金针菇细胞色素c过氧化物酶基因（ffccp）及其在菌柄伸长的差异表达初步分析

细胞色素c过氧化物酶（cytochrome C peroxidase,CcP）是细胞内H₂O₂的主要降解酶,参与真菌的氧化应答过程。本研究基于基因组数据获得一个金针菇细胞色素c过氧化物酶编码基因,命名为ffccp。该基因全长1 913bp,包含一个1 098bp的完整开放阅读框,编码365个氨基酸。生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白质（FfCcP）无跨膜结构和信号肽,不形成二硫键结构,亚细胞定位于线粒体上,具备血红素结合蛋白的保守位点。序列比对和进化分析结果显示,金针菇与糙皮侧耳Pleurotus ostreatus等大型真菌的CcP序列高度相似（相似度均超过70%）,属于CcP家族蛋白。RT-qPCR的检测结果显示,氧化胁迫和损伤胁迫均能诱导ffccp基因上调表达,但两种胁迫对ffccp表达的调控机制可能并不相同。进一步检测ffccp在子实体发育过程中的差异表达情况,发现ffccp在伸长期菌柄出现显著上调表达,且表达量与菌柄伸长速度的相关性达到0.998,为极强正相关。推测ffccp的上调表达可能有利于菌柄的伸长。     

与草菇原基形成相关的过氧化物酶基因VvDyP的结构与表达分析

DyP-type过氧化物酶作为氧化物酶家族中的一员,参与了菌体氧化应激调节反应以及基质降解等过程。本研究从草菇基因组中获得一个DyP-type 过氧化物酶的编码基因,将其命名为VvDyP。对该基因进行结构分析,结果显示草菇的DyP-type 过氧化物酶编码基因全长为 2 333bp,含有8个外显子,7个内含子;开放阅读框长为1 485bp,编码494个氨基酸。通过系统发育分析发现它与灰盖鬼伞以及糙皮侧耳DyP蛋白同源性最高;分析DyP-type 过氧化物酶编码基因在草菇各个时期的表达谱情况并进行荧光定量PCR实验验证发现,草菇的DyP-type过氧化物酶编码基因只在原基中高表达,推测DyP-type过氧化物酶编码基因可以清除过量的活性氧自由基以保证原基的正常形成。     

菠萝ACC氧化酶基因AcACO1的克隆与表达分析

乙烯是重要的植物激素,在植物生长发育和胁迫响应中具有重要的调节功能。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)是植物乙烯生物合成途径中的一个关键酶。根据转录组数据,从菠萝中成功克隆到1个编码ACO的基因Ac ACO1,测序结果证实该基因全长1 094 bp,包含一个957 bp的开放阅读框,编码318个氨基酸。AcACO1蛋白具有典型的植物ACO结构特征,含有DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy两个保守结构域。1 850 bp的AcACO1启动子区域含有众多应答激素和环境胁迫信号元件。实时荧光定量分析结果表明,乙烯利、低温和赤霉素均能诱导AcACO1的表达。     

金针菇外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因鉴定及在不同发育时期的差异表达

金针菇具有很高的营养与保健价值,菌柄长短决定金针菇的产量与品质,而菌柄伸长的相关作用酶及分子机理尚不清楚。前期草菇中发现外切-β-1,3-葡聚糖酶基因（exg2）可能与菌柄伸长相关,但在金针菇中尚没有exg基因的相关报道。本研究首先在金针菇全基因组中鉴定到3个外切-β-1,3-葡聚糖酶家族基因（分别命名为：Ffexg1、Ffexg2、Ffexg3）,并进行了克隆验证。进一步采用定量PCR对3个基因在金针菇不同发育时期及组织部位的差异性表达进行了分析。结果显示：Ffexg1只在菌柄中高表达,Ffexg2与Ffexg3在菌柄中表达量先上升后下降,在菌盖中呈逐渐上升趋势。3个Ffexg基因均在菌柄发生伸长的部位表达量较高,且在菇体水平放置后菌柄弯曲程度较大的部位表达量较高。结果显示金针菇exg家族3个基因存在时空差异性表达,在菌柄中伸长较快的时期及部位伴随着Ffexg基因的高表达。结合其功能预测,Ffexg家族基因可能作用于细胞壁成分β-1,3-葡聚糖链,从而在金针菇菌柄及菌盖发育中起作用。     

