梅花鹿Fibulin 5 编码区cDNA的克隆及功能研究

为研究梅花鹿扣针蛋白5(Fibulin5, FBLN5)在鹿茸再生过程中的作用,本研究通过RT-PCR获得了梅花鹿FBLN5的cDNA编码区,并对其进行生物信息学分析。同时利用RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）下调了梅花鹿角柄骨膜致敏区（Potentiated pedicle periosteum, PPP）细胞中FBLN5基因表达,并研究了基因表达下调后PPP细胞条件培养液对HUVEC细胞增殖的影响。结果显示：(1) 梅花鹿FBLN5 cDNA编码区长1347 bp,编码448个氨基酸;(2) 生物信息学软件分析显示,梅花鹿FBLN5蛋白含有一个跨膜区,一段23个氨基酸的信号肽序列,vWA_Matrilin、cEGF和EGF_CA等重要的功能结构域;(3) 构建了梅花鹿FBLN5基因的RNAi重组质粒并获得了一条能有效下调目的基因效率达88.72%的靶序列pLVTHM-FBLN2,MTT结果显示PPP细胞FBLN5基因表达量下调后,所获细胞条件培养液可显著促HUVEC细胞增殖,推测FBLN5可能参与了鹿茸再生过程中的血管生成及稳态维持等过程。     

扩展青霉PF898碱性脂肪酶cDNA的克隆及序列分析

扩展青霉 (Penicilliumexpansum)PF898可产生一种具有工业价值的碱性脂肪酶 (PEL) .在测定了其N端 12个氨基酸残基序列的基础上 ,通过RT PCR、5′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得了PEL完整的cDNA序列 (GenBank登录号为AF2 84 0 6 4 ) .cDNA全长 10 5 0bp ,包括PEL编码区、3′非翻译区和部分 5′非翻译区基因的序列 .编码区cDNA由 85 5个碱基组成 ,编码 1个由 2 85个氨基酸残基组成的酶蛋白 ,其信号肽及前肽部分由 2 7个氨基酸残基组成 ,成熟肽部分由 2 5 8个氨基酸残基组成 .根据氨基酸组成推导该脂肪酶蛋白的分子量为 2 7 3kD .该脂肪酶的氨基酸序列 130～ 134位上有各类脂肪酶中普遍存在的G X S X G保守序列     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4 cDNA克隆、序列分析及其编码蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒(Beet Necrotic Yellow Vein Virus,简称BNYVV)内蒙分离物(NM)RNA为模板,通过反转录和PCR扩增得到了BNYVV RNA4基因组的cDNA克隆pGBF6。序列分析结果表明,pGBF6含有全长RNA4 cDNA插入片段,大小为1465个核苷酸,含有一个849个核苷酸的开放阅读框架,编码产生由282个氨基酸组成的分子量为31kDa的蛋白。与法国F2分离物RNA4相比,其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别为97.1％和96.4％,并在5'端非编码区比F2分离物缺失了3个核苷酸。将RNA4编码区cDNA克隆到原核表达载体pFLAG·MAC上,获得融合蛋白表达质粒pFMBF87。所构建的融合蛋白由载体序列编码的14个氨基酸和31kDa蛋白C端的233个氨基酸组成。经IPTG诱导,Westem blotting分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达。本文还对内蒙分离物的株系划分进行了讨论。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

马铃薯Alfin1-like锌指蛋白基因克隆与序列分析

利用紫花苜蓿盐胁迫相关锌指结构蛋白Alfin1基因cDNA序列,通过电子克隆在GenBank中对马铃薯同源EST序列进行查询比较和拼接,获得了1个含有完整编码区的cDNA序列,并通过RT-PCR成功获得了该序列.获得的全长cDNA序列中包含1个747 bp的最大读码框,编码248个氨基酸,将其命名为Stfin1.氨基酸序列分析表明存在典型的Cys4-His-Cys3锌指结构,与Alfin1一致性达93.09%.从结构分析结果推测Stfin1与Alfin1在功能上具有一定的相关性.     

