四膜虫基因表达数据库: 四膜虫全基因组基因表达芯片和协同表达分析的数据资源

嗜热四膜虫是一种优良的真核模式生物, 对其功能基因组学的分析将为研究细胞和分子生物学的基础性重大问题提供新的机遇. 四膜虫基因表达数据库(TGED)是原生动物纤毛虫中第一个基因表达数据库, 整个数据库包括了四膜虫3个重要的生理和发育阶段20个时间点的全基因组基因表达数据, 提供了友好的网页界面(http://tged.ihb.ac.cn)供用户获取这些数据. 通过基因的标识号或描述信息, 用户可以获取基因表达谱信息和协同表达基因. 此外, TGED同时提供了制备四膜虫基因表达芯片的样品制备方法. 欢迎研究者上传和分享其所有的基因芯片数据, 以期为四膜虫或纤毛虫研究提供重要的功能基因组学资源.     

嗜热四膜虫可变剪接基因鉴定及功能分析

可变剪接是产生蛋白质组多样性和调节基因表达的重要机制,相关研究在高等真核生物中开展较多,而在单细胞真核生物中则较少,尤其是单细胞原生动物纤毛虫中,仅有少量报道。本文基于单细胞模式原生动物嗜热四膜虫种大量转录组数据,对其可变剪接基因进行了鉴定及分析。在嗜热四膜虫中共鉴定到2 894个可变剪接位点,涉及到2 698个可变剪接基因,可分为四类。考虑到转录本拼接的准确性,选择了其中464个与基因组预测模型完全一致的可变剪接基因进行深入分析,其中生长(growth)时期、饥饿(starvation)时期、接合生殖(conjugation)时期特异性的可变剪接基因分别为49个、79个和135个。对可变剪接基因的功能进行分析表明其涉及的功能广泛且显著富集于蛋白激酶过程,提示可变剪接基因在嗜热四膜虫蛋白磷酸化和信号传导中具有重要作用。     

嗜热四膜虫减数分裂研究进展

减数分裂是真核生物有性生殖过程的关键步骤,染色体的行为变化贯穿整个减数分裂的过程。近些年来,借助先进的分子生物学技术和细胞学实验手段,通过对突变细胞株的筛选和评价,单细胞真核模式生物原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)减数分裂方面的研究取得了长足的进展。本文主要介绍嗜热四膜虫减数分裂的过程,以及在此过程中伴随染色体行为变化的相关基因的功能,从而为进一步探讨嗜热四膜虫减数分裂的分子机制提供有效信息。     

嗜热四膜虫δ微管蛋白基因的克隆、鉴定及细胞定位

微管蛋白(tubulin)在细胞的结构和功能中发挥着重要作用, α微管蛋白和 β微管蛋白是组成微管的主要因子,γ微管蛋白促使α和β微管蛋白二聚体组装为微管结构. 然而, 4种新的微管蛋白δ-,ε-,ζ-, 和η- tubulin在细胞中的功能并不完全清楚. 本研究从嗜热四膜虫大核基因组数据库中鉴定了一种新的编码δ微管蛋白基因（Tetrahymena delta tubulin 1, TDT1, TTHERM_00335970, http://www. ciliate. org）, TDT1基因转录产生1 326 bp和 1 363 bp两种不同的转录本, 1 326 bp的转录本编码441个氨基酸的多肽; 而1 363 bp的转录本含有37 bp未剪切的内含子序列, 从而导致开发读框发生移码突变现象. 实时荧光定量PCR结果表明, TDT1基因在四膜虫细胞营养生长和有性生殖过程中都有表达, 且在有性生殖过程中的表达显著上调. 免疫荧光定位表明, TDT1蛋白不仅定位于四膜虫基体和有性生殖期conjugation junction结构, 而且在四膜虫的大核和小核中也有定位. TDT1基因敲除发现,该基因不能通过表型分配完全被巴龙霉素抗性基因替代, 结果表明, TDT1蛋白在四膜虫细胞中可能具有多种不同的功能, 它的正常表达对四膜虫细胞的生存是必需的.     

