茯砖茶中冠突散囊菌的研究进展

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶微生物发酵过程中的优势菌,在特定的条件下冠突散囊菌可在茯砖茶中形成黄色闭囊壳,俗称"金花"。本文从茯砖茶的产地、冠突散囊菌的鉴定历史以及对茯砖茶品质的影响与应用方面进行了综述,并对目前存在的问题及未来的发展方向进行了讨论与展望。     

泾阳茯砖茶中“金花菌”的分离、鉴定及抗氧化酶活性

目的分离鉴定泾阳茯砖茶中的金花菌,探讨其发酵产物的抗氧化酶活性。方法采用涂布平板法分离纯化泾阳茯砖茶中的"金花菌",通过其ITS序列分析进行分子鉴定。利用抗氧化酶试剂盒测定不同时期"金花菌"发酵液的抗氧化酶活性。结果从茶叶中分离出1株"金花菌"J17,通过ITS序列分析初步确定其为赤散囊菌(Eurotium rubrum)。在J17菌株发酵后第1、7、10、14和21天,其发酵液中过氧化物酶(POD)活性(U/mL)分别为0.22±0.11、1.22±0.13、2.46±1.64、7.35±2.77和45.19±1.54;过氧化氢酶(CAT)活性(U/mL)分别为0.06±0.00、0.45±0.00、1.52±0.20、2.35±0.20和2.75±0.37;总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性(U/mL)分别为25.55±10.12、50.90±3.72、76.77±6.75、89.07±3.33和36.34±12.32。发酵14d左右,3种抗氧化酶活性均较高,与茶砖在发花车间的发花时间一致。茯砖茶沸水冲泡液和沸水冲洗液中POD和CAT活性差异无统计学意义,而沸水冲泡液的T-SOD活性显著高于沸水冲洗液。结论泾阳茯砖茶的抗氧化酶活性与茶砖发花期产生的赤散囊菌有关,泾阳茯砖茶适用于热水冲泡或煮沸后饮用。     

冠突散囊菌对贵州夏秋茶发花中真菌多样性及品质的影响

冠突散囊菌俗称"金花",是黑茶发花过程中的优势菌种,形成了茯砖茶特有的色、香、味品质,是评价茯砖茶品质的重要指标.本研究对贵州九安夏秋黑毛茶接种冠突散囊菌,以未接种的黑毛茶为对照,对茶中的真菌进行分离培养和分子生物学鉴定.同时,对接种和不接种不同时期的黑毛茶中的品质成分茶多酚、氨基酸、黄酮和可溶性糖的含量进行了测定.从...     

贵州地区茯砖茶“金花菌”的分离和分子鉴定

本研究对贵州地区茯砖茶中的"金花菌"进行了分离鉴定。通过PCR扩增及测序技术获得转录间隔区序列及部分核糖体大亚基(ITS+LSU)、β-微管蛋白(β-tubulin)、钙调蛋白(Ca M)和RNA聚合酶Ⅱ(RPB2)4个基因的序列,然后构建多基因系统树,并对其形态特征进行观察,将其鉴定为冠突曲霉Aspergillus cristatus。     

黑茶砖茶中两种产生“金花”的曲霉菌

"金花"是曲霉属Aspergillus真菌在黑茶后发酵过程中,在砖茶内部形成的黄色闭囊壳。从广西和湖南产的黑茶砖茶中分离获得2株"金花菌",均能在培养基上形成闭囊壳。根据分离菌株的培养特征和微观形态特征及β-微管蛋白基因(Ben A)、钙调蛋白基因(Ca M)及RNA聚合酶Ⅱ基因(RPB2)的系统发育分析,参照Hubka最新的曲霉属曲霉组Aspergillus section Aspergillus分类系统,将分离菌株分别鉴定为假灰绿曲霉A.pseudoglaucus及冠突曲霉A.cristatus。另外,通过扫描电镜对这2株"金花菌"进行了形态观察,并记录了菌株A672闭囊壳的发育过程。在广西产砖茶中分离鉴定出的"金花菌"假灰绿曲霉为国内首次报道。通过比较,将过去湖南产砖茶中广泛报道的"金花菌"冠突散囊菌修订为冠突曲霉A.cristatus。黑茶茶砖中"金花菌"的分离与鉴定对于黑茶品种的鉴别和质量评价具有重要指导意义。     

湖南地区茯砖茶中金花菌的分离鉴定

对湖南地区茯砖茶上＂金花菌＂的菌落特征、形态特征进行了研究,并运用扫描电镜观察了其子囊孢子和分生孢子的发育过程,鉴定其为冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。     

