一株小麦内生真菌的鉴定及其发酵产物对兔软骨细胞的影响

本研究对分离自青海大骨节病区小麦籽粒中优势内生真菌6-5-1菌株进行菌种鉴定并探讨其发酵产物对兔膝软骨细胞的影响。通过形态学观察及ITS序列分析进行菌种鉴定;其发酵产物经75%乙醇提取,并将乙醇总提物用3种不同有机溶剂(石油醚,乙酸乙酯和乙醚)进行萃取,分别作用于兔软骨细胞;四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)显色法检测细胞存活率,甲苯胺蓝(toluidine blue,TB)染色法和免疫组化法分别检测蛋白聚糖和胶原蛋白的表达;RT-PCR检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原m RNA的表达。经鉴定6-5-1菌株为三线镰孢霉(Fusarium tricinctum)。其发酵产物乙醇总提物对细胞存活率有较强的抑制作用,对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成与m RNA的表达均有抑制作用;其他萃取分部对软骨细胞损伤程度各不相同,石油醚分部作用最强,且各分部的影响作用均弱于乙醇总提物。可见6-5-1菌株代谢产物中应该有多种对软骨细胞产生损伤的物质,且这些物质可能存在协同作用。石油醚分部中可能存在已知损伤软骨细胞毒素以外的其他物质。     

一株镰孢霉发酵产物不同极性提取物对兔膝软骨细胞的影响

通过研究一株内生梨孢镰孢霉(Fusarium poae)发酵产物中不同极性提取物对兔膝软骨细胞的影响,初步了解其中毒性物质的基本性质,为进一步探讨真菌毒素在大骨节病发病中的可能作用以及分离新的潜在致病物质打下良好基础。本研究以预实验中筛选出的对软骨细胞有较强毒损作用的F.poae菌株进行摇瓶培养;发酵产物先用75%乙醇进行提取,再将乙醇总提取物用不同极性的溶剂进行萃取;将所得各种次级提取物分别作用于体外培养的兔膝软骨细胞,检测与软骨细胞损伤相关的指标,其中细胞存活率采用噻唑蓝(MTT)显色法,Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖的含量分别采用免疫组化法和甲苯胺蓝染色法,二者相应的mRNA表达量用半定量RT-PCR进行检测。结果发现,不同极性溶剂提取所得的石油醚、乙醚、乙酸乙酯和水提取物,都能在不同程度上造成培养兔软骨细胞的存活率、Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的含量以及相应mRNA的表达量降低;毒性强弱有随溶剂极性增强而减弱的趋势,以石油醚分部的综合毒损作用最强,其后依次为乙醚、乙酸乙酯和水提取物。镰孢霉发酵产物的各种不同极性提取物中,都存在对软骨细胞相关指标造成程度不等毒损作用的物质。这些结果支持我们关于大骨节病的发病可能和多种真菌毒素的综合作用相关的观点。     

不同硒浓度培养的一株链格孢霉产物对兔软骨细胞的影响

本实验研究了加硒培养的一株链格孢霉(Alternaria alternate)菌株的产物对兔软骨细胞毒损作用的影响。采用合成培养液,添加不同浓度硒元素后进行摇瓶培养链格孢霉菌株;发酵产物用75%乙醇提取后减压浓缩;将不同硒处理的发酵产物提取物加入兔软骨细胞培养体系,采用四氮唑蓝(MTT)法测定软骨细胞的生长速率,甲苯胺蓝染色法检测其蛋白聚糖的表达,免疫组化法检测Ⅱ型胶原表达量,半定量RT-PCR法检测细胞蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达。结果显示,在实验所设浓度范围内,加硒对该链格孢霉菌株的生长有一定影响,但不显著。加不同浓度硒培养所得发酵产物提取物对兔软骨细胞生长速率的影响各异,多表现为抑制作用。菌株发酵产物的提取物对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达量有些微促进作用,尤其是加一定浓度硒的处理;但对这两种蛋白的表达都有抑制作用,不过和未加硒的处理相比,加一定浓度硒培养所得提取物的抑制效果有所减轻。本研究结果表明,硒对该链格孢霉菌株的生长有一定影响;加不同浓度硒培养的菌株提取物对兔软骨细胞损伤有关的指标影响不同;说明环境硒水平—真菌产物毒性—软骨细胞损伤之间可能存在一定关系,值得进一步研究。     