嗜热四膜虫——具有发展潜力的功能基因组学研究模型

在真核生物的分子生物学和遗传学研究方面,纤毛类原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)已经被证明是一种有价值的生物学模型。通过对它的研究,人们发现并且掌握了核酶的分子机制、RNA的自我拼接、端粒的结构和功能、DNA序列重组等机理。这种原生动物的基因组功能分别由两个细胞核执行,即二倍体的小核与生殖过程有关,而多倍体的大核决定细胞的基因转录,并为转化基因的表达提供了强有力的手段。     

有机污染物二氯二苯三氯乙烷、三丁基锡和2，3，7，8-四氯二苯并二嗯英暴露下的四膜虫毒理基因组学研究

有机污染物二氯二苯三氯乙烷（DDT）、三丁基锡（TBT）和2,3,7,8．四氯二苯并二嗯英（TCDD）因对水生生态系统的危害以及对人体健康造成的严重伤害而受到重视．本实验以模式生物原生动物嗜热四膜虫为研究对象,利用microarray技术筛选了在上述3种污染物下分别暴露24h后差异表达2倍以上的基因,并在geneontology功能注释的基础上,通过富集分析考察了这些基因涉及的主要功能,其中许多功能和多细胞生物中的报道相一致．随后,以TCDD中富集功能注释的基因为核心,通过CLR算法构建了TCDD相关基因的相互作用网络,依照功能将其划分为2个亚网络,并在此基础上推测了TCDD在四膜虫中的作用机制模型．结果显示,四膜虫具有成为在基因组水平研究毒物作用机制的单细胞生物模型的巨大潜力．     

新疆天山雪莲转录组注解知识库

新疆天山雪莲(Sasussured involucrata)具有较高的极端低温耐受特性,为低温耐受机制研究提供了一种非常好的模式植物。新疆天山雪莲转录组注解知识库(http://www.shengtingbiology.com/Saussurea KBase/index.jsp)是基于网络数据资源的综合性数据库,由html、Perl、Perl CGI/DBD/DBI、Java和Java Script编程所设计的前端界面和用于数据存取、注释及管理的后端数据库管理系统Postgrel SQL构成。知识库包含基因组数据、转录组原始数据、质量控制数据、GC含量、功能基因序列及注释、功能基因代谢通路、功能基因的注释统计、雪莲与其它物种的转录组或基因组比较分析数据和生物分析软件包等资源。该数据库不仅有利于低温功能基因组学及低温耐受机制研究,而且为冷耐受性状物种的分子育种提供基因资源平台和理论依据。     

错配修复蛋白Mlh3对四膜虫有性生殖是必需的

DNA错配修复(mismatch repair, MMR)是一种进化中保守的机制,它校正DNA复制过程中产生的错误,维持基因组的稳定性。MMR家族蛋白同时也参与多种DNA相关的生物学功能。本研究从嗜热四膜虫鉴定了一种新的错配修复蛋白MLH3基因,该基因预测编码 319 个氨基酸,在有性生殖期特异表达。免疫荧光定位表明,HA-Mlh3定位在有性生殖期减数分裂的小核和新发育的大核中。MLH3 敲除的突变体细胞株,在有性生殖发育期停滞在两大核和两小核阶段,新大核DNA复制受阻。γ-H2A.X 检测表明,新大核和小核有性生殖后期断裂的基因组不能正常修复,发育中的细胞裂解,不能形成有性生殖后代。结果表明,Mlh3参与四膜虫新大核发育过程基因组的断裂修复和复制,对四膜虫的有性生殖是必需的。     

RanGTPase激活蛋白RanGAP在嗜热四膜虫细胞中的定位及功能

RanGTPase激活蛋白（RanGTPase activating protein,RanGAP）和Ran相互作用,提高了Ran GTPase水解GTP的效率. RanGAP参与细胞内核质运输、纺锤体组装、核膜重建和异染色质的组装．生物进化过程中,不同生物的RanGAP表现出结构和功能的多样性．本研究从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出1个保守的RanGTPase激活蛋白基因RanGAP（TTHERM_00766430）．实时荧光定量PCR表明,RanGAP在四膜虫营养生长、饥饿和有性生殖过程中均有表达,且在有性生殖4～6 h表达水平最高．免疫荧光定位表明,在营养生长期、饥饿期及有性生殖的早期,RanGAP定位于细胞质中| 在有性生殖后期, RanGAP定位于凋亡的大核中．过表达RanGAP的细胞增殖速率下降,大核分裂和胞质缢缩异常, 产生无大核细胞．敲减RanGAP的细胞大核形态异常,细胞增殖速率下降,无丝分裂受到抑制,进而产生无大核细胞．RanGAP的过表达或敲除分别引起四膜虫RAN1,RanBP1和RCC1基因的表达下调或上调．结果表明,RanGAP通过Ran信号通路调控了嗜热四膜虫无性生殖过程中大核的无丝分裂,并可能参与了有性生殖过程中亲本大核的凋亡．     

