MPTP/MPP+ 诱导神经元凋亡的机制研究

1982年人们发现1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)能诱发PD,它的有效成分是1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)。目前,MPTP/MPP+广泛的被用作诱导PD实验模型的有效药物,可诱导神经元细胞发生凋亡性死亡。MPTP/MPP+诱导细胞凋亡的机制牵涉Bcl-2、p53、caspase家族、JNK通路、ERK通路和PARP等多种机制,它们共同参与了MPTP/MPP+诱导的细胞凋亡的调控和执行阶段。本文主要综述MPTP/MPP+诱导的神经元细胞凋亡机制。     

MPTP/MPP＋诱导神经元凋亡的机制研究

1982年人们发现1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）能诱发PD,它的有效成分是1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP＋）。目前,MPTP/MPP＋广泛的被用作诱导PD实验模型的有效药物,可诱导神经元细胞发生凋亡性死亡。MPTP/MPP＋诱导细胞凋亡的机制牵涉Bcl-2、p53、caspase家族、JNK通路、ERK通路和PARP等多种机制,它们共同参与了MPTP/MPP＋诱导的细胞凋亡的调控和执行阶段。本文主要综述MPTP/MPP＋诱导的神经元细胞凋亡机制。     

CUL1基因对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活和NLRP3炎症体通路的影响

摘要 目的：探究Cullin1（CUL1）基因对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导的SH-SY5Y细胞存活和核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎症体通路的影响。方法：（1）将SH-SY5Y细胞分为NC组、NC-sh组、CUL1-sh组、NC-OE组和CUL1-OE组。使用Lipofectamine 2000试剂对细胞转染相应的慢病毒。（2）将SH-SY5Y细胞分为Control组、MPP+组和MPP++CUL1-OE组。MPP+组和MPP++CUL1-OE组细胞使用1 mmol/L的MPP+处理48 h,Control组细胞正常培养。通过MTT法检测细胞增殖,通过Annexin V-FITC/PI双染色法和TUNEL染色法检测细胞凋亡,通过qRT-PCR检测CUL1的mRNA水平,通过Western blot检测CUL1、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、cleaved caspase-1、白细胞介素（IL）-1β和IL-18蛋白水平。通过ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平。结果：（1）与NC组和NC-sh组比较,CUL1-sh组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量降低,相对细胞活力降低,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率升高,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平升高（P<0.05）。与NC组和NC-OE组比较,CUL1-OE组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量升高,相对细胞活力升高,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率降低,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平降低（P<0.05）。（2）与Control组比较,MPP+组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量降低,相对细胞活力降低,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率升高,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平升高（P<0.05）。与MPP+组比较,MPP++CUL1-OE组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量升高,相对细胞活力升高,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率降低,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平降低（P<0.05）。结论：CUL1可能通过抑制NLRP3炎症体激活促进MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活。     

α-硫辛酸对6-羟多巴胺诱导的PC12细胞凋亡的影响

实验运用PC12细胞系研究6-羟多巴胺的细胞毒性作用以及α-硫辛酸抗6-羟多巴胺毒性的作用及其机制.用MTT法测定显示6-OHDA使细胞存活率降低至56.8%,细胞突起变短、胞质浓缩、核质深染,细胞贴壁能力下降,胞膜损伤.原位末端dUTP标记法(TUNEL)显示阳性标记细胞,表明6-OHDA引起PC12细胞产生坏死和凋亡.流式细胞仪分析表明6-OHDA作用后凋亡细胞比例达20.09%.运用α-硫辛酸预处理后,能明显预防6-OHDA的毒性作用,可使细胞存活率上升,凋亡细胞比例降低至3.09%,α-硫辛酸的作用与提高细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力和还原型谷胱甘肽(GSH)含量有关.     

二苯乙烯苷通过抑制NF-κB的激活减轻MPP+诱导 的PC12细胞凋亡

目的:探讨2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-o-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystibene-2-o-β-D-glucoside,TSG)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导PC12细胞凋亡的影响及其可能机制。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色试验检测PC12细胞活性;Hoechst33258染色法测定细胞凋亡;Westernblotting检测NF-κB(P65)和IκBα蛋白的表达。结果:MPP+(300μmol/L)作用于PC12细胞24h后,与正常对照组比较,细胞存活率降低(53.3±3.4%)(P<0.01);细胞染色质固缩,细胞核呈致密浓染。TSG(1,5,10μmol/L)预处理24h后,细胞存活率增加(60.8±1.9%),(70.1±1.8%)(P<0.01),(81.2±1.9%)(P<0.01);细胞核凝聚明显减少,且具有量一效关系。另外,MPP+可使PC12细胞核中NF-κB(P65)蛋白表达升高,细胞浆中IκBα蛋白表达降低;与MPP+处理组细胞相比,TSG预处理后,PC12细胞核中高表达的NF-κB(P65)蛋白水平明显降低,细胞浆中低表达的IκBα蛋白水平升高。结论:TSG对MPP+诱导的PC12细胞凋亡具有浓度依赖性的抑制作用,其作用机制可能与抑制NF-κB的激活有关。     

