Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中,Qβ RNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶,是比较重要的应用酶种之一。该酶由4个亚基组成,其中只有 β亚基是由病毒基因编码,而其他3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时,得到的β亚基几乎都是不溶性蛋白,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高β亚基的溶解性,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33rep,同时利用pET21a(+)为表达载体表达其他3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDSPAGE分析表明,当β亚基与EFTuTs亚基共表达时,溶解度有一定的提高,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度,相对增强可溶性β亚基的表达,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高。     

苏云金杆菌超氧化物歧化酶的纯化和性质研究*

苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）９１６５超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）,经硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＦ－１００凝胶过滤及非变性凝胶电泳（ＰＡＧＥ）三步纯化,纯酶比活力为４３８８ｕ／ｍｇ,属Ｍｎ－ＳＯＤ,分子量为４７．９ｋｕ,由二个亚基组成,含１９种氨基酸。     

类大麦属高分子量谷蛋白基因Kx的序列测定及表达

利用SDS_PAGE检测了2份类大麦属(Crithopsisdelileana)材料的高分子量谷蛋白亚基组成,并对其中1份材料的x型亚基进行了克隆和测序。结果表明,2份材料具有完全相同的蛋白电泳图谱。在小麦的高分子量区域仅检测到一条蛋白质带,与小麦y型亚基的迁移率接近,但克隆测序表明其为x型高分子量谷蛋白亚基,其编码基因命名为Kx。Kx基因编码区序列长度为2 0 5 2bp ,编码长度为6 6 1个氨基酸残基的蛋白质,其序列具有典型的x型高分子量谷蛋白亚基的特征。Kx基因能在原核表达系统内正确表达,其表达蛋白与来源于种子中的Kx亚基的迁移率完全一致。Kx亚基与小麦属A、B和D ,山羊草属C和U以及黑麦属R染色体组编码的高分子量谷蛋白亚基氨基酸序列非常相似,但在N和C保守区的氨基酸组成以及重复区长度上与它们存在明显差异。聚类分析可将Kx与Ax1聚类为平行的分支。由此可见,来源于C .delileana的Kx基因为一新的x型高分子量谷蛋白亚基基因。     

产气肠杆菌EAM-Z1尿苷磷酸化酶的分离纯化及性质研究

从产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）突变株EAMZ1中分离出一种具有较高转移酶活性的尿苷磷酸化酶(Upase)。经测定这种Upase的分子量为12.8×104,亚基分子量为4.3×10.4,由３个同型亚基组成。N端氨基酸序列为：MRMVDLIATKRDGGE。等电点为4.46。对尿苷的Km为0.29mmol/L。酶反应的最适pH为7.8,最适温度为50℃。该酶能磷酸化尿苷、胸苷、5氟尿苷、2′脱氧5氟尿苷及尿嘧啶βD阿拉伯呋喃糖,且具有较高的转移酶活性,能将尿苷和5氟尿嘧啶转化成5氟尿苷(一种抗癌药物的中间体),其转化率为47％。该酶的这些特性对于酶法合成核苷类抗肿瘤药物和抗病毒药物是十分有用的。     

假单胞菌WBC-3甲基对硫磷水解酶性质的初步研究

从最近分离到的有机磷农药降解菌Pseudomonassp. WBC3中获得了甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MPH,EC 3183）。该酶在48h的培养物中分布比例分别为：上清液2.1%, 胞内862%和胞间质11.7%,说明MPH为胞内酶。经过Cmsepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得电泳纯的酶。SDSPAGE和凝胶过滤层析表明,该酶为单体蛋白,分子量约为34kD。动力学分析显示该酶为非特异性有机磷降解酶,但最适底物为甲基对硫磷。在pH9～12范围,酶表现较高活力水平,最高活力的反应温度为40℃。根据各类金属离子和鳌合剂对酶活的影响,推测MPH为金属酶。     

蜗牛酶中一种人参皂苷Rb1水解酶的分离纯化

通过DEAE-Sepharose离子交换分段层析,DEAE-Sepharose离子交换梯度层析和Sephadex G100凝胶过滤层析三种方法的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出一种人参皂苷Rb1水解酶。分离后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带。应用SDS-PAGE和凝胶过滤层析对分子量的测定,提示该酶是由4个分子量为110～115 kD的相同亚基组成的同源四聚体。Rb1为底物的动力学参数K_m和V_max分别为0.790 mmol/L和10.192 μmol/min/mg。该酶对人参皂苷Rb₁糖键进行有选择的水解,可水解人参皂苷Rb₁C₂₀位的一个糖苷键生成人参皂苷Rd。     