双氢青蒿素对嗜热四膜虫的毒性效应

以嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)为试验对象, 双氢青蒿素(Dihydroartemisinin, DHA)以终浓度为0(对照组)、40、80、160和320 μmol/L 分别加入到嗜热四膜虫细胞培养液中, 探讨双氢青蒿素对嗜热四膜虫的毒性作用。采用 CCK-8 法检测嗜热四膜虫细胞增殖, 倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞的形态结构及运动, 采用流式细胞术检测线粒体膜电位, 检测细胞内抗氧化还原酶活力和线粒体酶活力。结果表明, DHA显著抑制嗜热四膜虫增殖(P＜0.05), 在一定暴露时间内增殖活力和浓度呈负相关。双氢青蒿素作用嗜热四膜虫48h后各暴露组细胞皱缩变圆, 对照组细胞呈椭圆状。其中在160和320 μmol/L DHA暴露下, 嗜热四膜虫在培养基中的活动减弱, 细胞核出现固缩和浓染等特征, 线粒体膜电位显著下降(P＜0.05)。随着 DHA浓度增加, 细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性先增强后下降。线粒体内琥珀酸脱氢酶(SDH)活性逐渐降低, 与对照组相比, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。上述结果表明, 双氢青蒿素对嗜热四膜虫具有毒性作用, 抗氧化酶在一定程度上能抵抗双氢青蒿素暴露导致的氧化损伤。氧化应激和线粒体损伤可能是双氢青蒿素对嗜热四膜虫产生毒性效应的重要机制。     

嗜热四膜虫腺苷三磷酸结合盒转运蛋白ABCC10基因的可变剪切分析

哺乳动物中腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABCT)可通过可变剪切产生多种转录本,其中含有提前终止密码子(premature terminal codon,PTC)的转录本还可与无义介导的mRNA降解通路(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)作用来调节蛋白的相关功能,但这些现象尚未在低等生物的ABCT研究中发现.该文以单细胞原生动物——嗜热四膜虫为对象,利用转录组数据发现ABCC10基因存在可变剪切,并产生两条转录本(SV1和SV2),其中SV2在第五个内含子处发生内含子保留事件,这段长49bp的序列使SV2发生移码并产生PTC.在构建NMD通路中关键因子UPF1基因的嗜热四膜虫敲降株的基础上,利用实时荧光定量PCR方法检测SV2的转录情况.结果显示:含有PTC的转录本SV2在UPF1敲降株中的转录水平相对于野生型显著增加,说明SV2可被NMD通路降解.这与高等动物中某些ABCC蛋白通过可变剪切引入含PTC转录本,并能被NMD降解的方式一致,推测该方式在真核生物中十分保守,并在真核生物的共同祖先(the last eukaryotic common ancestor)中就已形成.     

生物信息学在昆虫学研究中的应用

随着深度测序和基因芯片技术的不断发展,基因组、转录组、表达谱数据大量积累。目前,至少有10多个昆虫的基因组已被测序,30多个昆虫的转录组数据被报道。显然,传统的生物统计学方法无法处理如此海量的生物数据。量变引发质变,生物数据的大量积累催生了一门新兴学科,生物信息学。生物信息学融合了统计学、信息科学和生物学等各学科的理论和研究内容,在医学、基础生物学、农业科学以及昆虫学等方面获得了广泛的应用。生物信息学的目标是存储数据、管理数据和数据挖掘。因此,建立维护生物学数据库、设计开发基于模式识别、机器学习、数据挖掘等方法的生物软件,以及运用上述工具进行深度的数据挖掘,是生物信息学的重要研究内容。本文首先简要介绍了生物信息学的历史、研究现状及其在昆虫学科中的应用,然后综述了昆虫基因组学和转录组学的研究进展,最后对生物信息学在昆虫学研究中的应用前景进行了展望。     