青海大骨节病区小麦内生镰刀菌和硒对兔膝软骨细胞的影响

小麦内生镰刀菌5-5-1菌株是从青海大骨节病区穗期小麦籽粒中分离的一株优势内生镰刀菌,本试验通过采用干重法测定菌丝体生长量;MTT(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide)法检测软骨细胞存活率;甲苯胺蓝染色法和免疫组化染色法分别检测兔膝软骨细胞内蛋白聚糖(aggrecan)和Ⅱ型胶原蛋白(collagenⅡ)的表达;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测软骨细胞内蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白m RNA的表达水平,探讨了硒对5-5-1菌株生长的影响及不同硒水平下培养该菌株获得的发酵产物对兔膝软骨细胞有关指标的影响。结果表明,硒浓度在0.05~0.5 mg/L的范围内,对5-5-1菌株生长有促进作用,且呈浓度效应;低浓度硒条件下培养的该菌株发酵产物对软骨细胞蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成及其m RNA表达的抑制作用相对较小。由此推断适宜浓度硒具有促进镰刀菌生长的作用,但同时能够减轻其发酵产物对软骨细胞的损伤。     

1α,25(OH)_2D_3对大鼠关节软骨细胞蛋白聚糖和蛋白聚糖酶代谢的调节作用

目的在细胞水平,探讨1α,25(OH)_2D_3对受到多种促炎症因子干预的大鼠关节软骨细胞蛋白聚糖合成和分解的调节作用。方法分别使用促炎症因子IL-1α、IL-1β及TNF-α对大鼠关节软骨细胞进行炎症诱导,使用不同剂量的1α,25(OH)_2D_3对正常及炎症状态下的软骨细胞进行干预,使用CCK8、流式细胞术分析、real time-PCR及western blot等方法分别检测软骨细胞的增殖活性和凋亡水平,以及软骨细胞中蛋白聚糖和蛋白聚糖酶-1/2即ADAMTS-4及ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平变化,从而评估1α,25(OH)_2D_3对大鼠关节软骨细胞蛋白聚糖和蛋白聚糖酶代谢的调节作用。结果 IL-1α、IL-1β及TNF-α显著降低了软骨细胞的增殖活性并增加了软骨细胞的凋亡水平,以及降低细胞中蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达水平,增加ADAMTS-4及ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平。1α,25(OH)_2D_3的干预可以增加炎症状态下软骨细胞的增殖活性、降低软骨细胞的凋亡水平,以及增加炎症状态下软骨细胞内蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达水平,降低ADAMTS-4及ADAMTS-5的mRNA和蛋白表达水平,并呈一定剂量依赖性。但是,1α,25(OH)_2D_3的干预并不影响正常软骨细胞的增殖、凋亡。结论维生素D能促进炎症状态下的软骨细胞蛋白聚糖的合成代谢并抑制蛋白聚糖酶活性,从而为关节软骨提供更全面的保护。     

GGCX基因在兔骨关节炎软骨退变中的作用机制

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13 (MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。     