茯砖茶“金花菌”vcx基因克隆及表达分析

茯砖茶是一种紧压黑茶,冠突曲霉是茯砖茶发花阶段的主要微生物,其有性发育产生闭囊壳又名"金花菌",其数量和质量常用来判断茯砖茶的品质好坏。冠突曲霉可以用Na Cl来控制其产有性孢子及无性孢子,为了研究这一特殊产孢机理,及钙信号和液泡在这产孢过程中的作用。通过克隆冠突曲霉钙信号途径中的液泡上钙氢交换子vcx基因,并对这一基因进行结构和表达分析。结果表示:冠突曲霉中的vcx基因编码区1 326 bp,不含内含子,预测编码441个氨基酸,不含信号肽,是一个疏水蛋白,含有11个跨膜结构,符合钙氢交换蛋白的基本结构。通过对其在冠突曲霉的有性、无性、菌丝各生长阶段的表达量进行测定,结果显示:vcx基因对其发育产生正调控,可能参与了冠突曲霉的无性产孢及盐压力响应过程。实验结果不仅为该蛋白的后续研究提供了条件,而且为钙信号调控丝状真菌在盐压力应答下的产孢机制奠定基础。     

分离自黑茶的散囊菌属真菌中的NRPS基因的检测和分布

【目的】检测源自黑茶的散囊菌属分离菌株中的NRPS基因,推测它们相应的次级代谢产物合成能力,并考察了基于NRPS基因分布特征进行散囊菌属真菌遗传多样性分析的可能性。【方法】运用IQS法提取来自湖南、四川和湖北等地黑茶样品的14株散囊菌(Eurotium spp.)菌株的总DNA,利用特异性引物对菌株中11种NRPS基因片段进行PCR检测和序列分析,并结合UPGMA法分析了NRPS基因的分布。【结果】各菌株分别含有4 10个NRPS基因片段。NRPS7、CPS1基因在所有菌株中都可以检测到,而NRPS2、NRPS6基因则仅在个别菌株中检测到;其它NRPS基因的分布则呈现出多样性。来自同一块砖茶的菌株Fw-30813-7、Fw-30813-4、Fw-30813-1和Fw-30925-5之间,NRPS1、NRPS2、NRPS3、NRPS4和NRPS8五个基因的分布存在差异,显示出黑茶内散囊菌的遗传多样性。来自湖南白沙溪茶厂的茯砖样品的菌株Fa-20719-3不含有NRPS5和NRPS8基因;而从湖南益阳茶厂茯砖茶7个分离菌株中均含有这两种基因。不同地点加工出来的黑茶样品中的散囊菌菌株之间存在一些明显的遗传差异。【结论】首次从我国黑茶中的散囊菌属分离菌株中检测到NRPS基因,并推测了NRPS产物的多样性,展示了其多样化分布特征,提示NRPS基因的分析有可能成为衡量散囊菌遗传多样性的另一个尺度。     

利用抑制性差减杂交技术鉴定谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因

谢瓦氏曲霉间型变种Aspergillus chevalieri var.intermedius俗称"金花菌",是茯砖茶发酵中的优势菌种,该菌在不同的渗透压胁迫下产生不同类型的孢子。采用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),以低渗条件下产生的子囊孢子和高渗条件下产生的分生孢子为材料分别与营养菌丝体构建两个正反向文库。每个库随机挑选400个阳性克隆进行测序。然后将所得到的基因片段在GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,筛选出的差异表达的基因涉及蛋白质代谢、细胞代谢、转录调控等多个方面,其中可能参与有性产孢调控的基因有13条,可能参与无性产孢调控的基因有10条。     

冠突散囊菌的研究与应用进展

冠突散囊菌是茯砖茶发酵中的优势菌,其数量和质量直接关系到茯砖茶的品质,国内外学者对其进行了比较全面的研究。本文中,笔者综述了冠突散囊菌的分离鉴定、分子生物学、培养、发花过程、保健功能及其应用等几个方面,并对其研究与应用前景进行了展望。     

冠突散囊菌对茶叶品质成分及其抗氧化活性影响

从茯砖茶样中分离纯化制得冠突散囊菌Eurotium cristatum菌株,选用普通炒青绿毛茶做茶坯,应用人工接种发酵技术进行固体发酵制成发酵散茶。结果表明：冠突散囊菌发酵一个月后的炒青绿茶不仅品质成分明显改善,茶黄素和茶红素高于其他样品,而且苦涩味减轻;采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）法测定发酵散茶的抗氧化活性,结果显示,对两种自由基的清除能力分别达到75%和56%以上,与湖南茯砖茶相近。发酵散茶的ABTS自由基清除能力分别高于对照和浙江茯砖茶64.7%和80.6%,而对DPPH的清除能力略低于对照,但是高于浙江茯砖茶。     