RAN1基因过表达抑制嗜热四膜虫大核无丝分裂

Ran GTPase通过RanGTP/RanGDP循环的形式,参与调控多种细胞增殖方式：包括有丝分裂和减数分裂.敲减RAN1基因可导致嗜热四膜虫大核内微管组装紊乱,从而抑制大核无丝分裂.为进一步分析Ran1在无丝分裂中的功能,本研究将野生型Ran1以及模拟GTP（Ran1Q70L）和GDP（Ran1T25N）锁定形式的Ran1突变体在嗜热四膜虫中过量表达,均导致四膜虫细胞增殖速率下降,并引起大核无丝分裂异常,且这种核异常细胞比率与Ran1过表达量呈正相关.免疫荧光定位结果显示,过表达的HA-Ran1在整个细胞中弥散分布,破坏了正常的Ran1分布形式;而过表达的HA-Ran1Q70L明显集中在大核核膜和胞质中,HA-Ran1T25N则主要定位在大核和小核内,分别与Ran1GTP/Ran1GDP循环的辅助调节因子定位模式一致.以上结果表明,过表达Ran1及其突变体可能影响嗜热四膜虫细胞中正常的Ran1GTP/Ran1GDP循环,进而导致大核无 丝分裂异常.     

嗜热四膜虫染色体浓缩调节因子(RCC1)的定位及功能

真核细胞中染色体浓缩调节因子(regulator of chromosome condensation 1,RCC1)是RanGTPase唯一的鸟嘌呤核苷酸交换因子.染色质结合的RCC1和RanGTPase相互作用,催化细胞核内RanGDP向RanGTP的转化,进而调控了核质间的定向运送、有丝分裂期纺锤体的组装以及核膜的形成.本实验从原生生物嗜热四膜虫大核基因组中鉴定了1个新的RCC1(TTHERM_00530380)基因.该基因全长2 541 bp,包含2个内含子序列,开放阅读框为2 181 bp,编码726个氨基酸.实时荧光定量PCR表明,RCC1在四膜虫营养生长、饥饿以及有性生殖时期都有表达,且在有性生殖转录水平达到最高.免疫荧光定位分析表明,HA-RCC1在营养生长和饥饿时期,定位于大核和小核中;在有性生殖时期,定位于亲本大核、减数分裂的小核、新生成的大核和凋亡的大核中.过表达RCC1导致大核的无丝分裂异常,细胞增殖变慢,最终产生无大核的后代细胞.敲减RCC1导致了多小核的产生.结果表明,RCC1参与调控了四膜虫细胞核的分裂,RCC1的正常表达对核分裂以及细胞增殖起到重要的调控作用.     

嗜热四膜虫SPO11基因缺陷型细胞株的基因表达变化分析

有性生殖的关键过程是通过减数分裂产生生殖细胞,而减数分裂的一个重要环节是进行基于DNA双链断裂的同源染色体重组。在同源染色体重组过程中,SPO11蛋白催化产生DNA双链断裂,从而起始同源染色体的重组。因此,研究SPO11基因缺失在减数分裂过程中所引起的基因表达变化有助于在转录组水平上了解该基因的作用。本研究通过对嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)野生型和SPO11敲除细胞株在接合生殖时期2 h、3 h、4 h、5 h四个时间点的转录组进行高通量测序。通过差异表达基因分析和功能富集分析,发现SPO11基因敲除之后嗜热四膜虫在接合生殖时期2 h时,与DNA代谢过程和DNA复制相关基因的表达发生变化,推测SPO11基因敲除导致的减数分裂过程异常可能与DNA代谢过程和DNA复制相关。     