γ-谷氨酰羧化酶基因过表达对兔骨关节炎软骨细胞分化的影响

通过将GGCX慢病毒转染软骨细胞,探讨骨关节炎患者软骨组织中γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因过度表达对兔骨关节炎(OA)软骨细胞分化的影响及其机制。本研究首先从OA兔体内分离软骨细胞,用茜素红染色标记软骨细胞。然后将分离的软骨细胞分为正常对照组、GGCX过表达组和载体组3组。编码GGCX的慢病毒用于过表达GGCX,流式细胞分析检测出病毒转染后细胞凋亡。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法用于检测GGCX、基质金属蛋白酶13 (MMP13)、Ⅹ型胶原、Ⅱ型胶原、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1β。慢病毒编码GGCX提高了OA软骨细胞中中GGCS的表达水平,mRNA和蛋白水平都显著升高(p0.05)。正常对照组的凋亡率为26.12%,载体组的凋亡率为26.12%左右,GGCX过表达组的凋亡率为18.17%,GGCX过表达可明显减少软骨细胞细胞凋亡(p0.05)。GGCX过表达显著增加Ⅱ型胶原,而mRNA和蛋白水平均降低MMP13、Ⅹ型胶原、TNF和IL-1β表达(p0.05)。相对于载体,GGCX过表达抑制了OA软骨细胞的细胞凋亡。GGCX过表达可调节细胞外基质的平衡,促进软骨细胞蛋白多糖合成,这与细胞凋亡减少有关。     

回转模拟失重对心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原代谢的影响

为探讨模拟失重对心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原代谢的影响 ,本研究采用回转器模拟失重效应 ,通过免疫细胞化学和反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)研究了回转模拟失重对原代培养的新生大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白及mRNA表达 ,以及胶原降解抑制物———金属蛋白酶组织抑制因子 (Tissueinhibitorofmetallopro teinase ,TIMP)mRNA表达的影响。免疫细胞化学染色显示回转组Ⅰ型胶原蛋白沉积增加 ;RT PCR分析显示Ⅰ型胶原α1链 (TypeⅠcollagenα1chain ,ColⅠA1)mRNA表达没有明显变化 ,TIMP 1、TIMP 2及TIMP 3的mRNA表达均增强。提示在回转模拟失重条件下 ,心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白沉积增加 ,作为胶原降解抑制物的TIMP可能是造成胶原沉积的原因     

羌活地黄汤含药血清对兔关节软骨细胞增值及RANKL mRNA的影响

目的:观察羌活地黄汤含药血清对软骨细胞增值及RANKL mRNA(receptor activator nuclear factor kappa B ligand)表达的影响.方法:采用血清药理学和体外培养兔关节软骨细胞的方法,通过MTS/PMS系统检测羌活地黄汤含药血清对软骨细胞增殖的影响以及采用实时荧光定量PCR检测软骨细胞RANKL mRNA表达变化.结果:羌活地黄汤含药血清对体外培养的兔关节软骨细胞有促进增殖的作用,与实验对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),羌活地黄汤含药血清组RANKL mRNA表达量低于同一时间节点的实验时照组.结论:羌活地黄汤含药血清能促进体外培养的软骨细胞增殖,同时能抑制软骨细胞RANKLmRNA的表达.     

莱芜猪和杜洛克猪肌肉肌球蛋白重链组成对肉质性状的影响

为探讨莱芜猪肌肉肌球蛋白重链(MyHC)慢速氧化型(Ⅰ)、快速氧化型(Ⅱa)、中间型(Ⅱx)、快速酵解型(Ⅱb)组成与肉质性状间的关系, 阐释莱芜猪肉质优良的机理. 本实验在评价肉质性状的基础上, 用荧光定量RT-PCR方法检测莱芜猪和杜洛克猪背最长肌和半膜肌MyHC 4种亚型mRNA的表达量, 并进行相关分析. 结果表明, 莱芜猪背最长肌和半膜肌MyHCⅡa, Ⅱx mRNA表达量显著高于杜洛克猪, MyHC Ⅱb mRNA表达量则显著低于杜洛克猪, 而MyHCⅠmRNA表达量无明显变化. MyHCⅠ, Ⅱa, Ⅱx mRNA表达量与肉色、pH、大理石纹、肌内脂肪含量正相关, 与嫩度剪切值和肌纤维直径负相关; MyHC Ⅱb mRNA的表达量与大理石纹和肌内脂肪含量显著负相关(P<0.05), 与嫩度剪切值极显著正相关(P<0.01), 与肌纤维直径正相关(P>0.05). 由此可见, MyHCⅠ, Ⅱa, Ⅱx, Ⅱb的组成影响肉质性状, 而且其mRNA的表达量与肉质性状, 尤其是与肌肉食用品质显著相关, 也就是说MyHC 4种亚型的mRNA表达量可准确、客观评价肉质.     