α—硫辛酸对6—羟多巴胺诱导的PC12细胞凋亡的影响

PC12 cell line, a clonal cell line derived from a pheochromocytoma of rat adrenal medulla, was used as a model of dopaminergic neuron in vitro to study the effect of alpha-lipoic acid on the 6-OHDA induced apoptosis. The results from MTT method show that 6-OHDA decreased the cell survival rate obviously. Through TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotion nick end labeling) and Flow cytometer (FCM) detection, we found that 6-OHDA triggered cell apoptosis and induced necrosis. It was confirmed by the different percentage of cell survival rate and apoptosis concluded from FCM and MTT. alpha-lipoic acid was used as antioxidant to protect the cell from 6-OHDA's injury. The result indicateed that alpha-lipoic acid can partly prevent apoptosis induced by 6-OHDA but fail to prevent necrosis since it can decrease the apoptotic cell from 20.09% to 3.09%, just as increased cell survival rate from 56.8% to 72.6% but can not reach the normal level showed by MTT assay. Biochemical approach showed the cell's antioxidant ability especial for SOD activity and GSH content increased after the treatment of alpha-lipoic acid. The data suggest that alpha-lipoic acid may protect PC12 cells from apoptosis induced by 6-OHDA through the antioxidant path.     

基质衍生因子(SDF-1)对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响

目的:研究基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4轴在骨髓间充质干细胞迁徙到受损胰腺中的作用。方法:密度梯度离心、贴壁培养骨髓间充质干细胞,建立STZ诱导糖尿病模型并制备正常和受损胰腺组织提取液,利用Transwell小室体外迁移体系观察不同浓度SDF-1和不同组织提取液对骨髓间充质干细胞的趋化作用,及SDF-1/CXCR4特异抑制剂AMD3100对骨髓间充质干细胞迁移的影响。结果:成功培养了骨髓间充质干细胞并建立了糖尿病大鼠模型。SDF-l对骨髓间充质干细胞有剂量依赖性的趋化作用,造模1周的胰腺组织提取液对骨髓间充质干细胞有明显的趋化作用,而这种作用可部分被SDF-1受体CXCR4的抑制剂AMD3100抑制。结论:受损胰腺组织提取液对骨髓间充质干细胞有明显的趋化作用,SDF-1/CXCR4轴可能在组织提取液趋化骨髓间充质干细胞迁移中起主要的作用。     

工频磁场急性暴露对PC12细胞生长和凋亡的影响

将体外传代培养的PC12细胞,经50 Hz、100μT的工频磁场暴露24 h。采用噻唑蓝比色法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞周期,吖啶橙/溴化乙锭免疫荧光双染色法检测细胞凋亡。结果表明:1)细胞增殖活力于磁场暴露终止后0 h明显下降(P<0.01);4 h未见著变;8 h(P<0.05)和12 h(P<0.01)显著升高。2)磁场暴露终止后0 h,G0/G1期细胞百分比显著增高(P<0.01),S期细胞百分比显著下降(P<0.05);6 h的G2/M期细胞百分比显著增高(P<0.05);12 h的G0/G1期细胞百分比明显下降(P<0.01),S期细胞百分比显著升高(P<0.05);24 h未见著变。3)磁场暴露期间,6 h细胞凋亡率未见显著改变,12、18和24 h凋亡明显增加,至暴露终止后4、8、12和24 h均显著升高,未见恢复。以上结果说明50 Hz、100μT的工频磁场急性暴露,可导致PC12细胞周期和增殖活力的改变,以及细胞凋亡增多。     

BDNF RNA干扰在多巴胺能PC12细胞凋亡中的作用研究

目的：探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）在PC12细胞凋亡中的作用。方法：设计并合成针对BDNF mRNA序列的小片段干扰RNA（siRNA）,利用lipofectamine 2000将siRNA转染入PC12细胞中或给与6-OHDA损伤,给与/不给予BDNF蛋白保护,采用定量PCR和免疫荧光法检测BDNF mRNA和蛋白表达水平;采用上清液乳酸脱氢酶（LDH）释放量测定和流式细胞仪法检测siRNA对细胞凋亡的影响。结果：转染siRNA的细胞的BDNF mRNA的表达量比正常组细胞减少73%,而转染作为对照的scrambled siRNA的细胞的BDNF mRNA的表达没有明显变化。BDNF RNA干扰与6-OHDA神经毒性一样可诱导PC12细胞的LDH释放和细胞凋亡。给予BDNF蛋白保护后细胞毒性减轻。结论：BDNF基因下调可以导致PC12细胞的凋亡,BDNF蛋白对PC12细胞有保护作用,为进一步进行动物体内研究奠定了基础。     