应用CTB基因启动子及信号肽序列构建分泌性表达系统

利用霍乱毒素B亚基基因的启动子、信号肽序列及ctx操纵子的转录终止信号构建了分泌性表达的质粒载体pMCOSS。Β－半乳糖苷酶基因克隆至霍乱毒素B亚基基因的信号肽序列下游后能得到高效分泌性表达。不同的宿主菌和培养基成分中对β-半乳糖苷酶的表达产量有较大的影响,以MM2为宿主菌、在玉米浆培养基中β－半乳糖苷酶的表达产量达4 lOOu／ml,产物的大部分分泌至细胞的周质,活力测定的结果与SDS—PAGE电泳测定结果基本一致,说明表达的β－半乳糖苷酶绝大部分都具有酶活性。构建的蛋白质分泌性表达的载体－宿主系统及合适的培养条件为易形成包含体的蛋白质的高效表达提供了一条新的途径。     

日本根霉IFO5318胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及部分特性

采用硫酸铵沉淀及柱层析等步骤纯化了日本根霉IFO5318的β—葡萄糖苷酶,回收率为22％。该酶分子量约为4.0×10~5,由四个相同大小的亚基组成;最适反应温度55℃,最适反应pH5.5;对热较敏感,但能在较大的pH范围内保持稳定。用对硝基苯基—β-D-吡喃葡糖苷为底物,测得的K_m和V_(max)值分别为0.825mg·ml~(-1)和135.4μmol·min~(-1)·mg~(-1)。该酶对纤维二糖的水解能力最强,SDS、Fe³⁺、Hg²⁺等对酶活力有抑制作用。     

蜜环菌胞外漆酶的合成、纯化及性质研究

研究了蜜环菌胞外漆酶合成条件和酶学性质。实验表明,培养基初始pH5.5、培养温度25℃有利于菌株产酶;与麦芽糖、山梨糖和半乳糖相比,纤维二糖和棉子糖作为碳源时漆酶产量更高;有机氮源比无机氮源有利于漆酶合成。泥炭提取液可显著诱导漆酶生成,当其含量为50%时,菌株漆酶最高产量是对照组的7倍。在蜜环菌发酵上清液中检测到3个漆酶同功酶组分,其主要活性（约占75%）组份漆酶A经 (NH₄)₂SO₄沉淀、制备级PAGE电泳和阴离子交换柱层析被分离纯化至电泳均一,SDSPAGE法测得酶亚基分子量59kD,凝胶过滤色谱法测定活性酶分子量58kD。纯化的漆酶A等电点pI为4.0,氧化愈创木酚的最适反应pH为5.6,最适温度为60℃,在60℃和65℃时半衰期分别为45min和36.8min,在pH5.2～7.2范围内稳定性较好。100mmol/L Cl^-对该酶有显著抑制作用,1mmol/L SO^2-₄ 对漆酶有激活作用,1mmol/L NaN₃可完全抑制酶活性,10 mmol/L EDTA对漆酶活没有明显影响,1mmol/L Cu²⁺对漆酶有激活作用。以愈创木酚为底物时,测得酶的K_m=1.026mmol/L,V_max=5μmol/(min·mg);以ABTS为底物时,测得其K_m=0.22mmol/L,V_max=69μmol/(min·mg)。     

黑曲霉菊糖酶的纯化及性质

黑曲霉(Aspergillus niger)319发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素52离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析,得到了电泳纯的菊糖酶组分。提纯倍数为67,收率为25.5％。菊糖酶的最适pH为5.0,最适温度为60℃。此酶为单亚基蛋白,凝胶过滤法测得分子量为28000,含糖13.9％,用等电聚焦法测得等电点为5.4,该酶对温度有较高的稳定性,对pH的稳定范围较窄。Hg²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺对该酶有强烈的抑制作用。此酶对菊糖有较强的底物专一性,产物为果糖,但它也可作用于蔗糖,I/S值为0.348。当以菊糖为底物时,K_m为6.25mmol/L,V_m为67.11 μmol·mg~(-1)·min~(-1)。     