抑制谷氨酰胺代谢减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌纤维化

本文旨在探讨心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)谷氨酰胺(glutamine, Gln)代谢在高血压所致心肌纤维化中的作用及机制。用微渗透泵给予C57BL/6J小鼠血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ, 1.6 mg/kg per d)诱导心肌纤维化,用免疫组织化学法和Western blot检测心肌组织谷氨酰胺酶1 (glutaminase 1, GLS1)的表达。小鼠腹腔注射GLS1抑制剂BPTES (12.5 mg/kg)以抑制Gln代谢,用Masson染色法观察心肌纤维化程度,用RT-qPCR和Western blot检测心肌组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达变化。Sprague-Dawley (SD)大鼠乳鼠CFs在有/无Ang Ⅱ (0.4μmol/L)刺激下接受Gln 4 mmol/L或BPTES (5μmol/L)处理。用划痕实验和CCK-8法分别检测CFs迁移和增殖,用RT-q PCR和Western blot检测CFs中GLS1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达变化。在Ang Ⅱ和BPTES处理的条件下,给予CFs 2 mmol/L ...     

三隔镰刀菌大米培养物产生二苯甲醇的研究

<正> T-2毒素是镰刀菌属三隔镰刀菌Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.的一种次生代谢产物,隶属单端孢霉烯簇毒素。发霉大米中毒症及豆荚中毒症等均与单端孢霉烯簇毒素有关。张树荣等从真菌培养物M-20中提取T-2毒素成功,我们对其     

不同程度骨关节炎中Wnt/β-catenin信号通路、OPN和MMP-13的相关性的研究

目的:研究不同严重程度骨关节炎模型兔的软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)和基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinase 13,MMP-13)的相关性。方法:将40只新西兰大耳白兔随机分成4组,通过注射不同浓度木瓜蛋白酶处理,而构建患有不同程度骨关节炎的兔模型。利用Real-Time PCR法和ELISA法分别检测β-catenin、OPN、MMP-13以及Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的m RNA和蛋白的水平。结果:利用不同浓度的木瓜蛋白酶成功建立OA兔模型,通过Mankin评分可分成轻度、中度和重度三级。在不同分级的OA模型兔中,β-catenin、OPN、MMP-13的浓度均高于正常对照组,而Ⅱ型胶原和蛋白聚糖较正常对照组均下降(P0.05);且随着OA严重程度增加,结果具有一致性(P0.05)。结论:Wnt/β-catenin信号通路可调节OPN的表达,进而影响到MMP-13的表达,最终对骨关节炎的发生产生影响。     

棘孢木霉挥发性次级代谢产物检测及抑菌活性分析

木霉是一类具有重要生防价值的丝状真菌。文中首先对分离自浙江省绍兴市和广东省佛山市共12株棘孢木霉Trichoderma asperellum进行平板拮抗评价,然后采用顶空固相微萃取气质联用法(HS-SPME-GC-MS)检测拮抗性较好的两株菌的挥发性次级代谢产物。结果表明,棘孢木霉ZJSX5003和GDFS1009菌丝生长迅速,对尖孢镰孢菌Fusariumoxysporum抑制率分别达73%和74%。挥发性次级代谢产物主要是醇类和酮类,其中包含异丁醇、异戊醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇和6-正戊基-2H-吡喃-2-酮(6-PAP)。进一步通过体外抑菌试验,证实6-PAP具有较好的抑制尖孢镰孢菌的效果,为开发以木霉菌代谢产物如6-PAP为主要成分的生防制剂提供指导。     