人脑红蛋白(NGB)全长cDNA序列的克隆

人脑红蛋白(neuroglobin, NGB)是新发现的神经系统特异的携氧蛋白, 然而其全长cDNA序列一直未见报道. 采用电子序列延伸技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)研究发现, 人NGB全长cDNA序列为1 909 bp, 5′非编码区为375 bp, 编码区(456 bp)可编码151个氨基酸, 3′非编码区为1 078 bp, 其中含27 bp的poly(A)(GenBank接受号: AF422797). 综合采用电子序列延伸技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法, 为后续的功能研究提供了重要基础.     

斜带石斑鱼CD4基因克隆和组织表达分析

CD4 作为TCR的共受体可以提高TCR/抗原-MHC复合体的稳定性,辅助TCR识别抗原,并且参与T细胞活化.本研究从斜带石斑鱼Epinephelus coioides头肾中克隆得到全长2240 bp的CDM cDNA序列,该序列包含长1410 bp的ORF,编码469个氨基酸,预测蛋白分子包含一段信号肽,4个Ig样区...     

德国小蠊变应原Bla g 8的克隆表达及进化分析

通过5’-RACE获得德国小蠊变应原Bla g 8基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,建立系统进化树,为进一步研究奠定基础。通过5’-RACE技术,PCR扩增获取编码德国小蠊变应原Bla g 8蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法分析预测Bla g 8蛋白的信号肽、疏水性、跨膜区、二级结构、三级结构;建立系统进化树;构建原核表达载体pET32a-B8,IPTG诱导重组蛋白表达,并用His-tag抗体Western blotting验证。结果显示,获得编码德国小蠊变应原Bla g 8的全长cDNA序列,其完整阅读框含618个碱基,编码205个氨基酸。序列分析显示该蛋白,肌球蛋白轻链,具有EF手蛋白保守功能域。IPTG诱导获得重组蛋白。获得德国小蠊Bla g 8的完整cDNA序列,成功构建重组原核表达质粒pET32a-B8,并表达出融合蛋白。     

莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶cDNA克隆及其酵母表达

旨在预测并克隆莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶cDNA(cracs),分析其在酵母中的功能。RT-PCR克隆cracs序列,Clustal W和MEGA6.0软件分别分析其编码蛋白保守序列和进化树,表达并分析其在酵母YB525中的底物偏好性。结果表明,首次在莱茵衣藻中克隆获得一个cracs,测序表明其序列大小为2 004 bp,编码667个氨基酸,编码蛋白crACS的预测分子量为72.3k D,包含酰基辅酶A合成酶的两个保守区:AMP-binding区和FACS区。进化树比对显示,cr ACS与拟南芥的长链酰基辅酶A合成酶LACSs具有较高的同源性。酵母表达显示cracs编码蛋白能互补酵母YB525 LACS的缺陷表型,活化并优先利用C16∶1和C14∶0。莱茵衣藻cracs编码蛋白可活化外源脂肪酸,属于酰基辅酶A合成酶家族。     

棕色棉F3'H-羟化酶基因的克隆与生物信息学分析

根据葡萄的类黄酮3′-羟化酶(F3'H)基因全长cDNA序列Blast所得棉花的EST序列设计引物,以开花后16 d(DPA16)的新彩棉5号(xC-5)纤维为材料,利用RACE和RT-PCR技术分离得到了2个类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列,此2个序列编码区完全相同,仅在3'UTR区存在片段长短的差异,推测可能是基因转录后加工方式不同所造成.克隆所获得的棉花F3'H基因编码区全长1 533 bp,编码510个氨基酸,氨基酸序列分析预测表明,该基因所编码蛋白含有一个跨膜结构域,是一种分泌蛋白,定位于内质网上,并含有一段与细胞色素P450功能区相匹配的保守功能域;序列比对结果表明,棉花F3'H基因与其他多个物种的F3'H基因在氨基酸序列上有较高的同源性;聚类分析结果表明,棉花F3'H蛋白与双子叶植物大豆的F3'H亲缘关系较为接近,而与单子叶植物高梁等作物则较远.     