小白菜BcUBCE2基因的克隆及表达分析

采用cDNA-AFLP和RACE技术从小白菜中克隆得到泛素结合酶E2基因(ubiquitin conjugating enzyme E2),命名为BcUBCE2。序列分析表明,BcUBCE2基因cDNA全长830bp,包含1个456bp的开放阅读框,编码152个氨基酸。结构分析发现,该序列包含一个泛素结合酶E2活性位点和一个高度保守的半胱氨酸。进化分析显示,小白菜BcUBCE2蛋白同拟南芥E2蛋白的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,BcUBCE2基因在小白菜根、茎、叶中均有表达,铜处理10d时BcUBCE2基因的表达量最高。研究认为,BcUBCE2基因可能在铜胁迫响应中发挥重要作用。     

棉花PTS2受体基因(GhPex7)的克隆及表达分析

利用cDNA—AFLP差异片段F010,通过RACE延伸、EST、检索等方法获得了一个棉花过氧化物酶体定位信号2受体蛋白基因(peroxisomal targetingsignal type 2 receptor,GhPex7p)的编码序列。该cDNA包含一个954bp的开放阅读框,编码317个氨基酸,推测其等电点为5．603。同源性分析表明：推测GhPex7与拟南芥、酵母、果蝇、小鼠和人的Pex7p基因存在序列相似性,其中与拟南芥的同源性最高,为83％,并具有3段WD-40蛋白家族的保守域,与拟南芥AtPex7的编码蛋白同类。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在两个拷贝。Northern blotting和RT-PCR分析表明该基因在棉花根、茎、叶、花、胚珠和纤维中均表达,但茎、叶组织中的表达水平明显高于胚珠和纤维。     

烟粉虱MEAM1隐种磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆与表达分析

【目的】本研究旨在从烟粉虱Bemisia tabaci中东-小亚细亚1隐种(Middle East-Asia Minor 1, MEAM1)中克隆磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, PHGPX)基因,鉴定其在烟粉虱不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的表达情况,明确其在烟粉虱应对外界环境压力中的功能。【方法】利用3′RACE克隆和测定烟粉虱MEAM1隐种内PHGPX基因的cDNA全长序列,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用定量RT-PCR技术对该基因在烟粉虱MEAM1隐种不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的表达量进行分析。【结果】获得了烟粉虱MEAM1隐种两个磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,分别命名为BtB-PHGPX1(GenBank登录号:KY312116)和BtB-PHGPX2(GenBank登录号:KY312117)。序列分析表明,BtB-PHGPX1基因开放阅读框全长732 bp,编码243个氨基酸;BtB-PHGPX2基因开放阅读框全长567 bp,编码188个氨基酸。序列比对结果表明两基因的编码蛋白内均具有谷胱甘肽过氧化物酶保守的半胱氨酸、谷氨酰胺和色氨酸残基位点。BtB-PHGPX1在烟粉虱MEAM1隐种卵内表达量显著高于其在若虫、伪蛹、雌成虫和雄成虫内的表达量,BtB-PHGPX2在烟粉虱MEAM1隐种卵内的表达量显著低于其在若虫、伪蛹和雌成虫内的表达量(P<0.05)。BtB-PHGPX1和BtB-PHGPX2在雌成虫内的表达量均显著高于雄成虫内。吡虫啉处理雌成虫2 h时两基因的表达量均较对照显著提高(P<0.05),处理后5, 10和24 h时其表达量均较对照显著下降(P<0.01)。【结论】本研究克隆了烟粉虱MEAM1隐种两个PHGPX基因的序列全长,明确了其在不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的差异表达,推测PHGPX在烟粉虱抵御环境压力及杀虫剂胁迫时可能发挥着重要的防御作用。     

茶树CsNCED2基因的克隆和表达分析

该研究以铁观音茶树品种叶片为材料,通过RT-PCR技术,克隆了茶树脱落酸(ABA)合成途径关键限速酶——9-顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因的全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 931bp,包含1 821bp完整开放阅读框,共编码606个氨基酸残基。NCBI同源分析结果表明,与葡萄VvNCED2相似性最高(78%),命名为CsNCED2(NCBI登录号:MF765770)。氨基酸序列分析显示,其具有NCED家族的FLNO2258保守结构域,以及MIAHPKxDP和HDFAITE保守结构域序列;在保守区存在4个Fe2+活性组氨酸结合位点,N-端含有叶绿体转运肽。实时荧光定量PCR分析表明,CsNCED2基因在铁观音叶、茎和花中表达量较高;白茶萎凋和乌龙茶做青均可以诱导CsNCED2基因显著上调表达;除干旱胁迫抑制CsNCED2表达外,ABA和低温胁迫均能够诱导CsNCED2基因显著上调表达。表明CsNCED2基因在茶树ABA合成代谢以及胁迫响应中发挥重要作用。     