CXCL12过表达促进骨髓基质干细胞整合素αv／β3介导的黏附和增殖

研究利用骨髓基质干细胞移植治疗急性心肌梗死时趋化因子CXCL12过表达对由整合素介导αv/β3的干细胞黏附和增殖过程的影响.采用重组DNA技术使得骨髓基质干细胞过表达趋化因子CXCL12,采用western blot法检测CXCL12过表达后骨髓基质干细胞整合素αv/β3表达量的变化.在体外通过黏附实验观察趋化因子CXCL12过表达对整合素介导的细胞与细胞外基质黏附过程的影响,并在心肌梗死大鼠模型中通过检测报告基因观测CXCL12对移植后整合素介导骨髓基质干细胞增殖的作用.基因重组后骨髓基质干细胞过表达了具有生物活性的趋化因子CXC12,趋化因子CXCL12过表达使骨髓基质干细胞整合素αv/β3表达明显增多,并促进了整合素介导的细胞与细胞外基质黏附.CXCL12还使细胞移植后位于梗死区的细胞数量增多.且这一作用也与整合素αv/β3有关.CXCL12过表达通过促进骨髓基质干细胞整合素αv/β3表达提高了移植干细胞黏附和增殖能力,有利于骨髓基质干细胞移植后在心肌梗死区域的生长和分化.     

骨髓基质细胞的辐射效应及其临床意义

小鼠骨髓基质细胞团在γ线照射后的Do值为2.40Gy,但其成灶能力损伤后持续时间较久。正常骨髓基质细胞能促进骨髓GM-CFU-C的生长;照射10-80Gy后的骨髓基质细胞失去这种促进作用。文中讨论了骨髓基质细胞的辐射效应及其临床意义,提出了谨慎选择放射治疗剂量的必要性。     

骨髓基质干细胞向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞在体外和体内向心肌细胞诱导分化的能力,为下一步的细胞移植治疗心肌梗死提供实验基础.方法体外诱导实验中,将不同浓度的5-氮胞苷作用于不同培养时间的骨髓基质干细胞,摸索5-氮胞苷的最佳诱导时机和浓度,观察诱导后细胞形态变化,并用免疫细胞化学染色检测心肌特异性肌钙蛋白T的表达;在体内实验中,培养扩增的骨髓基质干细胞经BrdU标记后,自体移植于正常心肌内,分别通过BrdU和心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测移植细胞的存活和分化情况.结果体外诱导实验中,5-氮胞苷的诱导作用以10μmol/L的浓度对传代细胞进行两次诱导,效果最好,不仅能诱导出表达心肌特异蛋白的心肌样细胞,而且这些细胞在体外能够自发搏动.体内诱导实验中,移植的细胞在正常心肌微环境中能够存活并分化为心肌细胞.结论骨髓基质干细胞在体外化学诱导和体内心肌微环境诱导时均能分化为心肌细胞,可用于细胞移植治疗心肌梗死的实验.     

培养骨髓基质细胞的尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖-4-表异构酶活性

本实验用液体静置法体外培养小鼠骨髓基质细胞。用细胞化学法观察处于不同分化阶段基质细胞中的尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖－－４－表异构酶（Ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇａｌａｃｔｏｓｅ－４－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ,ＵＤＰＧａｌ,ＥＣ５．１．３．ａ）活性。结果在各类骨髓基质细胞中均可见到很强的酶反应。在由原始网状细胞向成熟星状细胞分化过程中,酶活性逐渐增强。随着培养时间和延长（培养５、７、１０天）,星状细胞和成纤维细胞中酶反应的阳性率和阳性度逐渐增高。这证明在体外培养骨髓基质细胞中由ＵＤＰＧａｌ催化的代谢非常活跃     

脱细胞神经移植物对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探讨脱细胞神经移植物诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞的可行性。方法将分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增,行表型鉴定后,取第5代细胞,诱导组采用脱细胞神经移植物匀浆进行诱导,非诱导组加入等量无血清培养基,倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测诱导后细胞S-100,神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的表达情况。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,免疫细胞化学染色GFAP、S-100的阳性表达率分别为为(42±4)%和(64±5)%。结果 脱细胞神经移植物可诱导骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞。     