家蝇转铁蛋白基因的克隆和生物信息学分析

为了研究家蝇转铁蛋白基因功能,获得全长cDNA序列并对其蛋白序列进行生物信息学分析,利用在线分析程序和相关工具软件分析转铁蛋白基因的开放读码框,分析编码蛋白的理化性质、结构域、并预测其空间结构和功能。结果表明家蝇转铁蛋白基因编码蛋白由622个氨基酸组成,分子量为70.58kDa,理论等电点为5.33,为稳定蛋白,有跨膜区,含有信号肽,该蛋白属于TR-FER保守结构域家族,亚细胞定位于细胞核,二级结构以无规则卷曲为主,功能预测该蛋白具有酶活性。     

粘虫核糖体蛋白S7 cDNA的克隆和表达分析

运用RT-PCR和RACE技术克隆了粘虫Mythimna separata(Walker)核糖体蛋白S7基因(RPS7)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JN582331),并对其进行生物信息学分析。结果表明,粘虫RPS7全长cDNA序列为762 bp,包括5'非编码区32 bp和3'非编码区67 bp。其开放阅读框(573 bp)编码190氨基酸肽链,具有核糖蛋白S7e蛋白家族典型特征。该肽链理论分子量为21.924 ku,等电点为9.82,富含4种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物RPS蛋白序列具有96.8%～98.2%高度同源性。应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发育RPS7表达模式。RPS7表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化,这一结果显示RPS7是在转录水平上呈现发育性调节。     

一种苦荞主要过敏原基因cDNA的克隆及序列分析

为了获得苦荞中主要过敏原的cDNA和由此推导的蛋白质序列 ,分析其结构特点 ,以苦荞幼根根尖为材料 ,提取总RNA并反转录mRNA为cDNA第一链 .通过RT PCR、3′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得一种苦荞主要过敏蛋白基因的cDNA片段 (GenBank登录号为AY0 4 4918) .该cDNA片段由 76 8bp组成 ,包括 3′端非编码区 180个bp ,开放阅读框 5 88bp .可编码一个由 195个氨基酸残基组成的功能蛋白及一个终止密码 .苦荞主要过敏原基因与甜荞 2 2kD过敏蛋白、豆球类蛋白的核苷酸序列分别有 95 %和 93%的同源性 .其推导的氨基酸序列与甜荞球蛋白、刀豆蛋白、甜橙柠檬素分别有 93%、83%和 5 7%的同源性 .该过敏蛋白 183～ 188位氨基酸残基KEEEKE在多数不同过敏原中均存在 ,推测可能为其中的抗原决定簇序列     

吉林双阳型梅花鹿sentrin/SUMO的发现

为了确定梅花鹿未知的编码区cDNA,我们利用TaKaRa公司的cDNA 合成试剂盒及PCR cDNA文库试剂盒,构建了吉林双阳型梅花鹿子宫PCR cDNA文库。将文库的PCR产物克隆入pGEM-Teasy载体并进行测序后,应用BLAST网络服务对测得的序列在GenBank数据库中进行同源性比较。结果显示构建的PCR cDNA文库中包含有不同长度的cDNA片段,而且自该文库中我们发现了一与人sentrin-1/SUMO-1（small ubiquitin-related modifier 1）高度同源的全编码区cDNA序列。此序列已在Genbank登录,登录号为AF 242526。这说明我们自梅花鹿子宫PCR cDNA文库中发现了梅花鹿的sentrin/SUMO基因。 Abstract: In order to identify unknown encoding cDNAs of Cervus nioppon Temminck (sika deer),we constructed a cDNA library of uterus from Jilin-Shuangyang Cervus nippon Temminck using PCR cDNA library kit.PCR products of the library were cloned into pGEM-Teasy vectors and the cDNAs were sequenced and analyzed by nucleotide homology comparison against GenBank Database using the BLAST network service.The results showed that the cDNA library contained cDNA fragments of different lengths and a full length encoding cDNA highly homologous to human sentrin-1/SUMO-1 (small ubiquitin-related modifier 1) was identified.The cDNA was deposited in GenBank under the accession number AF 242526.These show that Cervus nippon Temminck-derived sentrin/SUMO gene has been discovered from PCR cDNA library of uterus from Cervus nippon Temminck.     