细叶百合LpPEX7基因克隆及盐胁迫下的表达特性分析

从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因（LpPEX7）,该基因ORF全长957 bp,编码318个氨基酸。LpPEX7蛋白序列包含6个WD40保守结构域,通过同源蛋白序列比对和进化树分析,发现LpPEX7与其他植物的PEX7蛋白具有较高的同源性。LpPEX7基因在细叶百合种子,叶片和鳞茎中的表达量比较高,在根和花中表达量比较低,在H₂O₂,NaCl,NaHCO₃不同逆境处理条件下,LpPEX7基因的表达量都发生了改变。在盐碱和氧化胁迫处理下,LpPEX7过表达拟南芥株系种子的萌发要早于野生型种子的萌发,这些研究结果表明LpPEX7基因与盐碱、氧化逆境有一定的应答关系,为细叶百合的耐盐碱性分子机理研究提供一个非常重要的候选基因。     

蝴蝶兰几丁质酶基因的克隆及表达特性分析

利用RT-PCR及RACE技术,克隆到蝴蝶兰1个几丁质酶基因PhCHT(GenBank登录号为KT992851),该基因cDNA全长1 210bp,包含37bp的5′-UTR、933bp开放阅读框和240bp 3′-UTR,编码310个氨基酸;该蛋白为糖苷水解酶第19家族成员,兼具有溶菌酶活性;生物信息学分析显示,该蛋白具N-端信号肽和跨膜结构,为胞外分泌蛋白;该蛋白与海枣、谷子、油棕和拟南芥的几丁质酶类似蛋白相近,并且在系统进化树上与甘蔗和陆地棉的Ⅶ类几丁质酶同属一个分支。PhCHT基因的表达分析表明,PhCHT在蝴蝶兰营养器官和生殖器官中均有表达,根中表达量最高;13℃/8℃低温处理3、6、9和15d时该基因的表达被抑制,4℃低温处理1、2和4h表达量升高。研究表明,PhCHT基因能够响应短期的冷胁迫。研究结果为进一步研究蝴蝶兰几丁质酶的系统进化及抗性育种奠定了基础。     

苎麻抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆和表达分析

本研究根据苎麻转录组测序结果中的抗坏血酸过氧化物酶（APX）的基因片段,利用RT-PCR结合RACE方法从苎麻（Boehmeria nivea L.）中克隆到一个APX基因的全长cDNA,命名为BnAPX1。BnAPX1 cDNA全长1 201 bp,开放阅读框(ORF)为870 bp,推测其编码一个含289个氨基酸序列的多肽。生物信息学分析表明,BnAPX1属于植物过氧化物酶超家族成员,与其他物种过氧化物酶体APX相似性较高,C端具1个跨膜区。荧光定量PCR结果表明,BnAPX1在苎麻的根、茎中段、茎尖、茎皮、幼叶各部位均有表达,其中幼叶表达量最高,且该基因BnAPX1受重金属镉诱导上调表达,可能在重金属镉胁迫防御中起重要作用。     

黄河裸裂尻鱼细胞色素C氧化酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基基因的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR技术克隆获得了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)CO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的编码序列,并对此进行了初步分析.结果表明,黄河裸裂尻鱼CO I基因全长为1 551 bp,开放阅读框(ORF)由基因全长组成,编码516个氨基酸;COⅡ基因全长为691 bp,开放阅读框为690 bp,编码2...     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

一个新的茶树黄酮醇合酶基因的克隆和表达分析

Cs—COR113（GenBank登录号：FE942098）为一受冷诱导的茶树黄酮醇合酶基因的cDNA片段,采用RACE技术克隆了这一基因的全长cDNA,命名为CsFLS（GenBank登录号：FJ577509）。CsFLScDNA序列全长为1303bp,5＇-UTR和3’-UTR分别长91bp和175bp,包含一个编码336个氨基酸的完整开放阅读框。序列分析显示,CsFLS与烟草、矮牵牛、欧芹、拟南芥的黄酮醇合酶的同源性分别为74％、75％、75％和63％,含有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族2个保守的基序,以及与黄酮醇合酶正确折叠有关的2个保守的甘氨酸残基。CsFLS的表达受低温诱导,但不受ABA诱导。     