低强度周期性静水压力对人膝关节软骨细胞的影响

目的:探讨低强度周期性静水压力对体外培养的人膝关节软骨细胞增殖、凋亡,以及细胞Ⅱ型胶原分泌表达的影响。方法:体外酶消化法分离培养成人膝关节正常软骨细胞,将培养的第3代软骨细胞分为两组:正常对照组、3.0MPa组压力实验组,应用多功能恒温体外细胞培养中高压静水压力加载装置加载低强度周期性压力,共5d,每天2h。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色法和甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线,qRT-PCR、Western-Blot检测Ⅱ型胶原的分泌和表达。结果:软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色均显示为阳性。与正常对照组相比,3.0MPa组表现出促进软骨细胞增殖,抑制细胞凋亡,且Ⅱ型胶原的合成分泌明显升高(P0.05)。结论:通过体外模拟人生理情况下较低强度(3.0MPa)的周期性静水压力对人软骨细胞增殖、凋亡水平及周围基质分泌合成功能的影响,初步证实了较低强度压力有助于软骨自我修复和自身保护作用的发挥。     

周期性张应力对大鼠髁突软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的:在成功构建髁突软骨细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,探讨周期性张应力对髁突软骨细胞主要细胞外基质(Ⅱ型胶原)合成的影响.方法:本研究采用FX-5000T应力加载系统对体外培养的第3代大鼠髁突软骨细胞分别施加1h、6h、12h和24 h的周期性张应力,应力刺激强度为10％1 HZ.加力完成后即刻收集加力细胞,提取细胞总RNA反转录成cDNA,应用RT-PCR技术检测髁突软骨细胞主要细胞外基质Ⅱ型胶原(type-Ⅱ collagen,Col-Ⅱ)mRNA的表达变化情况.结果:与对照组(0h组)相比,加力1 h时Col-Ⅱ的表达增加,但无统计学意义;加力6h时Col-Ⅱ表达显著增加(P＜0.05);加力12h时Col-Ⅱ表达开始下降;当加力至24h时表达量显著降低(P＜0.05).结论:周期性张应力可以影响髁突软骨细胞主要细胞外基质的合成,在一定范围内随加力时间的延长基质合成逐渐增强;进一步延长加力时间,基质的合成受到明显抑制.     

红色链孢霉Rnase N1高产菌株的选育

本文介绍了红色链孢霉(Ncurospora crassa) Rnase N₁．高产菌株的选育和Rnase N₁．的鉴定。 1. 以红色链孢霉3.1602(鸟氨酸缺陷型)为原始菌株,经1／5000三乙撑四胺30℃振荡处理2小时,继以柏钻照射4分钟(13．2千伦琴／分钟),照射剂量为52．8千伦琴。分离得到红色链孢霉OA047菌株(鸟氨酸一腺嘌呤双重营养缺陷型)。以红色链孢霉3．1604(野生型)为原始菌株,经100微克分子MNNG 28℃振荡处理2小时,分离得到红色链孢霉WA011(腺嘌呤营养缺陷型)。这两个菌株在改良的File’s培养基上,比原始菌株产酶能力分别提高约20倍。     