绮丽刺毛霉的一种新型甘氨酸氨肽酶的研究

研究了产自于绮丽刺毛霉（Actinomucor elegans）的一种甘氨酸氨肽酶。分子筛层析表明该酶的天然分子的分子量为320kD,SDSPAGE分析表明蛋白质的亚基分子量为565kD。该酶水解含有甘氨酸残基的底物（如glycinenaphthylamine）的效率要较其它氨基酸残基高得多。该酶的最佳反应温度为30℃,最佳pH为8.0。酶的Km和Kcat值分别为0.24mmol/L与1008 s^-1。1.0mmol/L Zn²⁺,Cu²⁺和Cd²⁺可完全抑制该酶的活性。作用于酶巯基的化学物质对酶活性都有抑制作用。根据络合剂反应的实验结果表明该酶是一种含有金属的酶。当与蛋白酶共同作用时该酶除了甘氨酸外还能提高脯氨酸、精氨酸及谷氨酸的水解率。     

黑曲霉T21 glaA 5′上游调控区DNA与蛋白因子的相互作用分析

以糖化酶生产菌株黑曲霉T21(Aspergillus niger T21)的糖化酶基因(glaA)5′cis调控区片段为探针, 采用电泳迁移率变动分析(EMSA)法,从黑曲霉蛋白粗提液中检测到与glaA 5′调控区特异结合的蛋白因子,并把其结合DNA定位在T21 glaA 5′调控区的-374~ -344,-484~-414以及-580~-540 bp 3个区段, 且此3个结合DNA的片段在EMSA实验中呈现交叉竞争, 表明这3个DNA区段可与同一个蛋白因子相结合. 以-374~-344 bp序列为探针的紫外交联实验表明, 该蛋白因子的分子量(或亚基分子量)约为10 ku. 利用DNaseⅠ足印分析确定了此蛋白因子在前两个区段的精细结合部位, 并对其结合序列的特性进行了分析.     

假单胞杆菌D-海因酶的纯化及酶学性质

D 海因酶是工业上生产D 型氨基酸的关键酶 ,用热变性 ,硫酸铵沉淀及SepharoseQfastflow ,Phenyl Sepharosefastflow ,Superose 1 2等柱层析步骤从Pseudomonas 2 2 62菌体中分离纯化了该酶 ,纯化倍数约为 60 ,活力回收约为 1 6%。该酶为同源二聚体 ,分子量约为 1 0 9kD ,亚基分子量约为 53 7kD ,反应最适pH为 8 0 ,最适温度为 70℃ ,在pH6.0～ 1 0 0和温度 60℃以下稳定 ,该酶对巯基试剂敏感 ,大多数二价金属离子如镁、锰离子等能促使酶活提高 ,但高浓度锌离子能抑制酶活 ,以二氢尿嘧啶为底物的米氏常数Km =2 .5× 1 0 - 2 mol L。该酶的N末端1 0个氨基酸残基依次为MDKLIKNGTI     

黑曲霉An-76木聚糖酶系的酶学研究

用分子筛和离子交换等色谱分离技术,由黑曲霉An-76的木聚糖酶系中分离纯化到一种β-木糖苷酶(βx)和三种内切-β-木聚糖酶组分(EX1,EX 2,EX 3)。这几种酶均达到凝胶电泳纯和聚焦电泳纯。用凝胶过滤方法测得3X的分子量为147000,用凝胶电泳法测得EX1、EX2和EX3的分子量分别为2 3000、22000和41 000;βX、EX1、EX2和EX 3的等电点分别为4．6、5．9、4．1和3．9。本文还研究了各种酶的最适反应温度和PH、酶的热稳定性和pH稳定性;研究了金属离子和巯基试剂对酶活力的影响、动力学参数、氨基酸组成、底物持异性和反应产物等。各酶组份不具有分解纤维素的交叉活力。巯基试剂能完全抑制卢βX活力,其活力丧失可被半胱氨酸恢复。     

大豆11S球蛋白Gy5(A3B4)的基因克隆和序列分析

大豆11Ｓ球蛋白(Ｇｌｙｃｉｎｉｎ)是大豆种子的主要贮藏蛋白,分子量为360ｋＤ,由6对相同的蛋白亚基(每对亚基的分子量约60ｋＤ)构成。每对亚基又是由一个酸性Ａ肽(35～45ｋＤ)和一个碱性Ｂ肽(22ｋＤ)通过二硫键连接而成。Ａ肽和Ｂ肽源自同一个基因,即首先由一个大的Ｍｒ?..     