小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁层对红系祖细胞生长的影响

本实验以Dexter培养体系作小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁培养。在所获的基质细胞贴壁层上作红系造血祖细胞集落培养,观察两种来源造血基质细胞对红系集落生长的影响。实验结果表明,胎肝造血基质细胞贴壁层能明显促进早期红系造血祖细胞(BFU-E)形成集落,却不明显影响晚期红系造血祖细胞(CFU-E)的生长。成年小鼠骨髓造血基质细胞贴壁层对BFU-E和CFU-E均有刺激生长的作用;但对前者生长的刺激性影响较胎肝造血基质细胞贴壁层为弱。造血基质细胞贴壁层对红系集落生长的促进作用主要是通过体液因子实现的,细胞间短距离调节的影响亦不能除外。     

大鼠骨髓基质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞的提取、分离培养和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为神经元样细胞的可能。方法 通过密度梯度离心和贴壁培养法从成年大鼠骨髓中分离骨髓基质干细胞,进行培养扩增,观察其生长特性;用2-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)对传代细胞诱导分化,并通过免疫细胞化学染色鉴定分化细胞的类型。结果 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落,细胞集落14d时接近融合,传代后,细胞体积变大,约5～7d传代一次。β-ME诱导后,70％以上的细胞在形态上呈神经元样,免疫细胞化学染色呈NSE阳性,GFAP阴性,说明诱导分化的细胞为神经元,而不是星形胶质细胞。结论 骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好,并可连续传代;在β-ME作用下可被诱导分化为神经元样细胞。     

施万细胞条件培养基对大鼠骨髓间质细胞的诱导分化作用

目的　探讨施万细胞条件培养基对大鼠骨髓间质细胞的诱导分化作用。方法　从大鼠骨髓中分离培养间质细胞并传至第 6代 ,诱导前 2 4h加 1μg·L-1碱性成纤维生长因子 (bFGF)入培养液中以促分裂 ,再以施万细胞条件培养基作诱导剂 ,观察细胞形态的变化 ,并采用免疫组织化学法对诱导后一周的细胞进行Map 2及NSE、GFAP表达的检测。结果　诱导后 48小时间质细胞在形态上表现为神经元样 ,神经元样细胞呈Map 2及NSE阳性 ,而GFAP显阴性。结论　施万细胞的上清液能诱导骨髓间质细胞分化为神经元样细胞。     

体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和诱导条件下的成骨能力。方法通过密度梯度离心和贴壁培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、p甘油磷酸纳和维生素c的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化并检测碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。结果原代培养基质干细胞首先形成细胞集落,14d时集落间接近融合;传代细胞体积变大,约5～7d传代一次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,成骨能力肯定,可作为骨组织工程的种子细胞。     

骨髓基质细胞与交联明胶-聚羟基丁酸酯膜的生物相容性研究

目的研究生物材料交联明胶-聚羟基丁酸酯膜与骨髓基质细胞的生物相容性,探讨新型材料在骨组织工程中的应用前景。方法体外培养兔骨髓基质细胞,分别接种于G-PHB(交联明胶-聚羟基丁酸酯)、PHB(聚羟基丁酸酯)和G(交联明胶)材料膜片。采用MTT法检测细胞增殖活性,体视学方法检测细胞粘附能力,荧光双染法检测细胞完整性,扫描电镜观察细胞-材料界面。结果MTT检测发现G-PHB组增殖活性最强,而且表现为最佳的细胞粘附特性,与对照组比较差异有显著性意义。各组细胞完整性分析没有发现显著性差异。扫描电镜观察显示,G-PHB组细胞粘附及铺展良好,优于其他各组。结论交联后的生物降解膜材料G-PHB与BMSCs细胞的体外相容性明显优于单纯膜材料PHB和明胶,在骨组织工程学领域具有良好的研究价值和应用潜力。     

骨髓基质干细胞的诱导分化及其治疗癫痫的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞的方法及脑内移植治疗大鼠癫痫模型的作用。方法无菌条件下分离纯化BMSCs,用bFGF 10ng/ml、RA0.5μmol/L的DMEM/F12诱导72h后,部分用于免疫荧光检测nestin,其余的继续用bFGF 10ng/ml、RA 0.5μmol/L及神经营养因子NT-3 20ng/ml、BDNF 20ng/ml的DMEM/F12诱导4d,检测GAD67。皮下注射匹罗卡品建立癫痫大鼠模型,采用行为学分析筛选模型。通过立体定位仪,用微量注射器将BMSCs来源的神经干细胞和神经营养因子移植入癫痫鼠海马内,观察大鼠行为变化,存活2、4周后,心脏灌注取脑,冰冻切片免疫组化双标检测移植细胞的存活、迁移、分化情况。结果BMSCs诱导72h后,nestin表达阳性,4d后GAD67检测60%阳性。采用匹罗卡品造模,方法简便,但死亡率较高,仅15%-20%的动物造模成功。BMSCs源神经干细胞移植后可在海马内存活,向周围的脑区内迁移和整合。结论BMSCs源的神经干细胞在体外可诱导为γ-氨基丁酸能神经元并且对慢性癫痫有一定的治疗作用。