DGGE法初步解析茯砖茶发花过程中真菌群落结构

为研究茯砖茶发花过程中真菌群落结构和种类,对发花过程中不同时段真菌落18S rDNA高变区进行扩增,并对真菌变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱中条带进行克隆、测序和序列比对分析。结果表明:茯砖茶发花前后时段其优势菌不同,以发花过程的第10天为临界点,0~8 d和10~14 d,前后存在2个差异较大的真菌优势种群结构的演变,10天前以好干性酵母菌、毕赤酵母、假丝酵母为优势菌,10 d后以阿姆斯特丹散囊菌、好干性酵母菌为优势菌;18S rDNA高变区比对结果表明,茯砖茶发花过程中有好干性酵母、汉逊德巴利酵母、酿酒酵母、假丝酵母菌、热带假丝酵母、路德酵母、毕赤酵母、牧草红酵母、隐球酵母、阿姆斯特丹散囊菌、曲霉、毛霉、安大略假单胞菌、真皮毛孢子菌、青霉、白地霉、灰绿曲霉、蜡叶散囊菌等;比对结果表明存在3株好干性酵母菌和5株阿姆斯特丹散囊菌,说明优势菌存在多种生态类型。采用DGGE指纹图谱能更系统、更真实地反映茯砖茶发花发酵过程中真菌群落结构和多样性动态变化。     

基于Illumina MiSeq技术分析不同地域加工的茯砖茶中微生物群落多样性

为研究不同地域加工的茯砖茶中发花微生物群落结构及多样性,本文采用Illumina Miseq技术对其微生物群落结构进行了解析。结果表明:不同地域加工的茯砖茶中细菌种类丰富,分为9个门、16个纲、29个目、50个科、66个属,其中厚壁菌门中的乳球菌属(Lactococcus)占绝对优势;湖南产区的茯砖茶中细菌丰度和多样性最高。真菌分为2个门、6个纲、6个目、7个科、7个属,其中曲霉属(Aspergillus)是绝对优势菌种,在每个样品中的丰度均在92%以上;此外,还检测到了丰度低于1%的酵母属,分别是假丝酵母属、耐碱酵母属和毕赤酵母属,且在不同茶样中的丰度存在差异;陕西产区的茯砖茶中真核微生物菌群丰度最高。聚类分析发现,同一产区的茯砖茶样品距离较近,表明地域环境及加工工艺是影响茯砖茶发花中微生物群落结构的主要因素。     

冠突散囊菌黑茶发酵液对消化酶活性影响的研究

在模拟人体胃肠环境中研究不同发酵时期的冠突散囊菌黑茶发酵液对淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响。结果表明冠突散囊菌黑茶发酵液能显著提高α-淀粉酶、蛋白酶活力,并有效抑制脂肪酶活力。冠突散囊菌发酵液利于淀粉、蛋白质消化吸收,抑制脂肪分解吸收,为解释茯砖茶的保健功能提供了理论依据。     

基于DGGE技术的茯砖茶发花过程细菌群变化分析

变性梯度胶电泳是当前微生物生态学研究重要技术之一。为研究茯砖茶发花过程中细菌群落结构和种类,对发花过程中不同时段细菌16S rDNA的V3可变区扩增,经变性梯度胶电泳(DGGE)后、对细菌DGGE条带进行克隆、测序和比对。结果表明,在发花过程的第0—4天、6—8天、10—14天茯砖茶发花存在3个差异较大的细菌优势种群结构的演变;从16SrDNA的V3可变区比对结果证明黑毛茶发花过程中有短波单胞菌属、诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、突那梭菌属、韦龙氏假单胞菌属、乳杆菌属、克雷伯氏菌属以及不可培养ε-变形菌、腐败螺旋菌属、粘球菌属、根瘤菌属和6种未知分类地位的不可培养细菌,说明采用DGGE指纹图谱能更系统、更真实地反映茯砖茶发花发酵过程中细菌群落结构和多样性变化。     

鼠伤寒沙门菌spvB基因缺陷突变株的构建

高度保守的spvB基因,其编码产物具有ADP核糖基转移酶活性,是导致受染后细胞发生凋亡的重要毒力因子.为进一步研究该基因致病机制,构建了鼠伤寒沙门菌spvB基因缺陷突变株.根据GenBank鼠伤寒沙门菌spvB基因序列,用Primer Premier 5.0设计PCR特异性引物,获得spvB基因缺陷性核苷酸片段后连接至自杀质粒PGMB151.将构建的自杀载体导入含有spvB基因的鼠伤寒沙门菌标准株SR-11中进行同源重组,PCR筛选缺陷突变株.经PCR和DNA序列测定,成功获得了spvB基因缺陷的鼠伤寒沙门菌突变株.     