27nt-miRNA对间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化的影响

为探讨27nt-miRNA对间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化影响,构建27nt-miRNA过表达、反义序列Anti-27nt-miRNA以及阴性对照的表达质粒,慢病毒包装后分别转染人脐带间充质干细胞(hUCMSC),加入Ⅳ型胶原诱导hUCMSC定向分化为血管平滑肌细胞。四唑盐(MTT)比色法检测分化后细胞活力,免疫细胞化学染色法检测分化后细胞SM22α(兔抗平滑肌22α,smooth muscle 22α)的表达,Western印迹法和RT-PCR检测分化后细胞内的SMA (兔抗平滑肌肌动蛋白,smooth muscle actin) mRNA、SM 22α mRNA及其蛋白质表达情况。经检测,27nt-miRNA过表达分化组与阴性对照组相比,细胞活力下降20.48%(P0.05),SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白质表达量明显升高(P0.05);而Anti-27nt-miRNA分化组细胞活力上升了18.07%(P0.05),SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白质表达量下降(P0.05)。综上所述,27nt-miRNA能够促进间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化,并且抑制分化后的细胞活力。     

蒜头果内生真菌次生代谢产物抑制人类致病菌活性的研究

蒜头果是我国特有的单种属稀有树种,为了进一步开发利用蒜头果树皮内生真菌的抗菌活性化合物,该研究对来自蒜头果的植物内生真菌(白黄笋顶孢霉、哈茨木霉、大棘黑团孢、枝状枝孢菌、斑污拟盘多毛孢、赭绿青霉、淡紫紫孢菌、朱黄青霉、Xenoacremonium recifei、Xylaria feejeensis)进行液体培养,10 d后回收培养液并用乙酸乙酯萃取获得初提物,采用抑菌圈法检测蒜头果内生真菌初提物抑菌活性,同时测定了最低抑菌浓度(MIC)。结果表明:白黄笋顶孢霉、大棘黑团孢、枝状枝孢菌、斑污拟盘多毛孢、赭绿青霉、淡紫紫孢菌均有抑菌活性,大棘黑团孢、斑污拟盘多毛孢、淡紫紫孢菌的初提物均对缓慢芽孢杆菌、无乳链球菌和藤黄微球菌有明显抗菌活性,最低抑菌浓度在1.562 5~6.25 mg·m L~(-1)之间。这说明蒜头果树皮内生真菌的次生代谢产物具有抗菌活性,各内生真菌次生代谢产物的抗菌效果不同。     

使用透明质酸钠复合海藻酸钠水凝胶球3D培养软骨细胞抑制细胞去分化的研究

目的:验证海藻酸钠(Alginate,Alg)水凝胶球添加透明质酸钠(Sodium hyaluronate,HA)后,对大鼠膝软骨细胞体外3D培养时软骨细胞去分化的抑制情况。方法:用Ⅱ型胶原酶消化法获取2周龄SD大鼠膝关节原代软骨细胞,体外培养传代至P2。细胞分为2组,1组用2%海藻酸钠水凝胶球3D培养(Alg组),另一组用2%海藻酸钠+1%透明质酸钠的水凝胶球3D培养(Alg/HA组),采用正交法制作海藻酸钠水凝胶球。培养14天后,两组各取水凝胶球进行死活细胞染色观察细胞状态。其他水凝胶球收集后用4%多聚甲醛固定,30%蔗糖溶液脱水,OCT(Optimal cutting temperature compound)包埋剂包埋切片,采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、甲苯胺蓝染色观察软骨细胞形态;采用阿利新蓝染色观察对比糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量;采用免疫荧光染色对比Ⅱ型胶原(Collagen typeⅡ,ColⅡ)含量;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测软骨细胞ColⅡ和聚蛋白多糖(Aggrecan,ACAN)的表达情况。结果:死活细胞染色显示两组水凝球内软骨细胞状态良好,几乎无死细胞;阿利新蓝染色显示Alg/HA组与Alg组相比软骨细胞分泌更多的GAG;免疫荧光染色显示Alg/HA组比Alg组软骨细胞内含更多的Ⅱ型胶原;Western blot显示Alg/HA组软骨细胞比Alg组ColⅡ的蛋白表达更多。结论:含透明质酸钠的海藻酸钠水凝胶可以更好地维持软骨细胞的表型,抑制软骨细胞去分化。