诱导嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)细胞凋亡样变化的研究

本文以单细胞真核生物嗜热四膜虫(Te-trahymena thermophila)作为实验材料以抗肿瘤药物高三尖杉脂碱(Homoharringtonine,HHT)、糖皮质激素类药物地塞米松(9α-Fluo-ro-16α-methylprednisolone,Dex)和抗生素类药物放线菌素D(Actinomycin D)诱导嗜热四膜虫凋亡并研究其细胞凋亡过程的生物化学特性。结果表明抗肿瘤药物及抗生素类药物均不能明显地诱导嗜热四膜虫细胞凋亡。但糖皮质激素类药物在含一定量的Ca~(2 )、Mg~(2 )离子时能诱导嗜热四膜虫发生凋亡。作者认为诱导嗜热四膜虫凋亡过程可能与糖皮质激素类药物诱导鼠胸腺细胞凋亡的机制是类似的,嗜热四膜虫与胸腺细胞的凋亡过程可能同样被Ca~(2 )、Mg~(2 )离子依赖性的核酸内切酶的活化机制所控制着。     

错配修复蛋白Tmlh1维持嗜热四膜虫细胞核的稳定性

DNA错配修复(DNA mismatch repair,MMR)蛋白Mlh1和其它因子形成多种不同的复合物,在DNA复制后的MMR途径和减数分裂DNA重组中发挥重要作用。然而对Mlh1的功能并不完全清楚,进一步分析Mlh1在不同进化地位生物中的功能具有重要意义。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)含有不同的错配修复复合物,基因表达谱分析发现,MutL复合物中的TMLH1(TTHERM_00127000)在营养生长期和饥饿期低水平表达,在有性生殖减数分裂期表达水平显著上调。免疫荧光定位显示营养生长期,Tmlh1定位于生殖系小核和转录活跃的大核;有性生殖期,定位于功能性小核和亲本大核,但在凋亡的大核和小核中消失。在减数分裂和有丝分裂时期,Tmlh1和α-微管蛋白(α-tubulin)存在共定位;而有性生殖后期,Tmlh1与异染色质蛋白Pdd1共定位于DNA删除的异染色结构域。TMLH1敲除细胞增殖速率降低,DNA损伤修复抑制,导致有性生殖细胞配对率降低和微核形成。1 mmol/L甲基甲磺酸甲酯(methy methanesulfonate, MMS)处理下,ΔTMLH1细胞传代时间增加了4.53%±0.35%,而野生型细胞传代时间增加了0.60%±0.14%。TMLH1敲除突变细胞株小核上呈现强烈的γ-H2A.X的荧光信号。免疫共沉淀和蛋白质谱分析发现,Tmlh1同微管蛋白、错配修复因子MutS、同源重组修复关键因子Rad51,非同源末端修复因子Ku80因子等存在相互作用。这些结果表明,嗜热四膜虫错配修复蛋白Tmlh1通过多种途径参与DNA修复和基因组重排,从而维持四膜虫生长发育和有性生殖过程中细胞核的稳定性。     

抗沉默因子Asf1调控嗜热四膜虫细胞核的稳定性

组蛋白H3/H4的分子伴侣Asf1(anti-silencing factor 1),参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体装配,同时参与转录调控、基因沉默以及DNA损伤修复等过程. 在不同生物中,Asf1具有功能的保守性和多样性．嗜热四膜虫ASF1（TTHERM_00442300）基因编码的蛋白质含有保守的N端结构域和酸性的C端结构域．N端结构域同源序列进化树分析表明,Asf1进化与物种进化一致．实时荧光定量PCR表明,ASF1在四膜虫营养生长、饥饿及有性生殖时期均有表达,且在有性生殖4～6 h转录水平达到最高．免疫荧光定位分析表明,HA-Asf1在营养生长时期以及有性生长时期定位于功能大核和小核中,而在凋亡的大核中信号消失．过表达ASF1导致大核及小核变大,抑制细胞增殖．敲减ASF1后会导致大核形态异常,小核缺失．结果表明,ASF1表达对细胞核的形态和结构维持发挥重要的调控作用．     

系统生物学

随着人类基因组测序计划的完成和后基因组时代的到来,国际上基因组、转录组、蛋白质、代谢组乃至表型组工作的相继开展,随着各种类型功能基因组数据的爆炸性增长,信息整合和数据挖掘的重要性显得尤为突出。有人将细胞的基因组、转录和蛋白质组综合起来称为操纵子组(Operomics)来研究功能,正体现了这种认识。 同时,随着研究的深度和复杂性增加,从生物