小麦TaLEC1基因的克隆及其表达特性分析

为了探讨LEC1基因在小麦(Triticum aestivum L)非生物胁迫应答中的功能,该研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆小麦TaLEC1基因,并采用qRT-PCR方法分析了该基因在小麦不同组织以及不同处理下的表达模式,为深入研究小麦LEC1基因在干旱、高温和高盐胁迫下的响应机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆到小麦TaLEC1基因,该基因cDNA序列全长为1 074 bp,其中5′端非编码区23 bp,开放阅读框为741 bp,3′端非编码区310 bp,编码246个氨基酸,具有典型的CBFD_NFYB结构域。(2)实时荧光定量分析显示,TaLEC1在不同组织间表达差异显著,10 d龄幼苗的叶中表达量最高。(3)TaLEC1基因可被植物激素ABA诱导而上调表达,属于ABA依赖型的表达调控通路。(4)PEG模拟干旱胁迫处理后的0.5～1 h,TaLEC1基因呈上调表达;42℃胁迫处理过程中,TaLEC1基因呈稳定上调表达趋势,并在胁迫处理后12 h和48 h时表达急剧上调,分别为对照的52.8倍和34.5倍;NaCl胁迫处理0.5 h时TaLEC1基因迅速上调表达。研究表明,小麦TaLEC1基因参与ABA依赖的胁迫响应,推测可能在小麦耐受高温胁迫和渗透胁迫过程中发挥着重要的脱水保护功能。     

小麦PAL基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析

利用苯丙氨酸解氨酶(PAL,phenylalanine ammonia-lyase)基因保守区域从小麦抗赤霉病材料苏麦3号中克隆获得4个PAL基因,分别命名为Ta PAL1、Ta PAL2、Ta PAL3、Ta PAL4。4个基因的开放阅读框(ORF,open reading frame)长度分别为2142 bp、2016 bp、2118 bp和2139 bp,分别编码714个、672个、706个和713个氨基酸。基因序列比对发现其相似性达到88.35%,所编码的氨基酸相似性为91.92%,氨基酸序列分析表明4个基因都包含HAL-PAL结构域及PAL结构域。通过接种禾谷镰刀菌,利用荧光定量PCR对PAL基因进行表达分析发现,4个PAL基因全部为上调表达,其中Ta PAL2、Ta PAL3和Ta PAL4最为明显。PAL基因的上调表达,说明PAL基因在小麦抵抗赤霉病菌侵染的机制中可能起着重要作用。     

盐芥ThDREB2B基因克隆及功能分析

利用RACE技术从抗逆模式植物盐芥中克隆获得了1个DREB(dehydration responsive element binding)类转录因子基因,命名为ThDREB2B(NCBI登录号EF653377)。结果表明:(1)ThDREB2B基因cDNA全长1 486bp,包含1个954bp的开放阅读框,编码316个氨基酸;推测编码的蛋白质分子量约36.0kD,等电点为4.81,第76～135位氨基酸构成1个AP2结构域。(2)系统进化分析表明,ThDREB2B属于DREB亚家族的A-2亚组,与拟南芥AtDREB2B基因遗传距离最近。(3)半定量RT-PCR检测显示,ThDREB2B基因在正常生长条件下低丰度表达,在低温、干旱或高盐胁迫下上调表达。(4)酵母单杂交结果表明,ThDREB2B蛋白能与DRE元件特异结合,但转录激活能力弱。推测ThDREB2B蛋白可能需要翻译后修饰以获得转录激活功能。     

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

桔青霉木聚糖酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达及活性分析

通过同源序列PCR克隆的方法,获得桔青霉(Penicillium citrinum)CR-2菌株的木聚糖酶编码基因xyl,该基因全长984 bp,编码327个氨基酸,无内含子序列,具有完整开放阅读框。其编码的氨基酸序列N端具有一段包含19个氨基酸的信号肽序列,并具有糖基水解酶第10家族(GH10)的保守催化域特征,推测该酶属于第10家族成员。将该基因与毕赤酵母表达载体pPIC9相连接构建重组载体pPIC9-XYL,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中。挑选阳性重组子经测序、酶活性以及SDS电泳分析表明,xyl基因成功在毕赤酵母中分泌表达,重组酶活性可达214.15 IU/mL。该重组酶最适温度与最适pH分别为50℃和4.5,且具有良好的pH和热稳定性。     

新疆盐穗木GRAS转录因子基因克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从藜科盐穗木属盐生植物盐穗木中分离得到了一个盐胁迫响应的表达序列标签(EST)片段,结合SMARTTMRACE技术获得了盐穗木GRAS转录因子基因的cDNA。序列分析表明,该基因全长2 090bp,含有1 635bp的阅读框,294bp的5′-UTR和161bp的3′-UTR,编码544个氨基酸,分子质量为61.503kD,理论等电点为6.1。系统进化树和Blast同源序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GRAS家族特有的C端保守结构域,并与葡萄GRAS家族蛋白VvSCL13聚集在一起,故将该基因命名为HcSCL13(GenBank登录号KC68640)。实时荧光定量qRT-PCR分析表明,HcSCL13基因在盐胁迫后表达呈明显上调,初步推测Hc-SCL13基因可能与盐穗木的耐盐性相关。