美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

旨在通过5’-RACE获得美洲大蠊3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,为进一步研究其功能奠定基础.通过3’-RACE技术,PCR扩增获取编码美洲大蠊GAPDH蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法推导出该序列编码的氨基酸序列及其理化性质;预测信号肽、蛋白疏水性、可溶性、跨膜区结构、二级结构、三级结构,并构建系统发育树;构建原核表达载体pET28a-GAPDH,IPTG诱导重组蛋白表达,并用Histag抗体Western blotting验证.结果显示,美洲大蠊GAPDH基因,其完整阅读框含999个碱基,编码332个氨基酸.序列分析显示,该蛋白与家蚕GAPDH相似性为89％,具有GAPDH保守功能域,经IPTG诱导获得重组蛋白.     

通过新基因计算机识别与实验确认对NCBI人类基因数据库一些模式参考序列错误的分析与纠正

采用生物信息学分析与实验确认相结合的技术路线,通过所识别的基因在非冗余数据库比对发现了网上公布的计算机注释人类基因组编码序列存在各种类型的多处错误,包括cDNA水平的一个或一段碱基插入、缺失或突变,或是这些错误的不同排列组合,其中以错误插入为多,往往导致编码氨基酸的移码突变。最先举证了NCBIGENOME Annotation Project预测人类新基因的下列错误类型：(1)开放读码框架(0RF)中错误插入一个碱基造成编码氨基酸移码;(2)错误拼接;(3)开放读框中错误插入一个或一段碱基造成该读框提前终止。只编码N-端氨基酸的cDNA序列而不完整;(4)只有编码c一端氨基酸序列的cDNA而不完整;(5)只是正确基因0RF中间的一段编码蛋白cDNA序列而不完整,缺N-端与C-端氨基酸序列,并且将不完整蛋白氨基酸序列的第一个非起始码氨基酸错误地预测为起始码氨基酸,如将L错误地预测为M;(6)开放读框中错误插入一个或一段碱基造成前面出现不该有的终止码,因而编码蛋白缺开头部分氨基酸;(7)可能将污染基因组序列当作完整基因cDNA序列对待而预测出所谓单一外显子基因。即便真是基因,也只是较长单一外显子mRNA中有一小0RF,而0RF起始码上游同一相位确实存在终止码,无其他特点符合基因条件;(8)所预测基因只有0RF,而0RF两端没有任何EST证据,可据此0RF拼接出受EST和人类基因组双重支持的完整基因cDNA(开放读框上游同一相位有终止码),预示所预测0RF参考序列可能不正确;(9)有EST实验证据支持存在基因的人类基因组序列范围内又被预测出一条相似但更小的蛋白编码基因,因而新预测基因有可能是错误的。     

白鹅催乳素基因的克隆及诱导表达条件的优化

摘要: 运用RT-PCR方法, 从白鹅脑垂体总RNA中扩增得到了催乳素(Prolactin, PRL)基因编码区序列cDNA, 并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列分析表明, PRL cDNA包括终止密码子在内的长度为690 bp,编码230个氨基酸残基的蛋白质, 与皖西白鹅的有所差异, 二者碱基同源性在99.57%, 氨基酸同源性达99.56%。将PRL基因编码区序列cDNA定向克隆到表达载体pET-32a (+)中, 构建表达质粒pET-32a(+)-PRL。该质粒的BL21 (DE3)转化菌在IPTG的诱导下可表达PRL基因融合蛋白, IPTG终浓度1 mmol/L, 37℃, 诱导4 h表达量最高, 表达量约占菌体总蛋白的28.96%。     

家蝇泛素结合酶基因的生物信息学分析

利用EST测序技术从家蝇幼虫cDNA文库中获得家蝇泛素结合酶基因(MD-E2)cDNA序列,采用NCBI、ExPASY中的相关工具,对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析,MEGA软件构建了进化树。结果表明,家蝇泛素结合酶基因的cDNA序列具有完整的ORF框,全长480 bp,一共编码159个氨基酸。其编码的蛋白质理论分子量为18.117 9 kD,等电点8.64,无信号肽及跨膜区,属于亲水性蛋白,具有泛素结合酶家族的活性位点(FHPNVYPSGTVCLSLL),主要分布于细胞核;二级结构以无规则卷曲为主,β折叠较少。