一种新的植物低分子量ATPase的纯化及性质研究

采用丙酮粉技术,DEAE-Sephadex A50及FPLC离子交换层析技术从玉米花粉胞质中分离纯化了一种具有ATPase活性和GTPase活性的低分子量可溶性蛋白,纯化倍数为105倍.用SDS-PAGE、二维电泳及薄层扫描技术分析了分离样品的纯度.亚基分子量约为38ku,非变性PAGE测定的全酶分子量为76ku,表明该酶分子是由两个相同亚基组成的二聚体蛋白.等电聚焦电泳测定其等电点为5.6,是酸性蛋白质.用抗牛脑dynamin或kinesin的抗体进行Western-blotting,结果表明该酶蛋白与它们无免疫交叉反应.药理学研究表明:38ku蛋白对Na₃VO₄及NEM均非常敏感.     

海枣曲霉β-D-岩藻糖苷酶的研究

虽然芦β-D-岩藻糖苷酶(EC3．2．1,38)已从多种动植物中分离纯化,但因它们的专一性均不高而难以确证。我们从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)培养物中提取,经过PEG6000-磷酸缓冲液双水相分离,相继用DEAE—sepbadev A-50、羟基磷灰石、Sephadex G-100等柱层析分离,获得了凝腔电泳均一的β-D-岩藻糖苷酶,比话力提高500倍。酶反应的最适条件为40℃和pH 6.0,在35℃以下和pH5．5—6.5稳定。凝胶过滤法测分子量为50000—60000,用SDS—PAGE测出分子量为57000。酶的Km值为2.4mmol／L,Vmax为12．8μmol·min-1·mg-1。金属离子Ag+．Hg2+对酶有强抑制作用,巯基乙醇和牛血清清蛋白以及甘油 和多种糖能提高酶活力。化学修饰结果表明,-SH、-COOH基团和组氨酸,色氨酸残基为酶活力所必需。该酶只能水解pNPβ-D-岩藻糖苷,有严格的底物专一性,并能专一地受D-岩藻培和D-岩藻糖酸-r-内酯所抑制,为迄今为止最专一的β-D-岩藻钠苷酶,堪称该酶的典型代表。     

绿色木霉纤维素酶系中C1酶的提纯与性质

从绿色木霉(Trichoderma viride) X2-85的麸曲抽提液中,分离出纤维素酶系中的C1酶,经纯化后,用聚丙烯酰胺凝腔电泳和超速离心鉴定,都为均一蛋白。在我们的实验条件下,它对羧甲基纤维素、3-葡萄糖苷及纤维二糖,都不表现活性。该酶能降解徽晶纤维紊、磷酸膨胀纤维素和脱脂棉,主要产物是纤维二糖。用Sephadex G一100凝胶过滤和SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量,分别为54,000和55,000。其沉降系数为4.18。     

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅰ.酶的生成和纯化

以氨为氮源培养头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)时粗抽提液中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)对热稳定,以硝酸盐为氮源时GS对热不稳定。以硫酸链霉素沉淀、热处理、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀和Affini-gel Blue柱纯化了前者,以DE-52柱和Affini-gel Blue柱纯化了后者,纯化后两个酶分子量同为550000,亚基分子量同为56000,热稳定性相同,转谷氨酰基酶活力的最适pH均在6.4～6.7之间,对谷氨酰胺的K_m值同为11.1mmol/L,寸羟胺的K_m值同为1.6mmol/L,所以认为此菌中总是同一GS表现出活力。     

枯草芽孢杆菌基因片段的琼脂糖凝胶电泳分离I．色氨酸C基因片段的分离

限制性核酸内切酶EcoRl酶切枯草芽孢杆菌(Bactllus subtlis) SR 22的 DNA,用琼脂糖凝胶电泳分离了色氨酸C基因(trpC)的片段,位于凝肢柱的10—11厘米处。冷冻挤压回收该段的DNA,荧电光分光光度计直接测定回收液中DNA的含量。电泳后比电泳前trpC 转化活性提高了37.7倍。这一段DNA的平均分子量为5.1×106,trpC片段的纯度为9.3％。