sp.C8.进一步从C8菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1104 bp的纤维素酶基因(GenBank JQ845065),在NCBI比对后发现该基因分别与产气肠杆菌( Enterobacter aerogenes) KCTC 2190的纤维素合成酶亚单位BcsC的核苷酸序列有97％的同源性,氨基酸序列有92％的同源性 ;与克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)的endo-1,4-D-glucanase基因有82％的同源性,与不可培养的细菌内切纤维素酶基因有82％的同源性.[结论]本文首次从松材线虫伴生菌中筛选到了一株简单的产纤维素酶的细菌菌株并从中克隆出了一个新型纤维素酶基因,为下一步进行新能源的利用奠定了理论基础.     

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒 (BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段 ,经pGEM T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因 2 379bp长的核苷酸序列 ,推导出 793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示 ,BusuNPV与HzSNPV的同源性最高 ,达 57% ;与OpMNPV的同源性最低 ,为 39.6 %。     

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒(BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段,经pGEM-T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因2379bp长的核苷酸序列,推导出793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示,BusuNPV与HzSNPV的同源性最高,达57%;与OpMNPV的同源性最低,为39.6%。     

箭叶淫羊藿EsUF3GT基因的克隆及表达分析

类黄酮3-O-糖基转移酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase,UF3GT)可以把不稳定的花色素催化成花色素苷。本研究采用同源基因克隆技术获得箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.and Zucc.)Maxim.UF3GT基因c DNA开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列,命名为Es UF3GT(Gen Bank注册号为KJ648620)。序列分析表明,该基因ORF全长为1356 bp,编码451个氨基酸,与其它植物中UF3GT蛋白序列的相似性为40%~50%。进化树分析发现,Es UF3GT同催化类黄酮3-O糖基化的糖基转移酶聚为一枝。qRTPCR分析结果显示,Es UF3GT在花中的表达量最高,约为叶片、花蕾中表达水平的2.3倍,果实及根中表达水平的19倍。花青素含量检测表明,花蕾中的含量最高(130.4 mg/100 g),分别是叶片、花、果实及根中含量的3.5、5.2、72、87倍。我们推测Es UF3GT参与了箭叶淫羊藿花色素苷的生物合成,此结果为深入开展EsUF3GT的生化功能研究奠定了基础。     

禾谷镰刀菌降解毒素基因Tri101的克隆和序列分析

禾谷镰刀菌Tri101基因编码的单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶可通过加乙酰基的形式使禾谷镰刀菌产生的单族毒素(如DON)转变为较低的毒性。本研究利用RT-PCR技术从禾谷镰刀菌0623中扩增并克隆了Tri101基因的cDNA片段,测序结果表明,Tri101基因核苷酸序列阅读框架全长1356bp(GenBank序列号:GQ907236),编码451个氨基酸的多肽,推测分子量为49.45kD,等电点为5.14。氨基酸序列同源性比对结果表明,它与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101氨基酸序列同源性最高,为99.56%,与其它13种镰刀菌的Tri101氨基酸序列的同源性分别为97.91%-75.68%。系统进化树分析结果表明,Fusarium graminearium0623与Fusarium sporotrichioides属于同一进化枝且与Fusarium asiaticum有较近的亲缘关系,而与F.oxysporum、F.moniliforme、F.nygamai、F.nisikadoi和F.decemcellulare的亲缘关系较远。     

马蔺IlVP基因片段的克隆及序列分析

根据已报道的其他植物H+-PPase基因的保守序列设计一对简并性引物,以马蔺幼根总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出马蔺H+-PPase基因片段并克隆到p UCm-T载体,命名为Il VP。阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,序列分析结果表明:该基因片段长度为893 bp,编码297个氨基酸,所得到的序列与Gen Bank中注册的高等植物液泡膜H+转运无机焦磷酸酶(H+-PPase)核苷酸碱基排列顺序的同源性均在70%以上、氨基酸序列的同源性达79%以上。这为马蔺Il VP全长基因的克隆及其耐盐分子机理的研究奠定基础。