一株冠突散囊菌的分离鉴定、基因组成及其枇杷花发酵特性分析

【背景】冠突散囊菌LYEC03是从陕西泾阳茯砖茶中分离得到的主要发酵菌株。【目的】研究冠突散囊菌LYEC03菌株的基因组信息及其发酵枇杷花产品的特性,从分子水平阐明冠突散囊菌的发酵机制。【方法】应用形态和显微形态观察、ITS序列鉴定、重测序及框架图测序对所分离的菌株LYEC03进行鉴定和基因组信息解析,采用所分离的菌株LYEC03发酵枇杷花,研究冠突散囊菌对枇杷花主要功效成分及抗氧化性能的影响。【结果】陕西泾阳茯砖茶中分离得到的主要发酵菌株LYEC03确定为冠突散囊菌。菌株LYEC03与参考基因组覆盖率高,含有丰富的纤维素酶、蛋白酶、氧化酶和脂肪酶相关基因;基因组相关整体变异较小,其中假设蛋白、碳水化合物激酶、纤维素酶家族糖基水解酶、位点2蛋白酶家族蛋白、多酚氧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等与菌株生长、能量代谢调节、产纤维酶、产蛋白酶和产氧化酶相关的基因发生了变异。菌株LYEC03基因组序列长度30 623 602 bp、GC含量51.70%、编码13 033个基因、编码基因占比55.74%,参与了碳水化合物代谢、氨基酸代谢、外源生物降解代谢、能量代谢、脂质代谢与萜类化合物和聚酮类化合物的...     

六堡茶渥堆过程中优势酵母菌的分离与鉴定

为研究梧州六堡茶渥堆发酵过程中优势真菌的种类,本研究采用常规培养计数方法检测梧州某茶厂渥堆过程中的真菌动态变化,同时纯化分离优势酵母菌,通过生化反应和DNA测序技术鉴定该优势酵母菌。研究表明:在六堡茶渥堆发酵过程中,酵母菌为优势种群,酵母菌数量在第二次翻堆达到整个渥堆过程的最高峰,比霉菌数量高出一个数量级。鉴定表明:六堡茶渥堆发酵过程中优势酵母菌(命名为LBC-F-11)为Arxula adeninivorans,对茶叶成份转化及风味形成起着重要作用。本研究可以为六堡茶渥堆发酵研究及工艺改进提供理论依据。     

金花菌黄色素的稳定性及其抗氧化活性研究

【目的】评价茯砖茶金花菌黄色素的稳定性和抗氧化性能。【方法】以色素保存率为指标, 研究温度、光照和pH对黄色素稳定性的影响。并对还原能力、DPPH·清除能力和H2O2诱导的红细胞溶血抑制能力进行测定, 考察黄色素的抗氧化性能。【结果】该色素在低温下保存7 d保存率高于98.88%, 温度升高, 保存率降低; 光照尤其是太阳光对其稳定性影响较大; 黄色素在pH 2?10较稳定, pH 12时色素保存率仅为46.22%。低浓度黄色素具有明显高于维生素E (VE)的还原能力、DPPH·清除率和溶血抑制率, 其中DPPH·的EC50低于50 mg/L。【结论】金花菌黄色素对热、酸和弱碱较稳定, 对强碱和太阳光极不稳定, 并有优良的抗氧化能力, 研究和开发前景良好。     

利用小鼠模型筛选孢子丝菌病快速诊断的特异性引物

目的通过感染孢子丝菌的动物模型筛选文献报道的4对申克孢子丝菌特异性引物,以确定引物的敏感性和特异性。方法12只小鼠随机分成实验及对照组,实验组皮内注射申克孢子丝菌菌悬液,不同时间留取皮损组织,分别进行真菌培养和皮损组织DNA提取,PCR扩增。结果4对引物s2-R2,SSHF31-SSHR97,ITS3-SSP,SS3-SSd在感染申克孢子丝菌的小鼠皮损中均可扩增出目的条带,但引物SSHF31-SSHR97所需浓度较高,引物s2-R2的敏感性和特异性最好,与在体外培养条件下筛试的结果相同。结论针对几丁质合成酶基因I的引物s2-R2对申克孢子丝菌的敏感性和特异性最好。